一種重組TaqDNA聚合酶及其制備方法

一種重組Taq DNA聚合酶及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程【技術領域】，具體是一種制備水生棲熱菌（Thermusaquaticus)TaqDNA聚合酶基因重組表達酶的方法。該基因核苷酸序列及編碼蛋白質的氨基酸序列分別為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本發明通過基因克隆技術克隆出基因序列，構建原核表達載體，利用已構建的TaqDNA聚合酶基因的重組菌株，利用LB培養液進行懸浮，37℃培養4.5小時后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導16-20小時，離心收集菌體后使用2-4mg/ml溶菌酶解離得到蛋白液，通過層析柱和透析袋過濾，得到高純度活性蛋白TaqDNA聚合酶。與現有技術相比，本發明生產工藝穩定性好，得到的TaqDNA聚合酶活力高，可有效地保證產品產量和純度，用于基因PCR擴增效果良好。
【專利說明】—種重組Taq DNA聚合酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體涉及一種制備重組Taq DNA聚合酶的方法。【背景技術】
[0002]1985年,美國Cetus公司發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction, PCR)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的方法，即雙鏈DNA在高溫下變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶、dNTP、特異引物的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。 [0003]原始菌YT-1 (Thermus aquatjcus)具有天然DNA聚合酶，但其Taq DNA聚合酶含量低，從其培養物純化酶需要進行選擇性沉淀和離子交換色譜分離，難以滿足對Taq DNA聚合酶的需求。因此，市售的Taq DNA聚合酶大都是基因工程產品，可有效地提高其產率和分離效率。
[0004]雖然Taq DNA聚合酶己經商品化生產多年，但為了提高該蛋白在大腸桿菌中的表達量，簡化純化工藝的嘗試一直沒有停止。Pluthme Fred利用Taq DNA聚合酶的熱穩定性，提出凍融法去除雜蛋白等大分子，所制備的酶可用于PCR和測序反應；孫亮先等利用該酶的熱穩定性，經兩輪_70°C深度冷凍和75°C水浴，使細菌裂解釋放內容物，高速離心除去凍融變性的細胞碎片及核酸蛋白的復合物以達到快速純化Taq DNA聚合酶的目的，PCR擴增反應表明所制備的Taq DNA聚合酶的活力、敏感性、特異性均達到試驗要求。包永明等在用IPTG誘導目的蛋白表達后，采用聚乙烯亞胺沉淀Taq DNA聚合酶，離子交換柱Bio-Rex-70分離純化，完成Taq DNA聚合酶基因的超表達；趙美蓉等將含有Taq DNA聚合酶基因的E.coli經發酵，細胞培養液經破壁裂解，粗蛋白抽提經Sephaeryl-s-100,CM-Sephadex C50柱層析等純化步驟，獲得了重組Taq DNA聚合酶；汪靖超等利用熱變性、親和層析、陽離子交換層析獲得了電泳純的重組Taq DNA聚合酶；何鋼等嘗試對TaqDNA聚合酶的制備技術進行整體優化，以插入重組Taq DNA聚合酶基因的Pet_24a表達質粒轉化大腸桿菌菌株，以2mmol/L的IPTG誘導8小時，可獲得較高的Taq DNA聚合酶表達效率。

【發明內容】

[0005]針對目前現有技術中存在的技術問題，本發明提供一種重組Taq DNA聚合酶及其制備方法，該制備方法可以得到高純度Taq DNA聚合酶。利用本發明建立的方法，可從500ml菌液中純化到約3.5ml Taq DNA聚合酶液，酶活達到16.1Mful0
[0006]本發明的一個目的是提供一種重組Taq DNA聚合酶，其蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0007]本發明的另一個目的是提供一種編碼所述Taq DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0008]本發明的另一個目的是提供一種制備重組Taq DNA聚合酶的方法，具體步驟如下:
(1)克隆SEQID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)將步驟(1)所得的核苷酸片段和質粒pET32a進行連接，構建重組質粒pET32a_Taq ；
(3)將重組質粒pET32a_Taq轉化入大腸桿菌感受態細胞疋coliBL21中，獲得表達菌
株;
(4)表達菌株利用LB培養液進行懸浮培養，37°C培養4.5小時后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導16-20小時后；解離菌體，過濾；獲得所述重組Taq DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]步驟(1)中,所述核苷酸序列是從水生棲熱菌中分離出來的Taq DNA聚合酶基因，所述基因編碼蛋白可用于制備重組Taq DNA聚合酶。所述基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示，所述基因編碼的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]進一步地，在步驟(4)中，所述解離菌體為采用溶菌酶解離菌體；所述過濾為以層析柱和透析袋連續過濾。
[0011]在本發明更進一步的實施方案中，所述溶菌酶的濃度為4mg/ml ;所述層析柱為Bio-Rex 70的離子交換柱樹脂；
本發明是在已構建的重組Taq DNA聚合酶基因表達載體的基礎上，進行表達體系的優化，提高其Taq DNA聚合酶表達和純化效率，以獲得穩定、高活力的Taq DNA聚合酶。本發明通過基因克隆的方法，從水生棲熱菌中克隆到了一個Taq DNA聚合酶基因。通過制備重組Taq DNA聚合酶的方法，重組菌株誘導表達制備出高活力Taq DNA聚合酶，酶活達到16.1Mful0
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發明純化的Taq DNA聚合酶蛋白質電泳圖(1-10為收集的Taq DNA聚合酶；11為市售Taq DNA聚合酶，作為陽性對照；M為標準蛋白質分子量)。
[0013]圖2為本發明制備的Taq DNA聚合酶進行PCR檢測酶活性電泳圖(1_4泳道為本發明的提取制備的Taq DNA聚合酶對模板DNA的PCR反應，分別稀釋40倍，30倍，20倍，10倍；5-7泳道為市售Taq DNA聚合酶(5U/ul)對模板DNA的PCR反應，分別稀釋8倍，7倍，6倍，5倍；M為標準DNA分子量)。
[0014]圖3為本發明制備的Taq DNA聚合酶和商售Taq DNA聚合酶進行PCR檢測比較酶活性電泳圖(1-4泳道為商售Taq DNA聚合酶不同批次對模板DNA的PCR反應；5_8泳道為本發明提取制備的不同批次Taq DNA聚合酶對模板DNA的PCR反應；M為標準DNA分子量)。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆實驗指南(Sambrook J, et al.2008.Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3rd Ed.)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0016]實施例1:基因全長編碼區的克隆與分析采用市售的細菌基因組DNA提取試劑盒法提取水生棲熱菌(Thermusaquaticus)總DNA，采用Touchdown PCR技術和普通PCR技術進行Taq DNA聚合酶基因的全長序列擴增，擴增引物包括 2 組(5，-tatatgagggggatgctgccc-3，和 5，-tcactccttggcggagagc-3，)。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在紫外燈下切割含有目的條帶的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，于_20°C保存。回收的目的片段，于16°C金屬浴過夜連接至克隆載體PMD19-T (寶生物工程有限公司，TaKaRa)，并轉化到大腸桿菌感受態細胞萬.ToplO (北京天根生化科技有限公司)中，涂布于含有lOOmg/mL Amp的LB固體培養基上，37°C過夜培養，經過IPTG/X-gal藍白斑篩選后，挑取4_10個陽性克隆進行測序。將測序結果通過序列比對，分離到了一個Taq DNA聚合酶基因。Taq DNA聚合酶基因序列全長為2499bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼832個氨基酸，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。Taq DNA聚合酶基因PCR回收產物和pET32a質粒(寶生物工程有限公司，TaKaRa)進行EcoRI和NotI雙酶切，在37°C金屬浴3_4h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將目的片段Taq DNA聚合酶基因和質粒pET32a進行連接，16°C過夜，構建好的重組質粒命名為pET32a_Taq。轉化入大腸桿菌感受態細胞疋coliBL21 (北京天根生化科技有限公司)中，獲得表達菌株，命名為Taq DNA聚合酶菌株。
[0017]實施例2:重組Taq DNA聚合酶菌株的培養及誘導
配制LB液體搖瓶(500 ml的LB液體培養基，分裝在2個500 ml的三角瓶中，即每瓶裝250 ml，滅菌后待用)。取出Taq DNA聚合酶 菌種，接種在4 ml的LB + Amp (100 Ug/ml)液體培養基中，37°C培養16-20小時。每個三角瓶裝250 ml的LB液體培養基，加入Amp (抗生素的終濃度為100 yg/ml)，并用1.25 ml的培養的菌種接種；37°C培養4.5小時。
[0018]加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導，在37°C繼續培養16-20小時。
[0019]實施例3:重組Taq DNA聚合酶純化器具準備
層析柱選用Bio-Rex 70的離子交換柱樹脂(干粉的大小是mesh size 100-200。溶脹后的結合能力為5-10 mg蛋白質/ml)。稱取7g的Bio-Rex 70的干樹脂,放在小燒杯中，用dd H20洗，去掉漂浮的小顆粒，室溫溶脹2小時，期間換幾次dd H2O;用含50 mM KCl的溶液C預平衡，待用；用含50 mM KCl的溶液C平衡好的樹脂。裝好樹脂后再用6_10倍柱床體積的含50 mM KCl的溶液C平衡柱子。檢查進入柱子和流出柱子的溶液C的pH值不變。
[0020]實施例4:蛋白質提取
4°C,4000 rpm，離心20分鐘收集菌體；重懸在30 ml的溶液A中，沖洗收集的菌體；4°C,8000 rpm，離心10分鐘收集菌體；重懸在20 ml溶液A中，混勻。加入80 mg的溶菌酶，使終濃度達到4 mg/ml ;在室溫(25°C)下保持15分鐘；加入20 ml的溶液B，75°C水浴保溫I小時，期間晃動幾次；4°C，10000 rpm,離心20分鐘，棄沉淀，收集收集上清液；磁力攪拌器攪拌，在上清液中逐滴加入5% PEI，使終濃度達到0.15% (體積);室溫下(25°C)繼續攪拌10分鐘；4°C，10000 rpm，離心15分鐘，收集沉淀；用12 ml的含25 mM KCl的溶液C重懸，并洗滌沉淀；4°C，8000 rpm，離心15分鐘，收集沉淀；用12 ml的含25 mM KCl的溶液C重懸，并洗滌沉淀；4°C，5000 rpm,離心10分鐘，收集上清液，測量收集上清液的體積；加入2倍體積的不含KCl的溶液C，使收集上清液的最終KCl的濃度達到50mM。
[0021]實施例5:蛋白質純化及檢測將上清液裝在平衡好的層析柱上；層析柱平衡使用6倍體積(約60 ml)以上的含50 mMKCl的溶液C，再次平衡；樣品用含200 mM KCl的溶液C洗脫，一般準備50ml洗脫液。
[0022]將收集的每個部分在SDS-PAGE上電泳，用市售的Taq DNA聚合酶做對照(詳見圖
1)，進行蛋白質大小和純度檢測；電泳較亮的泳道表示Taq DNA聚合酶高含量，將這些部分(3，4，5，6)收集在一起；放在透析袋中使用500 ml溶液D透析，4°C，20小時左右，期間換一次透析液；最后收集得到高純度Taq DNA聚合酶，經檢測所得高純度Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023]實施例6:Taq DNA聚合酶功能的PCR驗證及瓊脂糖電泳檢測 以質粒PBI121作為PCR反應的DNA模板，以Kana標簽引物作為PCR引物。
[0024]PCR反應體系總體積為25W，其中:10XPCR緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 9.0 ；500 mmol/L KCl ；20 mmol/L MgCl2,0.1% 明膠，1% Triton X-100) 2.5 Pl，dNTPMixture (各2.5 mM)4ul，引物1.0 uM, Taq DNA聚合酶包括實施例5制備的Taq DNA聚合酶和市售的Taq DNA聚合酶，(制備的Taq DNA聚合酶分別稀釋40倍，30倍，20倍，10倍；市售的Taq DNA聚合酶分別稀釋8倍，7倍，6倍，5倍);DNA模板I W (20 ng);加滅菌雙蒸水至25 W。應用ABI 9700 PCR儀進行PCR反應，反應程序如下:首先94 V預變性5min，之后進行30個循環，每個循環包括94 V變性30s、退火溫度(退火溫度視引物而定)30s、72°C延伸 I min，最后 72°C延伸 IOmin0
[0025]PCR產物在1%瓊脂糖凝膠，I X TAE緩沖液中進行電泳；DNA標記為DL2000。電壓90 V，時間40 min;凝膠成像系統進行觀察拍照，結果如圖2所示。將獲得的PCR成像結果使用SensiAnsysl.0.3分析軟件進行PCR產物定量統計，獲得的統計數據結果如表1所示。根據統計數據計算出自制的Taq DNA聚合酶液的酶活達到16.7U/ul。
[0026]表1本發明制備的Taq` DNA聚合酶進行PCR檢測獲得的PCR產物片段定量統計數據(樣品1-8對應圖2中1-8泳道產物)
【權利要求】
1.一種重組Taq DNA聚合酶，其特征在于，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一種編碼權利要求1所述的重組Taq DNA聚合酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
3.一種制備權利要求1所述的重組Taq DNA聚合酶的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)克隆SEQID NO:1所示的核苷酸序列； (2)將步驟(1)所得的核苷酸片段和質粒pET32a進行連接，構建重組質粒pET32a_Taq ；(3)將重組質粒pET32a_Taq轉化入大腸桿菌感受態細胞疋coliBL21中，獲得表達菌株; (4)表達菌株利用LB培養液進行懸浮培養，37°C培養4.5小時后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導16-20小時后；解離菌體，過濾；獲得所述重組Taq DNA聚合酶。
4.根據權利要求3所述的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述解離菌體為采用溶菌酶解離菌體。
5.根據權利要求3所述的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述過濾為以層析柱和透析袋連續過濾。
6.根據權利要求4所述`的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述溶菌酶的濃度為4mg/ml。
7.根據權利要求5所述的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述層析柱為Bio-Rex 70的離子交換柱樹脂。
【文檔編號】C12R1/01GK103602643SQ201310576003
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年11月18日
【發明者】劉濤, 馬秀芬 申請人:青島思能基因生物技術有限公司