G蛋白偶聯受體融合表達蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于：來源于真核生物，其中，所述G蛋白偶聯受體融合表達蛋白選自APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白；或RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白；或DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白。本發明涉及的G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，通過把這些融合表達蛋白與G蛋白偶聯受體進行融合表達從而達到增加G蛋白偶聯受體表達產率及G蛋白偶聯受體的體外穩定性，本發明所涉及的G蛋白偶聯受體融合表達蛋白可廣泛應用于G蛋白偶聯受體的研究。
【專利說明】G蛋白偶聯受體融合表達蛋白
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體地是涉及G蛋白偶聯受體融合表達蛋白。
【背景技術】
[0002]G蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptor, GPCR)是一大類膜蛋白受體的統稱，這類受體的共同點是每個受體結構都包含七個α螺旋組成的跨膜結構域，這些結構域將受體分割為膜外N端(N-terminus),膜內C端(C-terminus), 3個膜外環(Loop)和3個膜內環，受體的膜外部分常有糖基化修飾位點，其肽鏈的C端和連接第5和第6個跨膜螺旋的胞內環上共同構成G蛋白(鳥苷酸結合蛋白)的結合位點，目前已經發現的G蛋白偶聯受體已超過800個，這些G蛋白偶聯受體可以被劃分為六個類型，分別為.Λ類(或第一類)
(視紫紅質樣受體)；B類(或第二類)(分泌素受體家族)；C類(或第三類)(代謝型谷氨酸受體)；D類(或第四類)(真菌交配信息素受體)；E類(或第五類)(環腺苷酸受體)；F類(或第六類)(Frizzled/Smoothened 家族)[Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.63 (6):1256-1272，2003;and Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.67(5):1414-1425，2005]。分屬其中的G蛋白偶聯受體的基因序列之間沒有同源關系。
[0003]不同的G蛋白偶聯受體通過和相應的G蛋白(G protein)偶聯可以對細胞外的多種刺激信號作出反應，在細胞內產生神經傳遞、味覺、嗅覺、視覺及細胞的新陳代謝、分化、增殖、分泌等一 系列生理效應。
[0004]與G蛋白偶聯受體相關的疾病為數眾多，并且大約40%的現代藥物都以G蛋白偶聯受體作為Μ，上千種已上市藥物中接近一半是針對G蛋白偶聯受體靶標，作用于G蛋白偶聯受體的藥物對疼痛、認知障礙、高血壓、胃潰瘍、鼻炎、哮喘等各類疾病均有良好的治療作用。
[0005]由于G蛋白偶聯受體在體內具有重要的生理功能，對G蛋白偶聯受體的結構和功能研究一直是一個很重要的研究熱點。
[0006]然而，天然的G蛋白偶聯受體在體外并不穩定，很難得到高純度的穩定的天然G蛋白偶聯受體，近年來，有多個研究小組報道了不同的方法用于解決G蛋白偶聯受體的穩定性，包括①.在G蛋白偶聯受體的膜內環區3(ICL3)和N-末端插入大腸桿菌T4溶菌酶，這種技術先后成功應用于腺苷A2a受體，CXCR4受體，b2腎上腺素能受體，D3多巴胺受體，SlPl受體等多個受體的研究中，通過用T4溶菌酶改造后，這些受體都能夠被很好地表達，得到了較高產率的蛋白，并最終得到了高分辨率的晶體結構[Rasmussen，S.G.F.et.al.Crystal structure of the human beta2adrenergic G-protein-coupled receptor, Nature450:383-387, 2007;Wu B.et.al.Structures of the CXCR4chemokine GPCRwith small-molecule and cyclic peptide antagonists Science330:1066—1071，2010.ChienjE.Y.et.al.Structure of the human dopamine D3receptor in complex witha D2/D3selective antagonist,Science330:1091-1095，2010.XujF et.al.Structureof an agonist-bound human A2A adenosine receptor，Science332:322-327，201Land Hanson, M.A.et.al.Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptorScience335:851-855, 2012.ZoujY.et.al.N-terminal T41ysozyme fusion facilitatescrystallization of a G protein coupled receptor Plos One7:e46039_e460392012]；②.在G蛋白偶聯受體的膜內環區3(ICL3)或N-末端插入細菌BriL蛋白，這種技術在腺苷A2a受體，nociceptin/orphanin FQ受體，5HTlb, 5HT2b和SMO受體的結晶研究中獲得了成功[Liu, W.et.al.Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodiumions, Science337:232-236, 2012.Thompson, A.A.et.al.Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic Nature485:395-399, 2012.Wang, C.et.al.Structural Basis for Molecular Recognition at Serotonin ReceptorsScience2013.Wang, C.Structure of the human smoothened7TM receptor in complexwith an anti tumor agent Nature2013] !③.通過對G蛋白偶聯受體進行突變篩選，找到不影響結構和功能但又能增加穩定性的一些突變，從而在表達過程中得到穩定的G蛋白偶聯受體，這個方法在腺苷A2a受體，bl腎上腺素能受體的研究中均獲得了成功，實現了受體蛋白的高表達，拿到了高純度的受體蛋白，并最終獲得了受體蛋白的高分辨率晶體結構[Lebon, G.et.al.Agonist-bound adenosine A2A receptor structures revealcommon features of GPCR activation.Nature474:521, 2011.ffarne, A.et.al.Structureof a betal-adrenergic G-prote in-coup led receptor Nature454:486, 2008.]。④.利用抗體穩定G蛋白偶 聯受體構象，利用這個技術斯坦福大學的Brain實驗室成功得到了 b2腎上腺素能受體的高分辨晶體結構[Bokoch, Μ.P.Ligand-specific regulation of theextracellular surface of a G-protein-coupled receptor Nature463:108-112，2010]。
[0007]由上可知，采用插入其它蛋白的方法來增加G蛋白偶聯受體的穩定性的研究目前都集中在應用原核蛋白和受體進行融合表達，而沒有人研究來源于真核細胞蛋白和G蛋白偶聯受體的融合表達。實際上，G蛋白偶聯受體基本都存在于真核生物中，因此，如果能夠找到一些來源于真核生物的蛋白來穩定G蛋白偶聯受體或許對于G蛋白偶聯受體的某些功能研究具有一些額外的幫助。
[0008]另外，目前所廣泛應用的融合表達G蛋白偶聯受體的思路是嘗試使用不同的融合蛋白和G蛋白偶聯受體融合，最后篩選得到一個能夠較好表達G蛋白偶聯受體的蛋白，目前常用的幾種融合蛋白如BriI和T4L蛋白等能較好的解決一些G蛋白偶聯受體的表達，但對有些G蛋白偶聯受體的表達則幫助不大，需要探索新的融合蛋白。
【發明內容】
[0009]本發明提供了幾種新型的融合蛋白，可以被應用于G蛋白偶聯受體的表達，從而，為G蛋白偶聯受體的融合表達提供了更多的選擇和嘗試的方法。
[0010]為實現上述目的，本發明提供了一種來源于真核細胞的G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，即:APC、RGS16和DNJ蛋白片段及其成功的應用于和G蛋白偶聯受體的融合表達。
[0011]本發明提供的G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:來源于真核生物，具體為APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白、RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白、DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白中的一種。
[0012]其中，APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.4所示。
[0013]RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.5所示。
[0014]DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.3所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]在本發明中，為了提高G蛋白偶聯受體穩定性，通過對G蛋白偶聯受體進行改造，在其N-末端，C-末端或膜內環區3插入APC，RGS16和DNJ等蛋白片段片段構建融合蛋白，從而解決了 G蛋白偶聯受體穩定性的問題。
[0016]針對本發明主要涉及的三種蛋白片段，在本發明中，采用腺苷A2a蛋白與所述APC蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.10所不。
[0017]采用腺苷A2a蛋白與RGS16蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.11所示。
[0018]還采用腺苷A2a蛋白與DNJ蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.12所示。
[0019]其中，上述如SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列可被應用于A2a腺苷蛋白的表達。
[0020]上述如SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.1USEQ ID N0.12所示的基因序列可被構建到表達載體pFastBacl、PcDNA3.l、PET21b中進行A2a腺苷蛋白的表達。
[0021]值得指出的是，本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含APC, RGS16和DNJ等蛋白片段的G蛋白偶聯受體融合表達質粒，這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等，所構建的G蛋白偶聯受體融合表達基因序列可以有效地連接到不同表達載體的適當啟動子上，以指導mRNA合成。
[0022]另外，上述構建好的質粒可以用本領域技術人員熟知的常規技術轉染或轉化到細胞，如可以用Bac-to-Bac技術把含融合表達基因的PFastBac載體轉化到SF9細胞中進行表達，轉化后細胞的培養和病毒的收集和傳代等方法均為本領域技術人員所熟知的常規技術。
[0023]此外，本發明構建的融合蛋白既可以在昆蟲細胞如SF9、SF21、HiFive中表達，還可以在酵母中和哺乳動物細胞如:293，CHO等細胞中進行表達，具有廣泛的應用范圍。
[0024]發明的作用與效果
[0025]本發明提供了三種來源于真核生物的G蛋白偶聯受體融合表達蛋白(SP、APC, RGS16和DNJ蛋白片段)，并進一步的提供這些真核生物蛋白的氨基酸序列和基因編碼序列等信息。
[0026]另外，本發明提供上述新型G蛋白偶聯受體融合表達蛋白在A2a腺苷受體的應用，即、把上述APC，RGS16和DNJ等蛋白片段插入到G蛋白偶聯受體的不同區域(N-末端，C-末端或者膜內環 3)構建融合蛋白，并提供這些融合白的氨基酸序列和基因編碼序列等信肩、O
[0027]本發明通過把這些新型融合表達蛋白與G蛋白偶聯受體進行融合表達，從而達到增加G蛋白偶聯受體表達產率及G蛋白偶聯受體的體外穩定性。[0028]此外，本發明所涉及的新型G蛋白偶聯受體融合表達蛋白可廣泛應用于G蛋白偶聯受體的研究。在本發明中，構建了一個A2a腺苷受體融合表達質粒并提供了該融合表達質粒在昆蟲SF9細胞中表達的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]附圖1a為A2a_APC融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0030]附圖1b為A2a_RGS16融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0031 ]附圖1c為A2a_DNJ融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0032]附圖2a為A2a_APC融合蛋白在底物Adenosine存在時的熱穩定性檢測結果；
[0033]附圖2b為A2a_RGS16融合蛋白在底物Adenosine存在時的熱穩定性檢測結果；
[0034]附圖2c為融合蛋白在底物Adenosine存在時的熱穩定性檢測結果；
[0035]附圖3a為A2a_APC融合蛋白的UPLC檢測圖譜；
[0036]附圖3b為A2a_RGS16融合蛋白的UPLC檢測圖譜；
[0037]附圖3c為A2a_DNJ融合蛋白的UPLC檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0038]實施例1:融合蛋白的基因合成
[0039]化學合成
[0040] (I)、APC蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.4所示。
[0041 ] (5 ’ TCCACCGGCTACCTGGAGGAGCTGGAGAAGGAGCGCTCCCTGCTGCTGGCCGACCTGGACAAGGAGGAGAAGGAGAAGGACTGGTACTACGCCCAGCTGCAGAACCTGACCAAGCGCATCGACTCCCTGCCCCTGACCGAGAACTTCTCCCTGCAGACCGACATGACCCGCCGCCAGCTGGAGTACGAGGCCCGCCAGATCCGCGTGGCCATGGAGGAGCAGCTGGGCACCTGCCAGGACATGGAGAAGCGCGCCCAGCGCCGCATCGCCCGCATCCAGCAGATCGAGAAGGACATCCTGCGCATCCGCCAG3’)，
[0042]正向引物為:(5’ TTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGTCCACCGGCTACCTGGAGG3，)，
[0043]反向引物為:(5’ CAGTGTGGACCGTGCCCGCTCCTGGCGGATGCGCAGGATGT3，)，
[0044]用PCR反應獲得APC蛋白片段基因。
[0045]參考人類基因密碼子，化學合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0046]正向引物(5，TATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGCGCCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0047]反向引物(5’ CCTCCAGGTAGCCGGTGGACAGCTGTCGTCGCGCCG3，)，
[0048]用PCR反應獲得基因A2a (2-208)。
[0049]正向引物(5，GAGCGGGCACGGTCCACACT3’ )， [0050]反向引物(5’ TTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3 ’ )，
[0051]用PCR 反應獲得基因 A2a (219-316)。
[0052]A2a (2-208) _APC_A2a (219-316)參照以上原理進行基因合成，正向引物引入限制性酶切位點EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點XhoI和終止密碼子。
[0053](2)、RGS16蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.5所示。
[0054](5，AACTTCTCCGAGGACGTGCTGGGCTGGCGCGAGTCCTTCGACCTGCTGCTGTCCTCCAAGAACGGCGTGGCCGCCTTCCACGCCTTCCTGAAGACCGAGTTCTCCGAGGAGAACCTGGAGTTCTGGCTGGCCTGCGAGGAGTTCAAGAAGATCCGCTCCGCCACCAAGCTGGCCTCCCGCGCCCACCAGATCTTCGAGGAGTTCATCTGCTCCGAGGCCCCCAAGGAGGTGAACATCGACCACGAGACCCACGAGCTGACCCGCATGAACCTGCAGACCGCCACCGCCACCTGCTTCGACGCCGCCCAGGGCAAGACCCGCACCCTGATGGAGAAGGACTCCTACCCCCGCTTCCTGAAGTCCCCCGCCTACCGCGACCTGGCCGCCCAGGCCTCCGCCGCCTCC3，),
[0055]正向引物為:(5，GAGAACCTGTACTTCCAATCCAACTTCTCCGAGGACGTGCT3’)，
[0056]反向引物為:(5’ ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGGAGGCGGCGGAGGCCTG3，)，
[0057]用PCR反應獲得RGS16蛋白片段基因。
[0058]參考人類基因密碼子，化學合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0059]正向引物(5’ CCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0060]反向引物(5，TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3，)，
[0061]用PCR反應獲得基因A2a (2-316)。
[0062]RGS16 (54-188) _A2a (2-316)參照以上原理進行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位點EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點XhoI和終止密碼子。
[0063](3)、DNJ蛋白片段其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.6所示。
[0064](5，GGCTACTACGACGTGCTGGGCGTGAAGCCCGACGCCTCCGACAACGAGCTGAAGAAGGCCTACCGCAAGATGGCCCTGAAGTTCCACCCCGACAAGAACCCCGACGGCGCCGAGCAGTTCAAGCAGATCTCCCAGGCCTACGAGGTGCTGTCCGACGAGAAGAAGCGCCAGATCTACGACCAGGGCGGC3，)，
[0065]正向引物為:(5，GAGAACCTGTACTTCCAATCCGGCTACTACGACGTGCTGG3’)，
[0066]反向引物為:(5，ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGCCGCCCTGGTCGTAGATC3，)，
[0067]用PCR反應獲得DNJ蛋白基因。
[0068]參考人類基因密碼子，化學合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0069]正向引物(5，CCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0070]反向引物(5，TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3，)，
[0071]用PCR反應獲得基因A2a (2-316)。
[0072]DNJ (6-68) _A2a (2-316)參照以上原理進行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位點EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點XhoI和終止密碼子。
[0073]其中，PCR反應條件為:在 50 μ L 反應體系中(PCR Buffer, 1.5mM MgS04, 200 μ MdNTPs)加入擴增引物各0.2 μ Μ。充分混勻后開始PCR循環:94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，68 °C延伸2分鐘，共進行30個循環，最后在68°C保溫10分鐘。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收后用于克隆。
[0074]實施例2:本發明融合蛋白質粒構建
[0075]將實施例1中獲得的PCR片段與經過限制性內切酶EcoRI和XhoI雙酶切的載體pFastBacl (購自Invitrogen)進行連接。連接產物轉化于感受態大腸桿菌DH5 α中，體積不應超過感受態細胞的10%，輕輕旋轉幾次混勻內容物，冰浴30分鐘，將管放入42°C水浴，定時60秒熱休克，快速將管轉移到冰浴120秒，使細胞冷卻，每管加入400 μ I LB培養基，37°C緩搖60分鐘，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，低速離心2分鐘，去上清，留約100 μ I培養基在離心管內，重懸菌體，用玻璃鋪菌器將菌液在瓊脂板上鋪勻。將平板倒置于37°C恒溫培養箱，12-16小時后可出現菌落。涂板后挑取陽性克隆進行鑒定。
[0076] 實施例3:本發明融合蛋白的表達
[0077]將實施例2中獲得的重組質粒轉化至DHlOBac E.coli感受態細胞中，體積不應該超過感受態細胞的5%，輕輕旋轉幾次混勻內容物。冰浴30分鐘；將管放入42°C水浴，定時90秒熱休克；快速將管轉移到冰浴120秒，使細胞冷卻；每管加入800ulLB培養基，37°C，緩搖4小時，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素標記基因；用玻璃鋪菌器將30ul菌液在抗性瓊脂板上鋪勻；將平板倒置于37°C恒溫培養箱中，30-48小時后可出現藍白斑菌落；挑取陽性白斑單菌落接入5ml抗性LB，緩搖12-16h，取菌液進行PCR鑒定，結果顯示桿粒重組正確。將重組桿粒經轉染試劑轉染到昆蟲細胞中，4-5天后收取細胞上清液作為第一代桿狀病毒。用第一代桿狀病毒感染昆蟲細胞72小時后，獲得第二代病毒，用于組合多肽的表達；使用第二代病毒1:100體積比感染密度為2xl0~6/ml的昆蟲細胞sf9，繼續培養72小時后，離心收細胞，PBS洗一遍細胞。
[0078]實施例4:融合蛋白純化
[0079]用200ml 預冷的裂解液(IOmM HEPES ρΗ7.5，IOmM MgC12, 20mMKCl)重懸 IL 細胞到200ml中，用勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后用超速離心機離心45分鐘，去掉上清，重復洗滌步驟3次，再用高鹽溶液重復洗滌步驟三次，提取好的細胞膜用加甘油的裂解液溶解并用液氮進行速凍，儲存在-80C冰箱。在冰上融化解凍細胞膜，并入茶堿和碘乙酰胺分別至終濃度為4mM，2mg/ml，在冰上放置30分鐘后按照每升細胞膜加入100mL溶膜緩沖液比例加入溶膜緩沖液，并繼續在冰上放置3小時溶膜，用超速離心機在160，OOOg離心力下離心40分鐘，棄掉沉淀，上清與Iml用平衡緩沖液平衡好的Talon IMAC resin 一起孵育過夜，次日，棄上清，加入適量平衡緩沖液重懸填料，將填料轉移到自流柱里。依次用沖洗緩沖液I (25mMHepes pH7.5;800mMNaCl;10%glycerol;0.05%DDM;0.001%CHS;4mM theophylline)洗 10 個柱體積，沖洗緩沖液 2 (25mMHepes pH7.5; 800mMNaCl; 10%glycerol; 4mM theophylline;0.05%DDM;0.001%CHS;25mM Imid; IOmM MgCl2;8mM ATP)洗 10 個柱體積，沖洗緩沖液3(25mMHepes pH7.5;800mMNaCl;10%glycerol;4mM theophylline;0.05%DDM;0.001%CHS;IOmM MgC12;10mM ATP)洗5個柱體積，然后用5個柱體積的洗脫緩(緩沖液I加入300mM咪唑)沖液洗脫目的蛋白，純化后得到的目的蛋白保存在-80°C，圖1為三種融合蛋白的電泳檢測結果。
[0080]從得率來看，經純化后3種膜蛋白的得率都超過lmg/L細胞，具有較高的產率。 [0081]實施例5:融合蛋白熱穩定性測試
[0082]打開Cary Eclipse熒光分光光度計，預熱30分鐘，吸取130ul蛋白溶液，加入
0.13ul的CPM熒光染料，充分混勻，將混勻好的樣品，加入到石英比色皿，放入樣品架。啟動Cary Eclipse軟件組中的Thermal程序,設置激發波長(387nm),光柵縫隙為2.5nm;吸收波長(463nm)，光柵縫隙為5nm，從20°C至90°C每分鐘上升1°C，運行程序，導出測量數據，用軟件進行Sigmanoid擬合,計算樣品的Tm值。
[0083]按照上述步驟方法，分別檢測了三種融合蛋白在和A2a腺苷受體相結合之后的熱穩定性值，其結果如圖2所示。
[0084]由圖可知，A2a-APC融合蛋白，其Tm值為50.8 °C ;A2a_RGS16融合蛋白，其Tm值為55.60C ;A2a-DNJ 融合蛋白，其 Tm 值為 52。。。
[0085]3個融合蛋白和A2a腺苷受體相結合以后的熱穩定性值都超過了 50°C，說明三種蛋白都具有較好的熱穩定性。
[0086]實施例6:融合蛋白均一性檢測
[0087]采用Waters公司的Acquity H-Class Bio UPLC系統進行檢測,檢測所用柱子為Sepax SEC250 分子篩柱，上樣前先用平衡緩沖液(25mM HEPES, 500mM NaCl, 2%glycerol, 0.05DDM, 0.0P/oCHS, pH7.5)洗柱子至基線沒有太大變化止，然后將待檢測的樣品加入專用的96孔板中上樣，積分處理采用儀器自帶的軟件。
[0088]按照上述方法對三種融合蛋白分別進行了檢測，結果如圖3所示，三種融合蛋白均一性都很好，能夠檢測到融合蛋白單體峰，且單體占蛋白樣品的大部分。
【權利要求】
1.一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:來源于真核生物， 其中，所述G蛋白偶聯受體融合表達蛋白選自APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白； 或RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白； 或DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白。
2.如權利要求1所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如權利要求2所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.4所示。
4.如權利要求2所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述APC蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
5.如權利要求2所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述APC蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.10所示。
6.如權利要求1所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
7.如權利要求6所述 的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.5所不。
8.如權利要求6所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述RGS16蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
9.如權利要求6所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述RGS16蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.11所示。
10.如權利要求1所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
11.如權利要求10所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.6所示。
12.如權利要求10所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述DNJ蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示。
13.如權利要求10所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述DNJ蛋白進行融合表達，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.12所示。
14.如權利要求1-13任一所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:在G蛋白偶聯受體的N-末端、C-末端或膜內環區3插入所述APC、RGS16或DNJ蛋白片段構建融合蛋白。
15.如權利要求14所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述融合蛋白可以在昆蟲細胞中、酵母細胞中和哺乳動物細胞中進行表達。
16.如權利要求4或8或12任一所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述如SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列可被應用于A2a腺苷蛋白的表達。
17.如權利要求5或9或13任一所述的一種G蛋白偶聯受體融合表達蛋白，其特征在于:所述如SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12所示的基因序列可被構建到表達載體pFastBacl、 PcDNA3.l、PET21b中進行A2a腺苷蛋白的表達。
【文檔編號】C12N15/62GK104017082SQ201310577289
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年11月18日
【發明者】蔡建華, 沈堅, 姜帆, 李娜, 魏文韜, 曾秀紅, 蘇曉燕, 韓敏, 任德林, 毛晨 申請人:維亞生物科技(上海)有限公司