一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，首先活化乳酸片球菌PA003菌種于液體MRS培養基中，利用生長培養基進行培養，使其活性及存活性最佳；然后利用冷凍離心機離心法收集菌體，洗滌后，將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護劑培養基中，通過逐步冷凍法將溶液冷凍，待其結冰后準備進行冷凍干燥；最后將結冰樣品放置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥；最后獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。用本發明制備的乳酸片球菌存活率高達81.96%，復性后具有乳酸菌屬的發酵特性的同時仍保持對單核增多癥李斯特氏菌的抑菌活性，適于開發后大規模工業化生產，在食品業和飼料業中作為生物防腐劑或是飼料添加劑使用具有很大的潛力。
【專利說明】一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種冷凍干燥制劑的制備方法，特別涉及一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法及使用方法。
【背景技術】
[0002]自人類使用乳酸菌生產發酵食品以來至少已有4000多年的歷史，主要用于生產發酵乳制品、發酵蔬菜和發酵肉制品等。乳酸菌發酵食品風味獨特，對人類和動物有益生作用，甚至有些菌種具有防腐作用，這些乳酸菌在世界范圍內深受喜愛。目前，乳酸片球菌能賦予食品柔和的酸味及香氣，改進食品的品質和營養，還具有抗菌、降低膽固醇、維持微生態環境、抗腫瘤、抗變異和增強免疫力等重要生物學功能。其作為發酵菌種已經大量的在多國的食品中使用，是備受人們喜愛和接受的有益菌群。此外，其顯著的抑菌效果，使得乳酸片球菌潛藏著巨大的應用價值和廣闊的應用前景。
[0003]國內外目前對于乳酸片球菌抑菌作用的研究大多都致力于片球菌素的研究上，主要是通過各種方法獲得高效高產量的片球菌素，如:優化培養及各種條件，基因工程技術等方法來獲得高效高產量的細菌素。但作為人體有益菌的乳酸菌屬乳酸片球菌，其活菌的使用及活菌抑菌試驗的研究報道卻在國內外鮮見。本發明所用乳酸片球菌菌株(pediococcusacidilatici) PA003是天津大學化工學院周志江教授研究室的特有菌種，最初從一種發酵白菜(東北酸白菜)中分離純化得到的(已在專利CN102115720B中公開，可從天津大學化工學院食品科學系食品生物技術研究室獲取)。此乳酸片球菌PA003能發酵糖類生成片球菌素——是一種多肽的天然生物防腐劑，屬于熱穩定多肽細菌素，可以抑制很廣范圍內的革蘭氏陽性菌，具有廣譜抗菌性。而該片球菌是乳酸細菌的一個種，既能發酵一些食品，又具備防腐功能，人們還可以直接食用，其作為天然物質進行使用時比目前備受爭議的轉基因物質和人工合成物質或化合物更能得到大眾的認可和接受。
[0004]目前國內外尚未見乳酸片球菌冷凍干燥制劑研究的報道，因此，為了保證制作出的冷凍干燥制劑能穩定的長期貯藏，且復性后具有較高的存活率和較穩定的抑菌活性，以及在操作，貯藏，銷售，使用中更加方便可行，就必須針對制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的各種影響因素進行認真研究。而從技術和商業相結合的角度出發，菌種的生長及其進行冷凍干燥、復性、冷凍干燥后長期貯藏過程中受到的影響都是該冷凍干燥制劑在復性后具有高活性和高生存能力的重要研究核心。而上述研究過程中的主要的影響因素又分為:固有的內在因素，包括:細胞的大小、遺傳基因、細胞壁和細胞膜的組成；生長因素，包括:可兼容溶質積累物、胞外多糖的產生、細胞膜的變化；半致死處理；干燥培養基，包括:脫脂牛奶粉、滲透性化合物、半滲透性化合`物、不滲透的化合物；貯藏和復性，貯藏包括:氧氣、水分、溫度，復性包括:復性液的PH值、溫度、容量、營養物質成分和含量、能量物質成分和含量。因此，針對不同影響因素對于菌屬中不同的種有不同的影響結果，不同種之間的最適條件也不相同等可能出現的問題，再加上乳酸片球菌PA003菌株在制作為冷凍干燥制劑后，后期使用和長期儲存過程中必須具備抑菌活性，那么必須對冷凍干燥法制備冷凍干燥制劑及復性過程中影響乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率和抑菌活性的三大影響因素(即:生長培養基，冷凍干燥保護劑，復性條件)進行逐一研究。研制出制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的最佳方法。最終能讓乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑有效地，合理地，方便地作為天然生物防腐劑、發酵劑、飼料添加劑運用到各種食品和相關產業中。從而顯現出乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑天然，無害，無污染，安全的發酵功能和生物防腐功效。以上的所有研究發明都是具很高的研究價值和意義的。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，填補國內外乳酸片球菌冷凍干燥制劑的空白，解決乳酸片球菌菌株應用于大規模工業化生產困難的問題。
[0006]本發明是通過如下技術方案實現的:
[0007]一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0008](I)活化乳酸片球菌PA003菌種于液體MRS培養基中，利用生長培養基進行培養，使其活性及存活性最佳；
[0009](2)利用冷凍離心機離心法收集菌體，洗滌后，將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護劑培養基中，通過逐步冷凍法將溶液冷凍，待其結冰后準備進行冷凍干燥；
[0010](3)將結冰樣品放置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥；最后獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。
[0011]所述步驟(1)中生長培養基為10%(w/v)脫脂奶作為溶液基質的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養基。所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養基配方是指將葡萄糖0.66%，果糖
0.66%，蔗糖0.66%代替MRS培養基`配方的葡萄糖2%。
[0012]所述步驟(1)中接種量為1%，培養溫度37°C，培養時間14h。
[0013]所述步驟(2)冷凍干燥保護劑培養基為5%蔗糖的10%(w/v)脫脂奶溶液。
[0014]所述步驟(2)冷凍離心機轉速1000Orpm,在4°C下離心lOmin。
[0015]所述步驟(3)冷凍干燥溫度-53°C，冷凍干燥時間24h。
[0016]一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的使用方法，使用時利用生理鹽水作為復性液在22°C下進行復性30min。
[0017]本發明的有益效果為:本發明利用改良后的MRS培養基，該乳酸片球菌的生長能達到最佳。用本發明制備的乳酸片球菌存活率高達81.96%，復性后具有乳酸菌屬的發酵特性的同時仍保持對單核增多癥李斯特氏菌的抑菌活性，適于開發后大規模工業化生產，在食品業和飼料業中作為生物防腐劑或是飼料添加劑使用具有很大的潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1不同糖類(基質為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0019]圖2不同糖類(基質為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0020]圖3不同大分子聚合物(基質為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0021]圖4不同大分子聚合物(基質為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0022]圖5不同多元醇(基質為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0023]圖6不同多元醇(基質為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0024]圖7其他化合物(基質為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0025]圖8其他化合物(基質為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；[0026]圖9a復性液對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0027]圖9b復性液對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0028]圖10復性溫度對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0029]圖11復性時間對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0030]圖12乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑抑制單核增多癥李斯特氏菌CVCC1595的抑菌活性。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖對本發明作詳細說明。
[0032]實施例1
[0033]制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑
[0034](I)將貯藏于4°C下MRS斜面上的乳酸片球菌PA003菌種按1%的接種量接種于液體MRS培養基中，接種后于37°C下培養14h，將液體MRS菌懸液再按1%的接種量接種于液體生長培養基中，放置于37°C下培養14h。
[0035](2)利用冷凍離心機離心(10000rpm,4°C, IOmin),棄上清，收集固體沉淀(菌體)；用同體積已滅菌的Ringer’ s solution洗漆兩次，同樣棄上清,收集固體沉淀(菌體)；此后將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護劑培養基中，于25°C靜置lh，之后于4°C下再靜置lh，最后將其放置于-20°C靜置，待其結冰后準備進行冷凍干燥。
[0036](3)將結冰樣品放置于冷凍干燥機中(_53°C )進行冷凍干燥24h ;獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。
[0037]實施例2
[0038]乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的存活率
[0039]( I)冷凍干燥前乳酸片球菌菌株的活菌計數:在上述25°C靜置Ih后，從冷凍干燥保護劑培養基中各取出ImL該保護劑的菌懸液加入到9mL已滅菌的生理鹽水中，將其經過適當稀釋后，即達到10_6、10_7時，將該稀釋梯度下的菌懸液各取100 u L加到MRS固體培養基平皿上進行菌落涂布(相鄰兩個梯度各涂布3塊平皿)，涂布好的平皿放置于37°C下培養48h，之后進行平板菌落計數。存活的菌落數用cfu/mL來表示。
[0040](2)冷凍干燥后，立刻用同體積的復性液對冷凍干燥制劑進行復性，使其在復性條件下形成復性菌懸液。從該復性菌懸液中各取出ImL菌懸液加入到9mL已滅菌的生理鹽水中，將其經過適當稀釋后達到10_6、10_7，將該稀釋梯度下的菌懸液取IOOyL加到MRS固體培養基平皿上進行菌落涂布(相鄰兩個梯度各涂布3塊平皿)，涂布好的平皿放置于37°C下，培養48h后進行菌落計數。存活的菌落數用cfu/mL來表示。
[0041](3)存活率是通過冷凍干燥前(No)，后(Nf)對應的MRS固體培養皿上菌落數的比值來表示的:存活率(V) %= (Nf/No) X 100兩次平行試驗的數值利用Software SPSS 18.0統計學軟件來進行處理，方差分析用一般線性模型(GLM)方差分析；多重比較利用新復極差法進行分析。
[0042]實施例3
[0043]乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的抑菌活性
[0044]把冷凍干燥后的乳酸片球菌PA003從復性液中接種到MRS固體培養皿中，放置于37°C下培養24h，待其長出肉眼可見菌落；在50°C左右的5mL半固體TSYEB中接入I y L單核增多癥李斯特氏菌CVCC1595，將其混勻后傾倒入上述已長出肉眼可見菌落的MRS固體培養皿中，使該層半固體培養基平鋪于固體MRS培養基之上，之后將該平板放置于37°C下培養12h，觀察是否在乳酸片球菌菌落周圍出現抑菌圈。(圖12)
[0045]由圖12看出，制作出的冷凍干燥制劑進行復性后，對存活的乳酸片球菌PA003進行抑菌試驗，發現該菌落周圍都可以看到清晰的抑菌圈，表明該冷凍干燥制劑仍具有穩定的抑菌活性。 [0046]實施例4
[0047]優化制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑制備過程中的各影響因素
[0048](1)在制備冷凍干燥制劑過程中通過利用兩因素全面實驗，對乳酸片球菌菌株的生長培養基進行優化，最終選擇出最佳制備冷凍干燥菌制劑的生長培養基，即10%(w/v)脫脂奶作為溶液基質的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養基。(表1、2、3、4)
[0049]表1不同生長培養基
[0050]
【權利要求】
1.一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)活化乳酸片球菌PA003菌種于液體MRS培養基中，利用生長培養基進行培養，使其活性及存活性最佳； (2)利用冷凍離心機離心法收集菌體，洗滌后，將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護劑培養基中，通過逐步冷凍法將溶液冷凍，待其結冰后準備進行冷凍干燥； (3)將結冰樣品放置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥；最后獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。
2.根據權利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中生長培養基為10%(w/v)脫脂奶作為溶液基質的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養基。
3.根據權利要求2所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養基配方是指將葡萄糖0.66%，果糖0.66%，蔗糖0.66%代替MRS培養基配方的葡萄糖2%。
4.根據權利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中接種量為1%，培養溫度37°C，培養時間14h。
5.根據權利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)冷凍干燥保護劑培養基為5%蔗糖的10%(w/v)脫脂奶溶液。
6.根據權利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)冷凍離心機轉速1000Orpm,在4°C下離心lOmin。
7.根據權利要求1所述乳酸片球菌菌`株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)冷凍干燥溫度-53°C，冷凍干燥時間24h。
8.一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的使用方法，其特征在于，使用時利用生理鹽水作為復性液在22°C下進行復性30min。
【文檔編號】C12N1/04GK103627637SQ201310631973
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】韓燁, 洪小迪, 譚茜倩, 周志江 申請人:天津大學