一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒及其操作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒及其操作方法，包括A液和B液，A液和B液均是包含0.1M氯化鈉的0.1M?Tris緩沖液，A液中包含羧基化磁珠，B液中包含羧基化微球，它們均通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA一半互補序列的單鏈DNA鏈接在磁珠或微球上。與傳統光波導生物傳感器比較，本案所涉及的試劑盒能夠實現重復利用；本發明采用的方法，能夠在溶液中快速檢測出游離的miRNA，過程更簡單，效率更高，并且能夠高通量的檢測樣品；通過連接微球，能夠顯著改變光波導免疫傳感器中諧振腔的折射率，提高檢測靈敏度。
【專利說明】—種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒及其操作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學體外檢測領域，特別涉及一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒及其操作方法。
【背景技術】
[0002]MicroRNA(miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控。到目前為止，在動植物以及病毒中已經發現有4361個miRNA分子。由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究非常困難，多數研究人員采用Northern BlOts——種技術復雜而費力的方法來檢測小分子RNA的存在。傳統的Northern Blot的方法是是用探針檢測固相支持物(膜)上的目標分子，由于用探針檢測液相中的目標分子遠比檢測固相中的目標更為靈敏，近來又發展了一種基于核酶保護分析方法改進的新方法一將同位素標記好的小分子RNA探針和待檢測樣品混合雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并純化雜交的RNA分子，最后通過變性膠電泳放射自顯影檢測結果。上述方法都存在技術復雜、費用高昂的缺點。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒及其操作方法，這種試劑盒與配套的光波導免疫傳感器(CN101846674B)配合使用，能夠高速、高靈敏度的檢測出液體中游離的miRNA分子。同時，該試劑盒還能夠回收重復利用，大大降低了檢測成本。
[0004]本發明提供一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒，包括A液和B液，其中:`[0005]所述A液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液,所述A液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA 一半互補序列的單鏈DNA鏈接在磁珠上；
[0006]所述B液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，所述B液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA另一半互補序列的單鏈DNA鏈接在微球上。
[0007]優選地，所述的用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒，所述A液和B液中，Tri s緩沖液的PH均為7.3。
[0008]本發明還提供一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒的操作方法，包括以下步驟:
[0009]I)將光波導免疫傳感器開啟，先通入A液，所述A液是包含0.1M氯化鈉的0.1MTris緩沖液，所述A液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA —半互補序列的單鏈DNA鏈接在磁珠上；在光波導免疫傳感器的電磁場作用下，所述羧基化的磁珠被吸附在光波導免疫傳感器的諧振腔外，產生基底光波導信號；
[0010]2)隨后將待測樣品與B液等體積混合得到混合液，所述B液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，所述B液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA另一半互補序列的單鏈DNA鏈接在微球上；將所述混合液通入光學通道，此時步驟I)中吸附在諧振腔外的磁珠與混合液中的微球通過待測樣品中游離的miRNA結合在一起，以此改變諧振腔的折射率，使諧振腔內的光波導信號發生變化；
[0011]3)配制至少四個含不同濃度的游離miRNA標準液，每個標準液按步驟I)和2)的操作方法得到兩個光波導信號值，以miRNA濃度為橫坐標，兩次光波導信號值差值為縱坐標，繪制標準曲線；
[0012]4)將步驟1)和2)所得待測樣品的兩次光波導信號值差值與所述標準曲線比對，定量檢測出待測樣品中游離miRNA的存在及其濃度。
[0013]優選地，所述的用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒的操作方法，所述A液和B液中，Tris緩沖液的pH均為7.3。
[0014]本發明的有益效果是:與傳統光波導生物傳感器比較，本發明采用的方法能夠實現試劑盒的重復利用；與傳統miRNA檢測方法相比，本發明采用的方法，能夠在溶液中快速檢測出游離的miRNA，過程更簡單，效率更高，并且能夠高通量的檢測樣品；通過連接微球，能夠顯著改變光波導免疫傳感器中諧振腔的折射率，提高檢測靈敏度；在檢測結束后撤去電磁場，流動液可帶出通道內的磁珠與微球，通過吸附、離心等技術手段，能夠實現試劑盒主要成分的回收再利用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為本發明所述用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒的工作原理示意圖。【具體實施方式】
[0016]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0017]作為本發明的一個較優實施方案，其所涉及的用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒，包括A液和B液，其中:
[0018]A液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，該A液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的磁珠；羧基化的磁珠通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA半互補序列的單鏈DNA鏈接在磁珠上；Tris緩沖液的pH為7.3。
[0019]B液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，該B液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的微球，該微球不帶磁性；羧基化的微球通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA另一半互補序列的單鏈DNA鏈接在微球上；Tris緩沖液的pH為7.3。
[0020]A液和B液中氯化鈉的作用是穩定雙螺旋結構，增強核酸的熱穩定性。
[0021]本發明所涉及的用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒的操作方法，包括以下步驟:[0022]I)將與該試劑盒相配套的光波導免疫傳感器(CN101846674B)開啟，先通入A液，該A液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，A液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的磁珠；羧基化的磁珠通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA —半互補序列的單鏈DNA鏈接在磁珠上；Tris緩沖液的pH為7.3 ;在光波導免疫傳感器的電磁場作用下，羧基化的磁珠被吸附在光波導免疫傳感器的諧振腔外，產生基底光波導信號；
[0023]2)隨后將待測樣品與B液等體積混合得到混合液，B液是包含0.1M氯化鈉的0.1MTris緩沖液，該B液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的微球；羧基化的微球通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA另一半互補序列的單鏈DNA鏈接在微球上；Tris緩沖液的pH為7.3 ;將混合液通入光學通道，此時步驟I)中吸附在諧振腔外的磁珠與混合液中的微球通過待測樣品中游離的miRNA結合在一起，以此改變諧振腔的折射率，使諧振腔內的光波導信號發生變化；
[0024]3)配制至少四個含不同濃度的游離miRNA標準液，每個標準液按步驟I)和2)的操作方法得到兩個光波導信號值，以miRNA濃度為橫坐標，兩次光波導信號值差值為縱坐標，繪制標準曲線；
[0025]4)將步驟I)和2)所得待測樣品的兩次光波導信號值差值與所述標準曲線比對，定量檢測出待測樣品中游離miRNA的存在及其濃度。
[0026]實施例1
[0027](I)試劑盒A液及B液配制
[0028]分別制 備直徑為90nm的羧基化磁珠和90nm的羧基化微球，分別在其上偶聯miR-141 的配對 DNA 半序列 5’ -GCCAACCCAGTGUUTATTGTGACATTGTGACAGA 及 5’ -CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCATTTCTACC。
[0029]具體的來說，上述DNA半序列均進行末端氨基修飾，單鏈DNA與磁珠和微球的偶聯通過EDC-NHS法，即碳化二亞胺法。A液包含直徑為90nm的羧基化磁珠及其偶聯的半序列5’ -GCCAACCCAGTGUUTATTGTGACATTGTGACAGA ；B液包含直徑為90nm的羧基化微球及其偶聯的半序列5’-CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCAITTCTACC，上述磁珠和微球均分別懸浮在A液和B液中，A液和B液均為0.1M的Tris緩沖液，pH為7.3，同時含有0.1M的NaCl。
[0030](2)試劑盒應用
[0031]光波導免疫傳感器開啟后，先使用A液通入，在電磁場作用下，磁珠被吸附在諧振腔外，產生基底光波導信號。之后將待測樣品與B液等體積混合，并通過光學通道。此時分別連有目標RNA —半互補序列的磁珠與微球,通過目標RNA,吸附后的磁珠與溶液中的微球能夠結合在一起，以此改變諧振腔的折射率，從而使諧振腔內的光波導信號產生變化。
[0032]配制四個含不同濃度的miR-141標準液，每個標準液按上述的操作方法得到兩個光波導信號值，以miR-141的濃度為橫坐標，兩次光波導信號值差值為縱坐標，繪制標準曲線；將待測樣品的兩次光波導信號值差值與標準曲線比對，能夠快速、高靈敏度地定量檢測出待測樣品中游離miR-141的存在及濃度。
[0033]實施例2
[0034](I)試劑盒A液及B液配制
[0035]分別制備直徑為150nm的羧基化磁珠和150nm的羧基化微球，分別在其上偶聯miR-199 的配對 DNA 半序列 5’ -GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGATTATGACAGA 及 5’ -CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCATTTTGGCA。
[0036]具體的，上述DNA半序列均進行末端氨基修飾，單鏈DNA與微球的偶聯通過EDC-NHS法。A液包含直徑為150nm的羧基化磁珠及其偶聯的半序列5’-GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGATTATGACAGA ;B液包含直徑150nm的羧基化微球及其偶聯的半序列5’_CUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACCCATTTTGGCA，上述磁珠和微球均分別懸浮在A液和B液中，A液和B液均為0.1M的Tris緩沖液，pH為7.3，同時含有0.1M的NaCl。
[0037](2)試劑盒應用
[0038]光波導免疫傳感器開啟后，先使用A液通入，在電磁場作用下，磁珠被吸附在諧振腔外，產生基底光波導信號。之后將待測樣品與B液等體積混合，并通過光學通道。此時分別連有目標RNA —半互補序列的磁珠與微球,通過目標RNA,吸附后的磁珠與溶液中的微球能夠結合在一起，以此改變諧振腔的折射率，從而使諧振腔內的光波導信號產生變化。
[0039]配制六個含不同濃度的miR-199標準液，每個標準液按上述的操作方法得到兩個光波導信號值，以miR-199的濃度為橫坐標，兩次光波導信號值差值為縱坐標，繪制標準曲線；將待測樣品的兩次光波導信號值差值與標準曲線比對，能夠快速、高靈敏度地定量檢測出待測樣品中游離miR-199的存在及濃度。
[0040]盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖`例。
【權利要求】
1.一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒，其特征在于，包括A液和B液，其中: 所述A液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，所述A液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA 一半互補序列的單鏈DNA鏈接在磁珠上； 所述B液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，所述B液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA另一半互補序列的單鏈DNA鏈接在微球上。
2.根據權利要求1所述的用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒，其特征在于，所述A液和B液中，Tris緩沖液的pH均為7.3。
3.一種用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒的操作方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將光波導免疫傳感器開啟，先通入A液，所述A液是包含0.1M氯化鈉的0.1M Tris緩沖液，所述A液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的磁珠；所述羧基化的磁珠通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA —半互補序列的單鏈DNA鏈接在磁珠上；在光波導免疫傳感器的電磁場作用下，所述羧基化的磁珠被吸附在光波導免疫傳感器的諧振腔外，產生基底光波導信號； 2)隨后將待測樣品與B液等體積混合得到混合液，所述B液是包含0.1M氯化鈉的0.1MTris緩沖液，所述B液中還包含直徑為90~150nm的羧基化的微球；所述羧基化的微球通過碳化二亞胺法將末端氨基修飾的含有目標miRNA另一半互補序列的單鏈DNA鏈接在微球上；將所述混合液通入光學通道，此時步驟I)中吸附在諧振腔外的磁珠與混合液中的微球通過待測樣品中游離的miRNA結合在一起，以此改變諧振腔的折射率，使諧振腔內的光波導信號發生變化；` 3)配制至少四個含不同濃度的游離miRNA標準液，每個標準液按步驟I)和2)的操作方法得到兩個光波導信號值，以miRNA濃度為橫坐標，兩次光波導信號值差值為縱坐標，繪制標準曲線； 4)將步驟I)和2)所得待測樣品的兩次光波導信號值差值與所述標準曲線比對，定量檢測出待測樣品中游離miRNA的存在及其濃度。
4.根據權利要求3所述的用于檢測液體中游離miRNA的試劑盒的操作方法，其特征在于，所述A液和B液中，Tris緩沖液的pH均為7.3。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773852SQ201310731048
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】陳名利, 殷建, 白鵬利, 王帆 申請人:中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所