一種熱穩定性及比酶活提高的角蛋白酶及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種比酶活和熱穩定性提高的角蛋白酶及其應用，屬于遺傳工程領域。本發明通過對角蛋白前導肽切割位點進行突變及N端改造，獲得一種具有廣泛工業應用前景的角蛋白酶，其在60℃的t1/2為20min，比野生型角蛋白酶t1/2提高了近2倍。同時突變體的比酶活較野生型提高了近50%，這為角蛋白酶的應用奠定了良好的基礎。
【專利說明】一種熱穩定性及比酶活提高的角蛋白酶及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種比酶活和熱穩定性提高的重組角蛋白酶及其構建方法和應用，屬于遺傳工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，由細菌、放線菌和真菌等多種微生物產生。羽毛作為家禽飼養和屠宰工業的副產物每年產量巨大，且蛋白質和氨基酸含量豐富，是潛在的優良蛋白質資源。羽毛的合理利用一方面可以減少廢棄物對環境的污染，同時可以作為一種飼科蛋白質應用于畜禽的飼養。在傳統利用羽毛過程中主要采用酸堿水解。熱降解等方法，前者存在污染環境問題，后者對能源消耗比較大，且可以破壞部分氨基酸，降低了產品的營養價值。其他常見的角蛋白為動物的毛發，如牛毛、羊毛和人發等，這類角蛋白質部分作為商業原料進行加工外，其余多作為廢物處理，也造成了環境的污染和蛋白資源的浪費。角蛋白酶能使角蛋白降解為多肽和氨基酸，既可用于農業肥料的生產，又可作為畜禽的飼料蛋白源；角蛋白酶是皮膚真菌重要的侵襲因子，其在皮膚病治療方面的研究還有待于進一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”導致瘋牛病和人類克雅氏癥的毒蛋白，從而可應用于醫療和實驗儀器的凈化；它還可用于皮革脫毛鞣制，配制潤膚露、浴皂、洗發水和脫毛膏等美容品。
[0003]擁有較差熱穩定性的酶嚴重影響該酶在工業上的應用，提高角蛋白酶的熱穩定性在利于工業化應用的同時有助于角蛋白酶在應用過程中更好的滲透入底物表面并作用于底物，而且能夠減少雜菌的生長。同時提高重組角蛋白酶的比酶活可以更加有利于工業化應用。地衣芽胞桿菌來源的角蛋白酶同枯草桿菌蛋白酶一樣，以信號肽-前導肽-成熟酶區域(Pre-pro-subtilisin precursor)的前體結構進行分泌。角蛋白酶的成熟酶區域由274個氨基酸組成，包括催化三分子結構(D32，H63, S220)。在角蛋白酶的前體未進行折疊前成熟酶的N端與前導肽的C端`以非共價形式連接，在前導肽進行自加工切割并被降解后，才能形成具有活性的成熟酶。角蛋白酶的前導肽切割位點區域主要包括前導肽的C端和成熟酶的N端，所以此區域對角蛋白酶的活性及熱穩定性可能具有一定的影響。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種熱穩定性提高的角蛋白酶，其是對現有的角蛋白酶前導肽切割位點進行突變及N端改造。
[0005]所述角蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]本發明還提供了一種獲得所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank登錄號為JX504681公布的基因序列基礎上，對前導肽切割位點區域進行分子改造，具體為前導肽的C端(-1)位點Leu替換為Ala，成熟酶N端氨基酸AQTVP替換為YTPNDPYFSSRQ。
[0007]產所述產角蛋白酶的基因工程菌或轉基因細胞系也為本發明要求保護的范圍。[0008]本發明要解決的另一個技術問題是提供一種構建產角蛋白酶的基因工程菌的構建方法，具體包括如下步驟:
[0009]I)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼權利要求1所述角蛋白酶的基因；
[0010]2)將步驟I)獲得的角蛋白酶基因連接到枯草桿菌表達載體，得到重組表達載體；
[0011]3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。
[0012]所述表達載體優選pMA5。
[0013]應用上述產角蛋白酶基因工程菌發酵生產角蛋白酶的方法，將其斜面活化制備種子后，以3%的接種量轉入基本發酵培養基，于37°C、200rpm條件下培養24h。
[0014]所述基本發酵培養基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaC110g/L，葡萄糖 10g/L, MgSO40.lg/L。
[0015]檢測重組角蛋白酶熱穩定性指標(t1/2)的定義方法:酶在指定溫度下酶活損失一半時所需要的時間。
[0016]本發明采用定點突變技術將地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBEll-1的角蛋白酶(ker )基因進行定點突變并克隆連接到枯草芽孢桿菌表達載體pMA5，轉化Bacillus subtilis WB600,經純化驗證得到一株可以產具有較好熱穩定性角蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600-pMA5_kerTB。該菌株表達的角蛋白酶在60°C的t1/2為20min，比野生型角蛋白酶t1/2提高了近2倍。同時突變體的比酶活較野生型提高了近50%，這為角蛋白酶的應 用奠定了良好的基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1: (a)目的基因的擴增。M:DL2, 000DNA Marker ;泳道I和泳道2:ker基因的PCR擴增條帶；(b)菌落PCR挑選陽性重組子。M:DL2, 000DNA Marker ;泳道I和泳道2:陽
性重組子。
[0018]圖2: (a)重組質粒的提取。M:DL10, 000DNA Marker ;泳道I和泳道2:重組質粒pMA5-ker ；
[0019](b)雙酶切驗證。M:DL10, 000DNA Marker ;泳道 1:重組質粒 pMA5_ker ;泳道 2:重組質粒用Bam H I和Nde I雙酶切后得到的條帶。
[0020]圖3:蛋白電泳(SDS-PAGE)實驗結果。(a) M:蛋白質分子量標準(ProteinMolecular Weight Marker);卜9:WT, L (-1) H, L (-1) R, L (-1) A, L (-1) G, L (-1) E, L (-1)D, L(-1)F, L(-1) Y; (b) M:蛋白質分子量標準(Protein Molecular Weight Marker)；1:N-YTPND。
[0021]圖4:分子改造前導肽(-1)位點后不同突變體重組角蛋白酶的比酶活比較。
[0022]圖5:分子改造成熟區域N端后重組角蛋白酶在60°C的t1/2和野生型(未改造)酶在60°C的t1/2的比較。
【具體實施方式】
[0023]實施例1熱穩定性提高的角蛋白酶
[0024]本發明的角蛋白酶是在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基礎上，在其前導肽切割位點區域進行分子改造，具體為前導肽的C端(-1)位點Leu替換為Ala,成熟酶N端AQTVP替換為來源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜熱蛋白酶的N端YTPNDPYFSSRQ。其獲得方法為以GenBank accession nos.JX504681公布的基因為出發基因，通過化學全合成或定點突變的方式將其前導肽切割位點區域進行氨基酸的取代；氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]實施例2產角蛋白酶基因工程菌的構建及鑒定
[0026]構建產角蛋白酶基因工程菌的步驟如下:
[0027]I)采用PCR方法或化學全合成方法獲得ker基因；
[0028]2)將ker基因連接到克隆載體pMD19_T，得到重組載體pMD19-T_ker ；
[0029]3)前導肽C端(-1)位點Leu替換為不同類型的氨基酸。成熟酶N端AQTVP替換為來源于 Thermoactinomyces vulgaris 的嗜熱蛋白酶的 N 端 YTPNDPYFSSRQ (N-YPTND)。
[0030]突變可采用定點突變技術或其它技術，只要能實現突變即可。
[0031]本專利列舉Leu (-1) Ala的引物以為實例:
[0032]Leu (_1) Ala:GATCATGTGGCCCATGCCTTG (GCA) GCGCAAACCGTTCCTTACN-YPTND:
[0033]TATACGCCTAATGACCCTTATTTCTCATCAAGACAA TACGGCATTCCTCTCATTAAAGC
[0034]PCR反應體系:0.2mL PCR管中按順序加入以下試劑:5Xprime STAR PCR bufferII (Mg2+P Ius )5 μ I;` DNTP Mixture4y I;模板 DNAl μ I ;上下游引物各 I μ I ; Taq 酶 0.5 μ I ；加雙蒸水至終體積為50 μ I。
[0035]PCR擴增條件:94°C預變性5min ;94°C變性30s，61°C (根據不同突變引物而定)退火 15s，72。。延伸 3min20s (30 個循環);72°C延伸 IOmin0
[0036]將膠回收純化后的PCR產物在37°C，IOmin條件下用磷酸化試劑盒處理使之磷酸化。然后應用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產物用化學轉化法轉化宿主菌JM109，并挑選轉化子。
[0037]4)挑選驗證正確的轉化子并提取重組質粒pMD19-T_kerTB，以其為模板擴增kerTB基因。
[0038]PCR方法引物序列如下:
[0039]kerl-F:5， -GGAATTCCATATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGG-3>
[0040]ker1-R: 5，~CGCGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG~3，
[0041]地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis BBEl已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2011319。
[0042]PCR反應體系:0.2mL PCR管中按順序加入以下試劑:5Xprime STAR PCR bufferII (Mg2+p Ius )5 μ I; DNTP Mixture4y I;模板 DNAl μ I ;上下游引物各 I μ I ; Taq 酶 0.5 μ I ；加雙蒸水至終體積為50 μ I。PCR擴增條件:94°C預變性5min ;94°C變性30s，61°C退火15s，72°C延伸 lmin20s (30 個循環)；72°C延伸 IOmin0
[0043]5)以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證并以0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產物，結果擴增得到與文獻報道大小相符的ker基因片段(圖1a-泳道1、泳道2)。
[0044]6)用限制性內切酶Nde I和Bam HI雙酶切消化純化后的ker基因和載體pMA5，用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產物用化學轉化法轉化宿主菌JM109，轉化菌液涂布在含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上，37°C過夜培養，以kerl_F和kerl-R為引物進行菌落PCR的方法鑒定陽性克隆子(圖1b-泳道1、泳道2)，最終獲得含有kerTB基因的重組表達質粒pMA5-kerTB (圖2a_泳道1、泳道2)，用雙酶切進行驗證(圖2b_泳道2)。
[0045]大腸桿菌化學轉化為:取連接產物5μ I加入到含有100μ I JM109感受態細胞中，充分混勻后，冰浴30min ;將裝有混合物的Eppendorf管，42°C水浴熱休克90s，然后將Eppendorf管立即轉移到冰上冷卻2min ；向管中加入600 μ I LB液體培養基,置于370C 200rpm恒溫搖床上培養lh，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37°C向上放置lh，倒置培養12-16h后觀察菌落。
[0046]7)將重組質粒pMA5_kerTB轉化Bacillus subtilis WB600感受態細胞，得到能在含有卡那霉素(25 μ g/mL)的LB平板上正常生長的基因工程菌，并經過鑒定命名為Bacillus subtilis WB600-pMA5-kerTB?
[0047]實施例3重組菌的酶活測定和蛋白電泳
[0048]角蛋白酶酶活測定方法:將發酵液離心IOmin (10000X g，4°C )取發酵上清液，吸取200 μ L適當稀釋的酶液，加入300 μ L0.05mol/L gly-NaOH緩沖液(pH9.0)溶解1%的底物(角蛋白)，50°C培養20min，加入500uL4M TCA溶液以終止反應。離心lOmin，吸取200 μ L上清液移入到新的試管中，后依此加入ImL福林酚試劑和200 μ L0.5Μ Na2CO3后50度顯色15min。空白為在加入酶液的同時，加入500μ L TCA溶液，經過相同過程反應的過濾清液作為空白。在660nm處檢測吸光值,根據酪氨酸標準曲線定義每15min內釋放Iyg酪氨酸定義為一個酶活單位。通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為30kDa的蛋白條帶(見圖3)。
[0049]實施例4發酵生產角蛋白酶
[0050]培養基:種子和斜面培養基為LB培養基(IL):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCllOg ;斜面培養基添 加瓊脂15g ;基本發酵培養基為添加葡萄糖的LB培養基(IL):胰蛋白胨IOg,酵母抽提物5g, NaCllOg,葡萄糖IOg ；
[0051]培養方法:將37°C、200rpm下培養過夜的種子以3%的接種量轉入基本發酵培養基，于37°C、200rpm條件下培養。
[0052]純化后測定突變體Leu (_1) Ala重組角蛋白酶的比酶活較野生型提高了 50%(圖4),將成熟酶N端替換為來源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜熱蛋白酶的N端YTPNDPYFSSRQ，檢測其熱穩定性，在60°C的tl/2為20min，比野生型角蛋白酶tl/2提高了近2倍(見圖5)。可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種熱穩定性及比酶活提高的角蛋白酶，其特征在于對現有的角蛋白酶前導肽切割位點進行突變及N端改造。
2.如權利要求1所述的角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示。
3.獲得權利要求2所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank登錄號為JX504681公布的基因序列基礎上，對前導肽切割位點區域進行分子改造，具體為前導肽的C端(-1)位點Leu替換為Ala，成熟酶N端氨基酸AQTVP替換為YTPNDPYFSSRQ。
4.產權利要求1或2所述產角蛋白酶的基因工程菌或轉基因細胞系。
5.一種構建產權利要求2所述角蛋白酶的基因工程菌的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)采用化學全合成或PCR方法克隆編碼權利要求2所述角蛋白酶的基因； 2)將步驟I)獲得的角蛋白酶基因連接到枯草桿菌表達載體，得到重組表達載體； 3)將步驟2)獲得的重組表達載體轉化Bacillussubtilis WB600得到基因工程菌。
6.權利要求5所述的方法,其特征在于所述表達載體為pMA5。
7.一種發酵生產角蛋白酶的方法，其特征在于以權利要求5獲得的產角蛋白酶基因工程菌為生產菌株，斜面活化制備種子后，以3%的接種量轉入已優化的基本發酵培養基，于37 °C、200rpm條件下培養24h。
8.權利要求7所述的方法，其特征在于基本發酵培養基組成為胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物 5g/L, NaCl 10g/L,葡萄糖 10g/L,0.lg/L MgSO4。
【文檔編號】C12R1/125GK103602653SQ201310590104
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】陳堅, 劉柏宏, 張娟, 堵國成 申請人:江南大學