一株木糖氧化無色桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株對無機三價砷有氧化作用和甲其化作用的木糖氧化無色桿菌GD03及其在修復苗期水稻砷毒害方面的初步應用，該菌株于2013年11月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，其保藏號為CGMCCNo.8512。本發明的特征是從砷污染模擬稻田土壤中富集分離得到一株對無機三價砷有氧化和甲基化作用的木糖氧化無色桿菌GD03。該菌株可以將砷污染環境中的無機三價砷氧化為五價砷，且具有甲基化功能，極大地降低了環境中高毒性三價砷的毒性并增強了砷污染物的可吸附去除性。
【專利說明】一株木糖氧化無色桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境微生物【技術領域】，具體涉及一株對無機三價砷有氧化作用的木糖氧化無色桿菌GD03的篩選及其在緩解苗期水稻生長砷毒害方面的用途。
【背景技術】
[0002]砷污染已成為全球面臨的一個嚴重環境問題。據報道，目前世界范圍內亞洲國家砷污染最為嚴重，特別是孟加拉國、印度、中國等(Y.G.Zhu, et al.Exposure toinorganic arsenic from rice: A global health issue Environmental Pollution,2008，154(2): 169-171)。在我國，由于礦山排放和工農業生產所使用的各種含砷化學物質等因素使土壤、地下水、飲用水中砷含量不斷升高，最終通過“土壤/水一植物體/動物體—人體”食物鏈被富集和攝入，嚴重危害人體健康。
[0003]當前國內外對于砷污染的治理主要采用物理、化學、植物修復法和微生物修復法(M.1.Litter, et al.Possible treatments for arsenic removal in LatinAmerican waters for human consumption.Environmental Pollution, 2010, 158(5):1105-1118)。吸附、過濾、客土法等物理方法耗時、費用高，不利于大規模凈化；化學沉淀、化學氧化/還原成本高、易于帶入二次污染；植物修復法(如蜈蚣草)可以將土壤中高濃度的砷污染物富集到體內，但是，不適宜砷污染地下水的處理，而且，砷超富集植物的種植和后續處理工作量也比較大；微生物修復法主要利用微生物對重金屬離子的氧化/還原、甲基化/去甲基化等代謝作用達到砷污染治理的目的，是一種廉價、安全又最有效的修復方式且不會造成環境結構的破壞，符合可持續發展的需要，是當前最有前景的一種砷污染治理方法(蔡林，王革嬌.凈化砷污染的木糖氧化無色桿菌SY8及用途.2007，專利號:ZL200710052064.6)。但是，該法常需結合土壤或活性污泥對五價無機砷的強吸附性才能達到高去除率，而環境中高毒性的三價砷因不帶電荷不易從環境中去除，所以，處理含砷的廢水、污灌水、土壤時，迫切需要將三價砷高效氧化成五價砷，而化學氧化法又往往效率不夠高，實踐中迫切需要解決這一技術瓶頸，高效砷氧化菌是一個很好的選擇。
[0004]砷污染物的毒性和遷移性與它在環境中的化學形態密切相關。環境中高毒性的砷污染物主要以三價無機砷和五價無機砷存在，其中，三價無機砷在環境介質PH值下不帶電荷，不易被吸附去除，移動性強，毒性遠遠高于五價無機砷，本發明的木糖氧化無色桿菌GD03可以將高毒性的三價砷高效氧化為易被吸附去除、弱毒性的五價砷，不但大大降低了環境中砷的毒性，抑制了高毒性三價砷在環境一生物系統的遷移，而且可以配合新興的微生物活性污泥法，達到對砷污染環境的凈化。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一株對無機三價砷有氧化作用和甲其化作用的木糖氧化無色桿菌GD03及其在修復苗期水稻砷毒害方面的初步應用。本發明的特征是從砷污染模擬稻田土壤中富集分離得到一株對無機三價砷有氧化和甲基化作用的木糖氧化無色桿菌GD03。該菌株可以將砷污染環境中的無機三價砷氧化為五價砷，且具有甲基化功能，極大地降低了環境中高毒性三價砷的毒性并增強了砷污染物的可吸附去除性。本發明菌株被命名為木糖氧化無色桿菌⑶03 (Achromobacter xylosoxidants),是一種新發現的砷氧化菌，其保藏號為CGMCC N0.8512。初步研究表明，本發明的菌株在修復苗期水稻砷毒害方面具有較好的應用前景。
[0006]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一株木糖氧化無色桿菌，該菌株被命名為木糖氧化無色桿菌GD03，屬一種木糖氧化無色桿菌Achromobacter xylosoxidans,該菌株于2013年11月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，其保藏號為CGMCC N0.8512。
[0007]該菌株可應用于修復苗期水稻砷毒害方面。
[0008]先采集中國福建省福州市某地稻田土壤樣品，加入一定濃度NaAsO2 (As(III)),按照As(III)濃度逐漸增加的方式(見后面的詳細描述，下同)進行富集培養，再對富集培養的土樣進行稀釋并接種于含有一定濃度As (III)的液體培養基中，培養長出砷抗性菌，挑取不同形態的菌落劃線得單克隆，先用AgNO3氧化法定性檢測單克隆砷抗性菌的砷氧化倉泛力(M.C.Lett, et al.A simple and rapid method for arsenite and arsenatespeciation.1n: Ciminelli VST, Garcia 0, Jr.(eds.), Biohydrometallurgy:Fundamentals, Technology and Sustainable Development.Part B Biosorption andBioremediation Chapter IV，1st edition.Elsevier Science.2001, New York, NY.PP.541-546)，再用毛細管電泳-電感耦合等離子體質譜(CE-1CP-MS)聯用技術定量分析單克隆砷抗性菌的砷氧化能力，獲得具有砷氧化能力的砷氧化菌，再對篩選出的砷氧化菌做形態學和16S核搪體RNA基因(16S rDNA)等相關鑒定工作，最終得到木搪氧化無色桿菌⑶03。
[0009]木糖氧化無色桿菌⑶03的保藏:
木糖氧化無色桿菌GD03可以在LB或培養基E的液體或固體培養基上28°C培養，培養后可在4°C下作短期保藏。若長期保藏，使用甘油冷凍管保藏菌株更合適。
[0010]本發明的優點在于:
據報導，無機三價砷的毒性遠遠高于無機五價砷，是強致癌性物質，在環境介質pH〈9情況下，無機三價砷均以分子型體存在，具有很強的移動性，易于毒害其中生長的生物體，不易去除。本發明分離篩選到的木糖氧化無色桿菌GD03可以將無機三價砷氧化為無機五價砷，無機五價砷在環境介質pH>2情況下，均以陰離子形體存在，易于被吸附去除，極大地降低了環境中高毒性砷污染物的危害。本發明菌株是從稻田土砷污染模擬土樣中分離篩選得到的，對砷污染環境具有較強的抗性和適應性，有望在修復稻田砷污染方面發揮重要作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1:是本發明的木糖氧化無色桿菌GD03的砷氧化曲線圖，X軸代表時間(小時)，Y軸左邊代表木糖氧化無色桿菌⑶03的吸光度值(OD6tltl)，Y軸右邊代表砷氧化率(%)。
[0012]圖2:是本發明的木糖氧化無色桿菌GD03的掃描電鏡照片，放大倍數和比例尺在圖中已標明。【具體實施方式】
[0013]實施例1:從砷污染模擬土壤中分離木糖氧化無色桿菌GD03
實驗土壤取自福建省福州市某地稻田土的表層土壤，按照I g As (III)/kg土的比例加入NaAsO2,混合均勻后于暗處放置3個月，獲得砷污染模擬土樣，具體操作步驟如下:
(I)砷抗性菌富集:精確稱取砷污染模擬土樣I g于裝有150 ml含25 mg As(III)/L滅菌富集培養基的三角瓶中，30°C搖床培養(128 rpm) 一周，觀察菌株生長情況。當培養基出現渾濁時，按10%比例(體積比)依次接種于下一個更高As (III)濃度的富集培養基中，As(III)的濃度分別為 50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L,400 mg/L,以達到富集的目的。將最后一個富集培養基用無菌水稀釋100倍，取0.2 ml稀釋液，接種于含400 mg As(III)/L的液體培養基D中，長出的菌株為砷抗性菌，置4°C冰箱中待用。富集培養基參照Santini等的配方作進一步改進后進行配制(J.M.Santini, et al.A newchemolithoautotrophic arsenite—oxidizing bacterium isolated from a gold mine:Phylogenetic, Physiological and preliminary bioehemical studies.Applied andEnvironmental Microbiology, 2000, 66(1): 92-97),配方如下:100ml 富集培養基由99.38ml溶液Α，0.IOml溶液Β、0.50ml溶液C和0.02ml酵母抽提物組成，最終pH值為8.0。IOOml含400 mg As (III)/L的液體培養基D由99.86ml溶液A，0.1Oml溶液B和0.04ml酵母抽提物組成，最終pH值也是8.0。其中，溶液A(Na2S04.IOH2O, 0.07 g/L; (NH4)2SO4, 0.1g/L; KCl, 0.05 g/L; MgCl2.6H20, 0.04 g/L; CaCl2.H2O, 0.05 g/L; KH2PO4, 0.17 g/L; NaHCO3, 0.5 g/L; NaAsO2, 0.025?0.4 g As (III)/L)，溶液B (Na2EDTA.2Η20, 5.2 g/L,FeCl2.4H20, 1.5 g/L, ZnCl2, 0.07 g/L, MnCl2.4H20, 0.1 g/L, CoCl2.6H20, 0.19 g/L, CuCl2 *2H20, 0.017 g/L, NiCl2 *6H20, 0.024 g/L, H3BO3, 0.062 g/L, Na2MoO4 *2H20,
0.036 g/L)，溶液 C(維生素 B，0.01 g/L,核黃素，0.04 g/L;維生素 B1, 0.02 g/L,維生素 B5, 0.12 g/L,煙硫胺，0.2 g/L,維生素 H12, 0.04 g/L,維生素 Η, 0.2 g/L,維生素H6, 0.02 g/L, /7-氨基苯酸，0.02 g/L)，所有溶液用去離子水配制，溶液A 121°C滅菌20分鐘，溶液B和溶液C過濾滅菌。
[0014](2)劃線分離:將步驟(2)中得到的砷抗性菌挑取不同的菌落劃線，確保得到單克隆。劃線用培養基D平板，每次置30°C溫箱中倒置培養2天，待菌長出后，再反復劃線分離，直至獲得單克隆菌株，將單克隆菌株置4°C冰箱中待用并用甘油冷凍管保存一份于-80°C冰箱。培養基D平板配方如下:稱2g瓊脂，加IOOml含400 mg As (III) /L的液體培養基D，121°C滅菌20分鐘。
[0015](3)砷氧化菌篩選:本發明同時采用2種技術方案進行砷氧化菌的篩選，一個是AgNO3氧化法，另一個是CE-1CP-MS聯用技術。
[0016]a、AgN03氧化法:挑取步驟(3)中的單克隆菌株，于培養基D平板上進行劃線培養，培養2天后，用質量濃度為0.1%的AgNO3溶液漫布培養基D以檢查砷抗性菌的砷氧化能力，以培養基的黑度強弱來評價單克隆砷抗性菌對三價砷的氧化能力大小，黑度越大，菌株氧化三價砷的能力越強，反之越小(因為Ag+與AsO43-沉淀的顏色比Ag+與AsO2-沉淀的顏色更深，所以，培養基D中如果存在NaAsO2,則與Ag+反應后，生成沉淀的黑度弱，反之，則黑度強)。[0017]b,CE-1CP-MS聯用技術:挑取步驟(3)中的單克隆菌株至最適液體培養基E中，添加NaAsO2，使培養基中As(III)濃度達到200mg/L，同時，以不添加單克隆砷抗性菌的培養基為對照，培養24小時，離心，取培養基上清液，過0.22 μ m聚乙烯濾膜，按照楊桂娣等的報導測定三價砷和五價砷的含量(G.D.Yang, et al.Speciation analysis of arsenicin Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillary electrophoresis—inductivelycoupled plasma mass spectrometry.Talanta, 2009, 78(2): 471-476),分析單克隆砷抗性菌的砷氧化能力。培養基E配方如下:100ml最適液體培養基E中含0.3g 4-輕基苯甲酸、Ig蛋白胨、0.5gNaCl和0.02g As (III)，超聲溶解后，用氫氧化鈉固體調pH值至8。
[0018]根據AgNO3氧化法中瓊脂培養基的黑度和CE-1CP-MS聯用技術中測定的三價砷和五價砷含量的比例共同篩選具有高效三價砷氧化能力的砷氧化菌。
[0019](4)砷氧化菌的分類鑒定:一是利用16S rDNA鑒定，即采用原核生物16S rDNA通用引物 27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和 1492R (5' GGYTACCTTGTTACGACTT3')做PCR 擴增其 16S rDNA (PCR 反應程序為:94°C預變性 5min，94°C，30s，50°C，45s，72°C，70s，32個循環后，72°C延伸lOmin)。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，直接送上海鉬尚生物技術有限公司測序，再與國際NCBI GenBank(www.ncb1.nlm.nih.gov)核苷酸數據庫比對，核苷酸同源性為99%,鑒定為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) ;二是利用掃描電鏡形態鑒定(見附圖2)、革蘭氏染色分析和生長特性鑒定。菌學特征如下:菌體短桿狀，長0.6-0.9// m，寬0.3-0.5 //m,革蘭氏陰性菌，適宜生長溫度20_40°C，適宜pH7-10，兼性好氧，在LB、培養基D和培養基E等固體培養基上均為白色、圓形、突起的菌落。
[0020]實施例2:木糖氧化無色桿菌GD03的砷氧化曲線
挑取木糖氧化無色桿菌⑶03單克隆，接種到IOOml含100mgAs(III)/L的最適液體培養基E中，置28°C搖床中振蕩培養48小時，以5%的接種量從中吸取5ml到IOOml新鮮含150mgAs(III)/L的最適液體培養基E中，置28°C搖床中振蕩培養24小時，再從中吸取5ml到IOOml新鮮含200mgAs(III)/L的最適液體培養基E中，置28°C搖床中振蕩培養24小時，此時⑶03的OD6tltl約為0.8左右，保存在4°C冰箱，作為種子菌液用于接種。以5%的接種量從種子菌液中吸取5ml到IOOml新鮮含IOOOmgAs (III)/L的最適液體培養基E中，置28°C搖床中振蕩培養9小時后開始取樣,每隔I小時取一次樣,直至As (III)完全氧化為止，每次分別取L 2ml和0.5ml，用分光光度法測定⑶03的0D_，現取現做；用CE-1CP-MS聯用技術測定最適液體培養基E中無機三價砷和無機五價砷的濃度,取樣后，三天內完成測定。具體做法如下:一是測定⑶03的生長指標0D_，以未添加⑶03的最適液體培養基E作為參比溶液，每次取1.2ml，直接測定其在600nm處的吸光值。二是無機三價砷和五價砷濃度，取0.5ml，離心，上清液過0.22 u m聚乙烯濾膜，按照楊桂娣等的報導測定含⑶03的最適液體培養基E中三價砷和五價砷的含量(G.D.Yang, et al.Speciationanalysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillaryelectrophoresis-1nductiveIy coupled plasma mass spectrometry.Talanta, 2009，78(2): 471-476)。繪制的木糖氧化無色桿菌GD03砷氧化曲線見附圖1。
[0021 ] 實施例3:木糖氧化無色桿菌GD03在模擬砷污染水稻水培液中對三價砷的氧化效果
采用水稻常規N、P、K營養水培液(含N 23mg/L、P 7mg/L、K 21mg/L)作為對照，參照我國砷污染地下水最大含砷水平大約為2-3 mg/L,往水稻水培營養液中加NaAsO2,使水培液中三價砷濃度達到3mg/L，設計水稻水培營養液中不同接種比例的木糖氧化無色桿菌⑶03，考察⑶03對三價砷的氧化效果。具體做法如下:準備8個250ml三角瓶，4個裝100ml水稻常規N、P、K營養水培液(121°C滅菌20分鐘)，其余4個分別裝100ml不滅菌的水稻常規N、P、K營養水培液，按照0%、0.25%,0.50%和1%的接種比例(體積比)，往三角瓶中補加木糖氧化無色桿菌GD03的培養菌體，每瓶再補加NaAsO2母液，使三價砷終濃度達到3mg/L，置28°C搖床中振蕩培養24小時，取樣，離心，過0.22 μ m聚乙烯濾膜，按照楊桂娣等的報導測定水培液中三價砷和五價砷的含量(G.D.Yang, et al.Speciationanalysis of arsenic in Mya arenaria Linnaeus and Shrimp with capillaryelectrophoresis-1nductiveIy coupled plasma mass spectrometry.Talantaj 2009，78(2): 471-476)，分析⑶03的砷氧化能力。結果見表1。
[0022]表1 CE-1CP-MS聯用法檢測模擬砷污染水稻水培液中的結果
【權利要求】
1.一株木糖氧化無色桿菌，其特征在于:一株砷氧化細菌，該菌株被命名為木糖氧化無色桿菌⑶03,屬一種木糖氧化無色桿菌JcAroffioAacter xylosoxidans,該菌株于2013年11月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，其保藏號為CGMCC N0.8512。
2.如權利要求1所述的一株木糖氧化無色桿菌的應用，其特征在于:可應用于修復苗期水稻砷毒害方面。
【文檔編號】C12N1/20GK103834589SQ201410013543
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】楊桂娣, 邱宗清, 黃怡, 楊孝軍, 林文雄 申請人:福建農林大學