專利名稱：：用于構建流感病毒的反向遺傳系統的載體及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于構建流感病毒的反向遺傳系統的載體及應用。
背景技術：
：禽流感的頻繁暴發不僅給養殖業帶來了巨大的經濟損失，而且對人類的健康造成巨大威脅。目前對禽流感的研究，特別是H5N1亞型高致病性禽流感的研究日漸深入，并在其致病機理、跨種傳播機制、疫苗研究等方面都取得了很大的進展。對流感病毒分子機制方面的研究都得益于近年來流感病毒反向遺傳系統的建立，此系統的建立可以使研究者從分子水平上對流感病毒基因組進行突變研究。該技術也大大提高了對流感病毒的認識水平，并且目前使用的流感疫苗均是通過反向遺傳技術制備的。目前已經有的流感反向遺傳系統質粒，在構建的流感病毒的八個基因片段質粒過程中，是通過傳統的連接方法連接的，首先用限制性內切酶酶切，再用T4DNA連接酶進行連接，傳統的這種酶切的連接方法存在連接效率較低、步驟比較煩瑣等問題，PCR產物與載體都要通過反復的酶切，電泳，回收等步驟，才能進行進一步的連接。這樣既耗費時間，而且連接的效率不是很理想。
發明內容本發明的目的是提供一種用于構建流感病毒的反向遺傳系統的載體及應用。本發明所提供的用于構建流感病毒反向遺傳系統的載體，有兩種，分別命名為pLLB-A和pLLB-G。pLLB-A是一種環狀載體，包含原核復制起點、篩選標記基因、多聚腺苷酸加尾信號和兩個轉錄方向相同的啟動子，所述多聚腺苷酸加尾信號位于所述兩個轉錄方向相同的啟動子的下游，其中，所述兩個轉錄方向相同的啟動子和所述多聚腺苷酸加尾信號之間含有polI元件，所述polI元件自上游至下游依次為RNA聚合酶I啟動子、連接片段和RNA聚合酶I終止子，所述連接片段含有AGCGAAAGCAGG/CCT序列；所述polI元件的轉錄方向與所述兩個轉錄方向相同的啟動子的轉錄方向相反。pLLB-G也是一種環狀載體，包含原核復制起點、篩選標記基因、多聚腺苷酸加尾信號和兩個轉錄方向相同的的啟動子，所述多聚腺苷酸加尾信號位于所述兩個轉錄方向相同的啟動子的下游，其中，所述兩個轉錄方向相同的啟動子和所述多聚腺苷酸加尾信號之間含有polI元件，所述polI元件自上游至下游依次為RNA聚合酶I啟動子、連接片段和RNA聚合酶I終止子，所述連接片段含有AGCAAAAGCAGG/CCT序列；所述polI元件的轉錄方向與所述兩個轉錄方向相同的啟動子的轉錄方向相反。上述兩個轉錄方向相同的啟動子具體可為巨細胞病毒啟動子和T7噬菌體啟動子；所述多聚腺苷酸加尾信號均可為牛生長激素基因多聚腺苷酸加尾序列。pLLB-A載體的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1。pLLB-G載體的核苷酸序列具體可為序列表中的序列2。本發明還提供了一種線性載體，是用StuI酶酶切所述的pLLB-A和pLLB-G載體得到的線性載體。本發明的另一個目的是提供pLLB-A和pLLB-G載體的構建方法。本發明的pLLB-A和pLLB-G載體的構建方法，包括如下步驟1)以pEGFP-Nl質粒為模板，用如下引物5，fi^I776760"7^70T0^6CATGCATCTAG3，和5，力(^r"77Tr77aT6"6^a:6t7)46)^ft;3'進行PCR擴增，得到片段A;2)以pCDNA3.0質粒為模板，用如下引物5'aXT67^C6^TC^6^A4(S4^^7^r3'和5'67T^^6^7^7Tr6GCAATTCCAGCACAC3'進行PCR擴增，得到片段B;3)將片段A和片段B導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段A和片段B連接，獲得重組載體I;4)以重組載體I為模板，用如下引物5，^6K40a:6Tar(^CC7n^(a^X47^C'和5，6^7C^CC^7^T0^6^16^7T6"6^7r7ar進行PCR擴增，得到片段C;5)以P冊2卜A或P冊21-G為模板，用如下引物5，縱H6r贏OTTadZ46mTCC或5，607W76T6r7rfi46^a:6^fi46^6r6T6rCCY進行PCR擴增，得到片段D或E;6)將片段C和片段D或E導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段C和片段D或E連接，獲得pLLB-A和pLLB-G載體。pLLB-A載體和pLLB-G載體都可用來構建流感病毒反向遺傳系統。本發明的又一個目的是提供用pLLB-A載體和pLLB-G載體構建的流感病毒反向遺傳系統質粒。本發明所提供的流感病毒反向遺傳系統質粒，是在PLLB-A載體的連接片段的AGGCTT的G和C位點間插入如下a)或b)或c)的DNA分子a)流感病毒PB2基因；b)流感病毒PB1基因；c)流感病毒PA基因；或者，是在pLLB-G載體的連接片段的AGGCTT的G和C位點間插入如下1)至5)中任一DNA分子1)流感病毒HA基因；2)流感病毒NP基因；3)流感病毒NA基因；4)流感病毒M基因；5)流感病毒NS基因。用pLLB-A載體和pLLB-G載體構建的流感病毒反向遺傳系統質粒可用于病毒拯救。以本發明的pLLB-A和pLLB-G載體為出發載體構建流感病毒反向遺傳系統質粒，無需傳統的酶切和連接等環節，在整個構建過程中不使用任何內切酶與連接酶，因此比傳統的連接過程省略了2-3個步驟，且連接的效率比傳統的方法高，克隆陽性率為20%-100%。使得構建過程簡便，快速，經濟和高效。同時，構建的流感病毒反向遺傳系統質粒具有良好的繁殖特性，少量的菌液可以提取出相當量的質粒，而且質粒的條帶很單一，只有超螺旋結構的質粒，高質量高純度的質粒有利于下一步病毒的拯救，大大縮短并簡化了流感病毒的拯救步驟，為流感的研究工作提供了更有力的工具。圖1為pLLB-G載體結構示意圖。具體實施例方式實施例1、pLLB-A與pLLB-G載體的構建1)pBackbone-vector載體的構建設計引物pBackbone-BGH-上游和pBackbone-BGH-下游、pBackbone-CMV-上游和pBackbone-CMV-下游的序列如下pBackbone-BGH-上游5，C^77r7^^WZ^OTa^6CATGCATCTAG3';pBackbone-BGH-下游5，v4"7677tT7TOT6t^a:"C7^C4tt^3，。pBackbone-CMV-上游5，C^T67^6T6^76K^^U46^^76T3，；pBackbone-CMV-下游5，C7rfi^6^7^7CT6^GAATTCCAGCACAC3，。引物均由上海生工公司合成，page純化。使用時，配制成工作濃度為20uM，分裝，于-8(TC凍存備用。以pEGFP-Nl質粒為模板，用引物pBackbone-BGH-上游和pBackbone-BGH-下游PCR擴增片段A，以pCDNA3.0質粒為模板，用引物pBackbone-CMV-上游和pBackbone-CMV-下游PCR擴增片段B。PCR反應體系10XPCRBuffer5叱，上游、下游引物各l叱，DNA模板l叱，MgC12(25mM)3叱，dNTPs(各2.5mM)3叱，Pfu-Taq(5UAtL)0.5pL，最后補水至50叱。反應條件94。C熱變性5min;94。C變性45s，53。C退火45s，72。C延伸6min，共30個循環；72。C最后延伸10min。pcr產物用dna回收試劑盒回收，方法參考其說明書。50pl感受態細胞中加入片段A和B后混勻，片段A和B質量比為100ng:500ng。混勻后體系冰浴30min。42'C水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預熱的LB培養基900pl，置于37。C下，180-200rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養基重懸菌體，取20(^1重懸液涂布LB板上(含有氨芐青霉素)，37t:培養12-16h。挑取單克隆提取質粒，該質粒命名為pBackbone-vector。2)pLLB-A與pLLB-G質粒的構建設計引物pLLB-P0L1上游和pLLB-P0L1下游、pLLB-上游和pLLB-下游，引物pLLB-P0L1上游和pLLB-P0L1下游、pLLB-上游和pLLB-下游序列如下pLLB-P0L1上游5，f6^6^(XCA4^T7ra^467^a^6Ta^6T<，；pllb-poli下游5，^orwa^cTrMwca^ww^tTarcj,。pLLB-上游5，6^6"6^aT(XT6TO^(XTC6^;a^a^7^C,.pLLB-下游5,釘a^6T釘釘CC7TdCC■，。其中pLLB-P0L1引物用于從PHH21-A與PHH21-G(ShuaiWang,QinfangLiu，JinhuaLiu，andearlG.Brownetal.Simplifiedrecombineeringapproachforinfluenzavirusreversegenetics.JournalofVirologicaiMethods.2008Jul151(l):74-8)(中國農業大學)中擴增POLI啟動子與終止子元件。pLLB上下游引物用于擴增整個質粒pBackbonevector。pLLB-P0L1上游與pLLB-下游的序列是同源互補的，pLLB-P0Ll下游與pLLB-上游引物序列是同源互補的。POLI啟動子與終止子元件插入質粒pBackbonevector的GGGAGACCCAAGCTT/CTCGAGCGGCCATGC。引物均由上海生工公司合成，PAGE純化。使用時，配制成工作濃度為20uM，分裝，于-80'C凍存備用。以PHH21-A質粒為模板，用引物pLLB-POLl上游和pLLB-POLl下游PCR擴增片段C;以P冊21-G質粒為模板，用引物pLLB-POLl上游和pLLB-POLl下游PCR擴增片段D;以pBackbone-vector質粒為模板，用引物pLLB-上游和pLLB-下游PCR擴增片段E。PCR反應體系10XPCRBuffer5叱，上游、下游引物各l叱，DNA模板1吣，MgC12(25raM)3叱，dNTPs(各2.5mM)3叱，Pfu-Taq(5U/HL)0.5PL，最后補水至50叱反應條件94。C熱變性5min;94。C變性45s，52。C退火45s，72。C延伸6min，共30個循環；72。C最后延伸10min。PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。5(HU感受態細胞中加入片段C和E后混勻成細胞懸浮液1，片段C和E質量比為100ng:500ng。50|il感受態細胞中加入片段D和E后混勻成細胞懸浮液2，片段D和E質量比為100ng:500ng。細胞懸浮液l和細胞懸浮液2在42'C水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預熱的LB培養基900pl，置于37。C下，180-200rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養基重懸菌體，取200(il重懸液分別涂布在LB板上(含有氨芐青霉素)，37。C培養12-16h。分別挑取單克隆提取質粒，重組質粒分別命名為PLLB-A與pLLB-G。對pLLB-A與pLLB-G進行測序，測序結果表明，pLLB-A的核苷酸序列如序列表中的序列1，序列表中的序列1自5'末端第1-411位為CMV啟動子，自5'末端第412-445位為POLI終止子，自5'末端第462-692位為POLI啟動子，自5'末端第455-460位為StuI酶的識別位點。序列1的自5'端第441-457位的核苷酸序列和序列1的自5'端第457-462位的核苷酸序列為能與流感病毒(8個基因)的PCR擴增產物發生同源重組的序列，自5'末端第693-993位為BGHPloyA，自5'末端第994-1672位為原核復制起點，自5'末端第1673-3337位氨芐青霉素抗性基因序列，第449位點序列為A。pLLB-A的核苷酸序列如序列表中的序列l，序列表中的序列1自5'末端第1-411位為CMV啟動子，自5'末端第412-445位為P0LI終止子，自5'末端第462-692位為POLI啟動子，自5'末端第455-460位為StuI酶的識別位點。序列1的自5'端第441-457位的核苷酸序列和序列1的自5'端第457-462位的核苷酸序列為能與流感病毒(8個基因)的PCR擴增產物發生同源重組的序列，自5'末端第693-993位為BGHPloyA，自5'末端第994-1672位為原核復制起點，自5'末端第1673-3337位氨芐青霉素抗性基因序列，第449位點序列為G。圖l為pLLB載體結構示意圖。實施例2、用pLLB-A與pLLB-G構建流感病毒的反向遺傳系統1)用pLLB-A與pLLB-G構建流感病毒的反向遺傳系統pLLB-A與pLLB-G載體分別用Stul內切酶酶切線性化，回收線性化后的pLLB-A與pLLB-G載體。酶切體系如下10XDbuffer,,BSAl|il，Stul2ul(20UPROMEGA公司)，pLLB-A與pLLB-G分別lOug，補水至100u1，37。C酶切過夜。將酶切產物在IXTAE配制的瓊脂糖凝膠中電泳，120v，電泳30分鐘，用DNA回收試劑盒回收目的片段，回收產物-80。C保存備用。分別提取三個亞型流感病毒(H1N1、H9N2和H11N9)的RNA，反轉錄為cDNA，設計引物P卜l和Pl-2擴增PB2基因；引物P2-1和P2-2擴增PB1基因；引物P3-l和P3-2擴增PA基因；引物P4-1和P4-2擴增HA基因；引物P5-l和P5-2擴增NP基因；引物P6-1和P6-2擴增NA基因；引物P7-1和P7-2擴增M基因；引物P8-1和P8-2擴增NS基因。該8對引物中的上游引物中均含有序列1的自第5'末端第441-457位的核苷酸序列，下游引物中均含有序列1的自5'端第457-462位的核苷酸序列。具體的引物序列如下(以H11N9引物為例)Pl-l:GGGGAGCGAAAGCAGGTCAAATATATTC;P1-2:GGTTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC。P2-l:GGGGAGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGA;P2-2:GGTTATTAGTAGAAACAAGGCATTTTTTC。P3-1:GGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCC;P3-2:GGTTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTG。P4-1:GGGGAGC嵐AGCAGGGGAMTAC;P4-2:GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTACTGCA。P5-1:GGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATC;P5-2:GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTC。P6-1:GGGGAGCGAAAGCAGGGTCAAGATGA;P6-2:GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTCTTTTTTC。P7-1:GGGGAGCAAAAGCAGGTAGAT;P7-2:GGTTATTAGTAGAMCAAGGTAGTTTTTTAC。P8-1:GGGGAGCAAAAGCAGGGTGACAAA;P8-2:GGTTATTAGTAGAAACMGGGTGTTTTTTAGT。PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。50^1感受態細胞中加入線性化的pLLB-G質粒后，分別加入三個亞型流感病毒(H1N1、H9N2和H11N9)的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段混勻，形成細胞懸浮液3-l、3-2和3-3，細胞懸浮液4-1、4-2和4-3，細胞懸浮液5-1、5-2和5-3，基因片段和線性化的pLLB-G質粒質量比為100ng:500ng。50pl感受態細胞中加入線性化的pLLB-A質粒后，分別加入三個亞型流感病毒(H1N1、H9N2和H11N9)HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段混勻，形成細胞懸浮液6-1、6-2和6-3，細胞懸浮液7-l、7-2和7-3，細胞懸浮液8-1、8-2和8-3，細胞懸浮液9-l、9-2和9-3，細胞懸浮液10-1、10-2和10-3，基因片段和線性化的pLLB-A質粒質量比為100ng:500ng。上述24個細胞懸浮液在42'C水浴熱激90秒，然后冰上放置3min，加入預熱的LB培養基900pl，置于37。C180-200rpm振搖90min，分別收集菌體，用LB液體培養基重懸菌體，取200pl24種重懸液分別涂布在LB板上(含有氨芐青霉素)，37。C培養12-16h。分別提取平板中的單克隆，利用PCR與質粒測序的方法鑒定陽性的克隆。將pLLB-G質粒的Stul位點分別插入H1N1亞型病毒的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段的重組質粒分別命名為pLLB-G-H1N1-PB2、pLLB-G-H1N1-PB1和pLLB-G-H1N1-PA。將pLLB-G質粒的Stul位點分別插入H9N2亞型病毒的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段的重組質粒分別命名為pLLB-G-H9N2-PB2、pLLB-G-H9N2-PB1和pLLB-G-H9N2-PA。將pLLB-G質粒的Stul位點分別插入H11N9亞型病毒的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段的重組質粒分別命名為pLLB-G-H11N9-PB2、pLLB-G-H11N9-PB1和pLLB-G-H11N9-PA。將pLLB-A質粒的Stul位點分別插入HlNl亞型病毒的HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段的重組質粒分別命名為pLLB-A-H1N1-HA、pLLB-A-HlNl-NP、pLLB-A-HlNl-NA、pLLB-A-HlNl-M和pLLB-A-HlNl-NS。將pLLB-A質粒的Stul位點分別插入H9N2亞型病毒的HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段的重組質粒分別命名為pLLB-A-腳2-HA、pLLB-A-H9N2-NP、pLLB-A-腳2-NA、pLLB-A-H9N2-M和pLLB-A-H9N2-NS。將pLLB-A質粒的Stul位點分別插入H11N9亞型病毒的HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段的重組質粒分別命名為pLLB-A-H11N9-HA、pLLB-A-H11N9-NP、pLLB-A-H11N9-NA、pLLB-A-H11N9-M和pLLB-A-H11N9-NS。鑒定結果表明，此質粒系統的連接陽性率較高20%-100%不等。具體數據如表l所示表1.用pLLB-A與pLLB-G構建流感病毒的反向遺傳系的效率<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2)利用pLLB-A與pLLB-G拯救流感病毒將上述pLLB-G-HlNl-PB2、pLLB-G-HlNl-PB1和pLLB-G-HlNl-PA、pLLB-A-HlNl-HA、pLLB-A-HlNl-NP、pLLB-A-HlNl-NA、pLLB-A-HlNl-M和pLLB-A-H1N1-NS質粒各0.5ug混合，得到混合物I。將上述pLLB-G-H9N2-PB2、pLLB-G-H9N2-PB1和pLLB-G-H9N2-PA、pLLB-A_H9N2-HA、pLLB-A-H9N2-NP、pLLB-A-H9N2-NA、pLLB-A-H9N2-M和pLLB-A-H9N2-NS質粒各0.5ug混合，得到混合物II。將上述pLLB-G-H11N9-PB2、pLLB-G-H11N9-PB1和pLLB-G-H11N9-PA、pLLB-A-H11N9-HA、pLLB-A-H11N9-NP、pLLB-A-H11N9-NA、pLLB-A-H11N9-M和pLLB-A-H11N9-NS質粒各0.5ug混合，得到混合物III。混合物I、n和III中分別加入1/10體積的2.5M的醋酸納，再加入2體積的95%酒精，混勻，放于冰上10min，然后4°C，13000rpm，離心15分鐘，1ml75%的酒精洗滌沉淀一次，室溫晾干，將沉淀溶于IOPL的無菌三蒸水中，分別得到上述三種亞型病毒的8種質粒混合物的水溶液。取10ullipofectamine2000(Invitrogen公司)加入到250ul的OPTI-MEMI培養基(Invitrogen公司)中，室溫放置5分鐘，獲得溶液1;將上述三種亞型病毒的8種質粒混合物的水溶液分別加入到250ul的0PTI-MEMI培養基中，獲得溶液2-1、2-2和2-3;將溶液1分別與溶液2-1、2-2和2-3，室溫孵育20分鐘，再加入500ul的OPTI-MEMI培養基，得到溶液3-1、3-2和3-3。將293T細胞與MDCK細胞(10:1)混合，6孔細胞板中培養。等待細胞長至60-80%時將細胞用PBS洗滌兩次，然后分別加入溶液3-l、3-2和3-3，37°C孵育5個小時，吸出溶液3-1、3-2和3-3，加入新鮮的OPTI-MEMI培養基(含有2.5%胰酶)，繼續培養。分別以缺少pLLB-A-H1N1-NS、pLLB-A-H9N2-NS和pLLB-A-H11N9-NS質粒的轉染樣品為陰性對照。收集培養48h的上述細胞培養液的上清，接種到10日齡的SPF雞胚，72h收取尿囊液，檢測HA效價。HA效價測定結果表明，拯救的H1N1，H9N2與H11N9細胞上清，分別接種雞胚，72后收獲尿囊液的HA效價分別達到26，29和21()。對拯救的病毒的基因HA，NA序列進行擴增測序，結果顯示序列與原始病毒的同源性均為100%。說明拯救的病毒沒有發生基因突變，繁殖特性與原始病毒一致。上述結果說明利用pLLB-A與pLLB-G反向遺傳系統質粒完全可以用于流感病毒的拯救。序列表〈110〉中國農業大學〈120>用于構建流感病毒的反向遺傳系統的載體及應用〈130>CGGNARW81622<160〉2<210〉1<211>3338〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉1atatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatg60cccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcg120ctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatceiatgggcgtggatagcggtttgact180cacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaa240atcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggta300ggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactg360cttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttccggagtac420tggtcgacctccg犯gttggggggg叫c犯3agcaggccttgtttctactaataacccgg480cggcccaaaatgccgactcggagcgaaagatatacctcccccggggccggg鄉tcgcgt540C3ccga_ccacgccgccggcccaggcgacgcgcgacacggacacctgtcccc肌8iaacgcc600accatcgcagcceicacacgg6LgCgCCCggggccctctggtcaaccccagg3ceiC3cgcgg660<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage14</formula>tgt3tgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacat25203gC3g^Ctttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaagg2580atcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttca2640gcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgca2700a^a^ggg犯taagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatat2760tattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttag2820aaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgac2880ggatcggg叫atctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccg2940catagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcga3000gcaaaatttaagcta_ca_acaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgctta3060gggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgat3120tattgactagttatt犯t3gtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatgg3180agttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgaccccc3240gcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccatt3300gacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccac3338<210>2<211>3338<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉2atatgcc33gtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatg60cccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcg120ctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgact180cacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaa240atcaacgggactttccaaaatgtcgta^c3actccgccccattgacgcaaatgggcggta300ggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactg360cttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttccggagtac420tggtcgacctccgaagttgggggggagcgaa3gc3ggccttgtttctactaataacccgg480cggcccaaaatgccgactcggagcg肌卿tatacctcccccggggccgggaggtcgcgt540C3CCg3CC3Cgccgccggcccaggcgacgcgcgacacggacacctgtcccca_a_a^acgcc600accatcgcagccacacacggagcgcccggggccctctggtcaaccccagg3C3C3CgCgg660gagcagcgccgggccggggacgccctcccggcctcgagcatgcatctagagggccctatt720ctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgc780cagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactccc840actgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattct■attctggggggtggggtggggcaggacagc犯ggggg鄉attgggaagacaatagcagg960catgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctct1020agggggtatccccacgcgccctgtagcggcgc鄉aa卿acatgtgagcaaaaggccag1080caaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgUgctggcgtttttccataggctccgcccc1140cctgacgagcatcacaaaaatcgacgctca3gtC卿ggtggcgaaacccgacaggacta1200aggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctg1260ccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgc1320tCELCgCtgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcac1380gaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaac1440ccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcg15003ggt3tgt3ggcggtgctacagagttcttgMgtggtggCctaactacgg1560aggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggt1620agctcttgatccggc8iaa_ca_aaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcag1680cagattacgcaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtct1740gacgctcagtggaa_cgaaaa_ctcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaagg1800atcttcacctagatcctttttgaagttttaaagtatatat1860gagtaaacttggtctgacagttaccaatgctt犯tcagtgaggcacctatctcagcgatc1920tgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtaga_ta_a_ctacgatacgg1980gagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggct2040ccagatttatC3gca^taa￡iccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgca2100actttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcg2160ccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcg2220tcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcc2280cccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaag2340ttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatg2400ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatag2460tgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacat2520agcagaactttaaa_a_gtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaagg2580atcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttca2640gcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagc肌aaacaggaaggcaaaatgccgca2700aaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatat2760tattga^gcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttag2820aaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgac2880ggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccg2940C3ta_gttaa_gccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcga3000gcaaaatttaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgctta3060gggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgat3120tattgactagttattaatagtaatcaattacggggtceittagttcatagcccatatatgg3180agttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacg3ccccc3240gcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccatt3300gacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccac3338權利要求1、一種環狀載體，包含原核復制起點、篩選標記基因、多聚腺苷酸加尾信號和兩個轉錄方向相同的啟動子，所述多聚腺苷酸加尾信號位于所述兩個轉錄方向相同的啟動子的下游，其特征在于所述兩個轉錄方向相同的啟動子和所述多聚腺苷酸加尾信號之間含有polI元件，所述polI元件自上游至下游依次為RNA聚合酶I啟動子、連接片段和RNA聚合酶I終止子，所述連接片段含有AGCAAAAGCAGG/CCT序列；所述polI元件的轉錄方向與所述兩個轉錄方向相同的的轉錄方向相反。2、根據權利要求1所述的載體，其特征在于所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列1。3、一種環狀載體，包含原核復制起點、篩選標記基因、多聚腺苷酸加尾信號和兩個轉錄方向相同的啟動子，所述多聚腺苷酸加尾信號位于所述兩個轉錄方向相同的啟動子的下游，其特征在于所述兩個轉錄方向相同的啟動子和所述多聚腺苷酸加尾信號之間含有polI元件，所述polI元件自上游至下游依次為RNA聚合酶I啟動子、連接片段和RNA聚合酶I終止子，所述連接片段含有AGCGAAAGCAGG/CCT序列；所述polI元件的轉錄方向與所述兩個轉錄方向相同的啟動子的轉錄方向相反。4、根據權利要求3所述的載體，其特征在于所述載體的核苷酸序列為序列表中的序列2。5、一種線性載體，是用StuI酶酶切權利要求1至4中任一所述的載體得到的線性載體。6、權利要求2或4所述載體的構建方法，包括如下步驟1)以pEGFP-Nl質粒為模板，用如下引物5'^^7TOl!(^6^Z47rC7rfi46CATGCATCTAG3，和5，J"7^77r7T7r6TCr6tn;C7^"6^3'進行PCR擴增，得到片段A;2)以pCDNA3.0質粒為模板，用如下引物5'"T7"6T^"C6^:606^Ai^A^^6T3'和5'6TCW6"M7^7T7&(^GAATTCCAGCACAC3'進行PCR擴增，得到片段B;3)將片段A和片段B導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段A和片段B連接，獲得重組載體I;4)以重組載體I為模板，用如下引物5,W6^a^r7rCC(^(X7rfi^C6^CC47^C和5，f67T(^a^67^7ra^L^C7T^6T67r6r<'進行PCR擴增，得到片段C;5)以PHH21-A或PHH21-G為模板，用如下引物5，6^CC雄67T6T6mmT(6TCC，或5，<formula>seeoriginaldocumentpage3</formula>進行PCR擴增，得到片段D或E;6)將片段C和片段D或E導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段C和片段D或E連接，獲得權利要求4所述載體。7、權利要求1至5中任一所述的載體在構建流感病毒反向遺傳系統中的應用。8、流感病毒反向遺傳系統質粒，是在權利要求1或2中任一所述載體的連接片段的AGGCTT的G和C位點間插入如下a)或b)或c)的DNA分子a)流感病毒PB2基因；b)流感病毒PB1基因；c)流感病毒PA基因。9、流感病毒反向遺傳系統質粒，是在權利要求3或4所述載體的連接片段的AGGCTT的G和C位點間插入如下1)至5)中任一DNA分子1)流感病毒HA基因；2)流感病毒NP基因；3)流感病毒NA基因；4)流感病毒M基因；5)流感病毒NS基因。全文摘要本發明公開了一種用于構建流感病毒的反向遺傳系統的載體及應用。所述載體為環狀載體，包含原核復制起點、篩選標記基因、多聚腺苷酸加尾信號和兩個轉錄方向相同的啟動子，所述多聚腺苷酸加尾信號位于所述兩個轉錄方向相反的啟動子的下游，其中，所述兩個轉錄方向相同的的啟動子和所述多聚腺苷酸加尾信號之間含有polI元件，所述polI元件自上游至下游依次為RNA聚合酶I啟動子、連接片段和RNA聚合酶I終止子，所述連接片段含有如下1)或2)的序列1)GGGGAGCGAAAGCAGG；2)GGTTATTAGTAGAAACAAGG。所述載體可用來構建流感病毒反向遺傳系統質粒，用于病毒拯救。文檔編號C12N15/64GK101343636SQ20081011970公開日2009年1月14日申請日期2008年9月5日優先權日2008年9月5日發明者劉芹防,劉金華,帥王,娟蒲,馬廣鵬申請人:中國農業大學