專利名稱：一株木糖氧化無色桿菌及其在降解異喹啉中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于木糖氧化無色桿菌技術領域。具體涉及一株木糖氧化無色桿菌及其在降解異喹啉中的應用。
背景技術：
由于焦化廢水毒性較大，難降解的有機物含量較高，導致常規生化處理后出水的 COD濃度和色度均難達到國家再生循環水的標準。經A-A-O工藝處理后，其色度和COD值均未達到再生水的標準，GC-MS仍檢出118種有機物。其中，喹啉類有機物的含量最高，占有機物全含量的14.3wt%。即喹啉類有機物是焦化廢水處理系統中難降解的有色多環芳烴， 其含量的多少已直接影響著生化處理效果和再生循環水的水質。因此，提高喹啉類有機物的降解率是當前焦化廢水再生循環利用的難題。喹啉類屬含氮雜環結構難降解的有毒的有機物，生物酶識別率低，對生物的生長有抑制作用，降解效率亟待提高，故國內外對喹啉類物質生物降解的報道較少。異喹啉是一種具有代表性的含氮雜環物質，有一個含氮雜環和一個苯環，分子量的大小和溶解性都增加了生物酶降解它的難度。目前，異喹啉的降解可用活性污泥法，厭氧生物法、厭氧酸化-缺氧-好氧(A-A-O)生物膜法、超臨界水分解法、脈沖輔解和激光光解法。而利用生物法中特殊的降解菌株來處理工業廢水比物理和化學方法更切實可行又成本低廉有效。目前關于焦化廢水的研究取得了較大進展，但焦化廢水大規模再生處理現狀仍不樂觀，優勢菌強化再生處理焦化廢水技術是近年來研究的熱點，對焦化廢水再生循環利用具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一株高效降解異喹啉的木糖氧化無色桿菌Y-4。本發明所提供的異喹啉降解菌為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)Y-4，其 16SrDNA 的 Genbank 登錄號為 JN381516 ；于 2011 年 9 月 6 日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2011308。所述木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4經革蘭氏染色后為陽性菌，細胞呈橢圓，一般成對出現，在LB固體培養基上培養2 4d形成的菌落達2 3mm， 菌落圓形，表面光滑，潤濕，凸起，邊緣整齊，平面生長，不透明，呈乳白色。所述木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4來源于焦化廠焦化廢水處理系統的活性污泥。木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)Y_4對異喹啉有獨特的降解效果，對異喹啉的最高耐受濃度可達1000mg/L，在36h內能將濃度 500mg/L以內的異喹啉完全降解，最適降解溫度為25 35°C，pH為4_8，木糖氧化無色桿菌 (Achromobacter xylosoxidans)Y-4對萘、吡啶和喹啉有較好的降解效果；木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4在生物凈化焦化廢水中異喹啉的應用，對焦化廢水中異喹啉的降解效果非常明顯。為微生物降解焦化廢水中異喹啉的研究提供了重要基礎，在喹啉類工業廢水治理實踐中發揮重要作用。
圖1為木糖氧化無色桿菌(Ach romobacterxylosoxidans)Y_4革蘭氏染色后菌體形態照片；圖2為木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在不同溫度下對異喹啉的降解效果；圖3為木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在不同pH條件下對異喹啉的降解效果；圖4為木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在添加不同外源氮時對異喹啉的降解效果；圖5為木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4對萘、吡啶、苯酚和喹啉的降解效果。
具體實施例方式下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)Y-4的分離、純化及其鑒定1、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4的分離禾口純化1)樣品采集取某焦化廠焦化廢水處理系統的活性污泥進行預處理，S卩加入適量的無菌水于恒溫磁力攪拌器中攪拌30min，以增加活性污泥中菌種的活性。2)增菌培養和馴化在裝有IOOmL的焦化廢水的錐形瓶、IOOmL的含50%焦化廢水的MSM液體培養基的錐形瓶和IOOmL的MSM液體培養基的250mL的錐形瓶分別依次加入2 5顆玻璃珠、 0. 01%的焦磷酸鈉溶液兩滴、0. 02g異喹啉和5mL的處理后的活性污泥，在30°C，150r/min 的恒溫搖床中培養2 4d，制得三種培養液；然后在三種培養液中分別取5mL轉接至新鮮的MSM培養基，在30°C，150r/min的恒溫搖床中培養。再將異喹啉的濃度從200mg/L逐漸依次增大至 300mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L 和 1500mg/L，以馴化菌株的降解能力，篩選出馴化后對異喹啉具有降解能力的菌株。將菌株經新鮮的MSM液體培養基培養成菌液。3)菌種分離篩選取ImL的菌液用無菌的MSM培養基稀釋ICT1到10,倍，各取100 μ L稀釋液均勻涂布在含異喹啉300mg/L的MSM固體培養基平板上，于30°C的生化培養箱培養2 4d，挑取長勢良好的單菌落接入含異喹啉500mg/L的MSM液體培養基，再取對異喹啉有降解效果的菌株在LB固體培養基上平板稀釋和平板劃線純化，得到高效降解異喹啉的純種菌落。將單一的菌落分別使用含有異喹啉的培養基進行二級培養和富集營養。形狀穩定的分離株轉接到LB固體斜面，儲存在4°C下以待進一步研究。4)降解效果評價
在含異喹啉的MSM液體培養基中，實驗組接種純化后的單一菌落，對照組不接菌。 30°C,150r/min條件下培養1 2d，取樣萃取后用Agilent7890氣相色譜儀(FID)檢測殘余異喹啉的濃度。選取降解效果最好的菌株，擴大培養。氣相檢測條件 分流進樣，分流比為30 1，進樣口溫度為280°C ；FID檢測，檢測器溫度為320°C，色譜柱為30. 0mX320ymX0. 25 μ m的Inventory HP-5型填充柱，N2作載氣，升溫程序100°C時保持lmin，l(TC /min升至250°C，保持lmin，進樣量為1 μ L。所述MSM液體培養基的組分及配比為(無機鹽培養基，1L)硝酸銨lg，磷酸氫二鈉1. 42g，磷酸二氫鉀1. 36g，七水硫酸鎂0. 432g，氯化鈣0. 006g,微量元素lmL，其余為蒸餾水，PH自然，121. 3°C濕熱滅菌20min;其固體培養基是在液體培養基中加入2% (w/v)的瓊脂。其中微量元素的組分及配比為(IL)一水硫酸錳1. 69g，六水氯化鈷0. 24g，硼酸 1. 16g，二水鉬酸鈉0. 024g,七水硫酸亞鐵2. 78g，七水硫酸鋅1. 15g，五水硫酸銅0. 38g。LB液體培養基組分及配比為(IL)酵母浸提物5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，其余為蒸餾水，121. 3°C濕熱滅菌20min;其固體培養基是在液體培養基中加入2% (w/v)的瓊脂。結果得到一株可在高濃度異喹啉環境下生長的菌株，對異喹啉的最高耐受濃度可達1000mg/L，在36h內能將濃度為500mg/L以內的異喹啉完全降解，在固體培養基上培養 2-4d形成的菌落大小為2 3mm，菌落圓形，表面光滑，潤濕，凸起，邊緣整齊，平面生長，不透明，呈乳白色。2.將上述得到的菌株進行生理生化及16Sr DNA鑒定，其生理生化特征如表1所示，IBSrDNA鑒定結果見序列表，所述序列表為上海生工生物技術有限公司測序結果。表1木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) Y-4生理生化特征
權利要求
1.一株木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4，該菌株的16SrDNA的 Genbank登錄號為JN381516，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2011年9月6日， 保藏編號為 CCTCC NO :M2011308o
2.一株木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在降解異喹啉中的應用。
3.一株木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) Y-4在生物凈化焦化廢水中異喹啉的應用。
全文摘要
本發明公開了一株木糖氧化無色桿菌及其在降解異喹啉中的應用，所述木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)命名為Y-4，菌株保藏登記號為CCTCC NOM2011308，該菌株16SrDNA的Genbank登錄號為JN381516。本發明的木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)Y-4對異喹啉有獨特的降解效果，對異喹啉的最高耐受濃度可達1000mg/L，在36h內能將濃度為500mg/L以內的異喹啉完全降解，最適降解溫度為25～35℃，pH為4-8，同時對萘、吡啶和喹啉也有較好的降解效果，對生物凈化焦化廢水中異喹啉的效果非常明顯。本發明為微生物降解焦化廢水中異喹啉的研究提供了重要基礎，將在喹啉類工業廢水治理實踐中發揮重要作用。
文檔編號C02F101/38GK102417887SQ20111026557
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月8日 優先權日2011年9月8日
發明者劉奇, 劉文敏, 李文兵, 楊書琴, 王光華, 蔣麗娟, 郭勝 申請人:武漢科技大學