一株降解鄰苯二甲酸二異辛酯的無色桿菌(Achromobacter sp. )MT-H的制作方法
【專利說明】—株降解鄰苯二甲酸二異辛酯的無色桿菌(Achromobacter
sp.)MT-H
技術領域
[0001]本發明涉及環境污染物生物處理技術領域，具體地，涉及一株新型鄰苯二甲酸二辛醋降解菌，更具體地，涉及一株降解鄰苯二甲酸二異辛醋的無色桿菌iAchromobactersp.)MT-H0
【背景技術】
[0002]鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫PAEs，是鄰苯二甲酸形成的酯的統稱。其中，鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)是一種典型的鄰苯二甲酸酯類物質，在人們日常生活中用途非常廣泛，特別是作為塑料添加劑，在重量上可達20?50%。由于塑料制品中DEHP極易轉移進入環境，從而廣泛存在于大氣、水體、土壤以及生物體中。DEHP在鄰苯二甲酸酯類物質中毒性最強，可以通過各種途徑進入生物體內，嚴重干擾其內分泌、生殖及神經系統，并具有極強的致畸性、致突變性、致癌性。目前，DEHP已成為全球最普遍的污染物之一，并被美國國家環保局和中國環境監測總站列為優先控制污染物。
[0003]自然環境中DEHP的水解、光解和揮發速率非常緩慢，生物降解成為其從環境中消失的主要途徑。但由于DEHP的側鏈較長，盡管土壤中存在許多能降解DEHP的菌種，其自然降解能力也極弱，遠遠不能滿足DEHP環境污染治理的需要。因此，對DEHP的處理有待于尋求高效降解菌。
[0004]目前對于微生物降解DEHP，國內外已經開展了大量研宄。例如，Kim等篩選分離出的一株尖孢鐮刀菌，及Chao和Cheng等分離出的一株紅球菌均對DEHP均具有良好的降解效果。但已報道的菌株對DEHP的降解速率還不能滿足實際污染控制的要求，且有關能降解DEHP的無色桿菌種質資源鮮有報道。
【發明內容】
[0005]本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一株新型鄰苯二甲酸二異辛酯降解菌。
[0006]為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的:
一株無色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H，所述菌株于2015年I月22日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO: M 2015058，保藏地址為:中國武漢武漢大學，菌株分類命名為Achromobactersp.MT-H。
[0007]本發明所述無色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H來源于廣州市大坦沙城市污水處理廠的回流污泥，經人工富集培養、分離純化得到。該菌株對DEHP具有很高的降解效率，且在較寬的pH和溫度范圍內均能較好地降解DEHP，證明MT-H菌株可以作為優良的DEHP降解菌應用于DEHP污染的生物處理方面。
[0008]無色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H在LB培養基上培養七天的菌落為圓形，微凸起，淡黃色，濕潤，半透明，邊緣整齊，光滑。掃描電鏡下多為球狀或橢球狀，直徑為0.5—1 μ m0
[0009]無色桿菌{Achromobactersp.)菌株 MT-H 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:1所示，通過NCBI官方網站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序與其他已登錄細菌菌株16S rDNA序列進行比對，結果表明該菌株與相似性最高，同源率達99%。
[0010]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
本發明提供了一株高效降解DEHP的新菌株一無色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H，豐富了鄰苯二甲酸酯降解菌的種質資源庫，而且該菌在較寬的pH和溫度范圍內均能較好地降解DEHP，證明MT-H菌株可以作為優良的DEHP降解菌應用于DEHP污染的生物處理方面。
【附圖說明】
[0011]圖1為MT-H菌在LB培養基上培養7天的生長形態特征。
[0012]圖2為MT-H菌的掃描電鏡照片。
[0013]圖3為MT-H菌的16S rDNA的系統發育樹。
[0014]圖4為MT-H菌對不同濃度的DEHP的降解效果。
[0015]圖5為MT-H菌在不同條件下(pH、溫度和轉速)對DEHP的降解效果。
【具體實施方式】
[0016]下面結合說明書附圖和具體實施例來進一步詳細闡述本發明。本發明以下實施例為本發明較佳的實施方式，本發明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應用思想，實施方式中簡單參數的替換不能一一在實施例中贅述，但并不因此限制本發明的保護范圍，其他任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應被視為等效的置換方式，包含在本發明的保護范圍之內。
[0017]實施例中所述培養基配方如下:
無機鹽培養液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:
0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，FeCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最終 pH 為 7.5。
[0018]牛肉膏蛋白胨培養基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，加超純水至1L，調節pH= 7.0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加1.5% (w/v)瓊脂粉。
[0019]實施例1菌株的分離與鑒定
采集廣州市大坦沙城市污水處理廠的回流污泥，稱取5 g活性污泥樣品于含有50 mL無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培養3天后取5 mL污泥懸液加入到100 mL含有DEHP (50 mg I/1)的上述MSM培養基中。經30°C，140 rpm培養7天后，每次按取ImL的接種量連續富集、轉接10次，并相應提高培養基中DEHP的含量至1000 mg L'然后將轉接10次的培養液稀釋103~105倍涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養1~3天。待平板上長出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細菌，編號MT-H。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養7天，觀察其菌落形態。LB平板培養7天的菌落成圓形，微凸起，淡黃色，濕潤，半透明，邊緣整齊，光滑(見圖1)。
[0020]掃描電鏡樣品制備與觀察:將純化后的菌株MT-H接入含有10 mL的LB液體培養基過夜活化。吸取800 μ L菌液經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入I mL的2.5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然后再次經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。隨后將菌體分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個梯度約浸泡15 min，然后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脫水。經過CO2干燥后制片觀察。掃描電鏡下可以觀察到該菌呈球狀或橢球狀，直徑約為0.5~1μπι (見圖2)0
菌株的16S rDNA分子鑒定:提取細菌總DNA，用細菌16S rDNA通用引物對該菌基因組進行PCR擴增。PCR產物經測序(由上海生工完成測序)后，序列如SEQ ID N0:1所示，將測序結果與GenBa