專利名稱：：一株木糖氧化無色桿菌及其在降解異噁草酮中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一株木糖氧化無色桿菌及其在降解異噁草酮中的應用。
背景技術：
：異噁草酮最先用于防除大豆田雜草，之后因其具有用量少、活性高等突出特點，被廣泛推廣用于多種作物田。因其對大豆高度安全，殺草譜廣，尤其是對鴨跖草等惡性雜草有特效，所以在黑龍江省用量很大，每年用量在300噸以上，并且有上升的趨勢。但是該除草劑持效期長，造成在土壤中的生物活性長達6個月以上，施用異噁草酮的當年秋天或次年春天，都不宜種植小麥、大麥、燕麥、黑麥、谷子、水稻、甜菜、油菜等，使用后的次年可才種植水稻、玉米、棉花、花生、向日葵等作物，嚴重地影響了大豆產區種植業結構的調整(王險峰.進口農藥應用手冊.北京.中國農業出版社.2000:429-435)。因此，異噁草酮的殘留問題對后茬作物的危害需亟待解決。影響異噁草酮降解的因素主要是土壤溫度、濕度以及微生物活動，異噁草酮一般不易發生光化學降解或熱分解，其降解主要時依靠微生物。國外研究者通過溫度、土壤濕度對C"標記的異噁草酮的降解研究發現，在滅菌土和接種微生物土壤中，異噁草酮的降解主要依賴于微生物作用。溫度升高，異噁草酮揮發量增加，但在低溫條件下礦化速度最快，隨著土壤濕度增加異噁草酮的礦化速度也加快(MerroshT.L，SimsG.K.，StollerE.W.1995.Clomazonefateinsoilasaffectedbymicrobialactivity,temperature,andsoilmoisture.Agric.FoodChem.43(2):537-543)。李蓮芳對異噁草酮在幾種水稻土中的遷移降解研究中發現，溫度越高，土壤濕度越大，微生物呼吸作用和礦化作用越強，降解作用也越強(李蓮芳，李國學，楊仁斌等.2004.水稻土中廣滅靈殘留動態及降解影響因子的研究.中國生態農業學報，12(3):112-115)。二者的差別可能是由于高溫時異噁草酮發生光化學降解或熱分解，而低溫時發生生物降解，而生物降解在整個過程中占主導地位，所以溫度過高或過低均會抑制異噁草酮的降解s研究還發現土壤性質對異噁草酮降解有較大的影響，土壤有機質含量低則異噁草鲖降解能力較強，反之則降解能力較差。提高土壤含水量及適當增加土壤pH值有利于異噁草酮的降解，但異噁草酮是一種中性物質，過高的pH不利于其降解。另外異噁草酮在滅菌水稻土中降解速率遠小于未滅菌水稻土，說明土著微生物在其降解過程中發揮了一定的作用。目前解決長殘留除草劑危害的途徑主要有開發除草劑新品種以代替現有長殘留性除草劑，但由于對耙標酶的了解程度不夠，加之開發一個農藥新品種要投入資金數億美元，所以難度很大；抗除草劑轉基因作物品種的選育，需要投入大量的研究經費和人力，要經歷較長的研究過程，距離實際應用還很遙遠；利用一些化學物質即除草劑的解毒劑(保護劑)解除除草劑對作物產生的藥害，但涉及到另外一種化學物質的投放于環境中，會造成二次污染的問題；利用源于土壤的微生物降解，才是真正能消除長殘留除草劑污染的有效途徑。
發明內容本發明的目的是一株木糖氧化無色桿菌及其在降解異噁草酮中的應用。本發明所提供的木糖氧化無色桿菌為木糖氧化無色桿菌"WramoZ^cterxy/osox/^m)LYWCGMCCW2.2773。所述木糖氧化無色桿菌"c/zramo^cferxy/asoxWflRS)LYWCGMCCW.2773為革蘭氏陰性菌在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，3(TC條件下生長的菌落表面光滑、濕潤、凸起，邊緣微鋸齒狀，平面生長，不透明，培養基暗黃色，菌株細胞呈桿狀。所述木糖氧化無色桿菌"c/zramotecterxy/osox^a似)LYWCGMCCW.2773，己于2008年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區大屯路)，保藏號為CGMCCW.2773。本發明的木糖氧化無色桿菌"c力r，o&cferzj^mo"V朋s)LYWCGMCCN"2773來源于采自黑龍江省哈爾濱市長期施用長殘留性除草劑異噁草酮的土壤，可以在高濃度異噁草酮環境下生長，并且可以高效降解異噁草酮，為微生物降解長殘留除草劑異噁草酮的研究提供了重要的基礎，可用于受異噁草酮污染的水體、土壤的生物凈化。圖1為木糖氧化無色桿菌"cAra/o力acfenj^osouV朋s)LYW在不同溫度下對異噁草酮的降解效果圖2為在不同溫度下木糖氧化無色桿菌"c力ro/woZ^cterjr/7osaoW朋s)LYW降解異噁草酮的半衰期圖3為木糖氧化無色桿菌"c力ro/z。Z^"er;^2osoxjV朋s)LYW對200^gkg-1異噁草酮的降解效果圖4為木糖氧化無色桿菌"c/ro/BoZ^cz^nj^osooV朋s)LYW降解200Pg'kg—1異噁草酮的半衰期圖5為木糖氧化無色桿菌"c力ro/z70Zac"rxj^osoxic^/7s)LYW對500Hgkg—1異噁草酮的降解效果圖6為木糖氧化無色桿菌"c/^o/zoZ^cfer^^osao'o^/^)LYW降解500Pgkg—1異噁草酮的半衰期具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1、木糖氧化無色桿菌"c力ro，力3ctar義j^Mor^/朋s)LYWCGMCCJV2.2773的分離、純化及其鑒定1、木糖氧化無色桿菌"cAra/zwZ^cz^r;iT"50"V朋s)LYWCGMCCW2.2773的分離及純化1)釆集樣品土樣采自黑龍江省哈爾濱市東北農業大學實驗實習基地內長期施用長殘留性除草劑異噁草酮的土壤。2)菌體的富集和分離將長期施用長殘留性除草劑的土壤樣品混合均勻，稱取10g加入到含有200mg.L—'異噁草酮的50mL富集培養液中，置于3(TC，120rmin'的搖床培養。以后每周添加10ml新鮮富集培養液，每次增加異噁草酮的濃度，使其濃度分別為200mgL1、400mgL—!、800mgL—1、1600mgr1、2000mgL—'、3000mgL—\4000mgL—'、5000mgL—、富集培養時間分別為2個月，培養液中異噁草酮濃度達到5000mg*L—'后，適應性培養一周，用平板稀釋法將其涂布在含有200mgL—'異噁草酮的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，挑取單菌落，劃線純化，將純化后的單菌落保存。所述的富集培養液組分及配比為牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;NaCl，5g/L;K2HP04，5g/L;PH7.0-7.2。所述的無機鹽培養基組分及配比為KH2P04，1.70g/L;K2HP04，5.17g/L;(NH4)2S04，2.6g/L;鹽溶液，10mL/L;PH7.0-7.2。其中鹽溶液為含MgS04，19.5g/L;MnS04，5g/L;FeS04，5g/L;CaCl2，0.3g/L的溶液。所述的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基組分及配比為牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;瓊脂，18g/L，PH7.0-7.2。結果得到一株可在高濃度異噁草酮環境下生長的菌株，其在上述牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，3(TC條件下生長的菌落表面光滑、濕潤、凸起，邊緣微鋸齒狀，平面生長，不透明，培養基暗黃色，菌株細胞呈桿狀。2、將上述得到的菌株進行生理生化鑒定，結果其生理生化特征如表l所示。表lLYW菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注"+"表示生長或反應陽性；"-"表示不生長或反應陰性經上述鑒定表明該菌株為木糖氧化無色桿菌"c力roMZ^cferxy7asa^V朋s)，將其命名為LYW。該木糖氧化無色桿菌"c力ro/zo/^"er;rj^aso;oV朋s)LYW，己于2008年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC亂2773。實施例2、木糖氧化無色桿菌(^c/LTo歷o力acter;^2aso;o'^3/LS)LYW對土壤中異噁草酮的降解1、木糖氧化無色桿菌"cAr,力a"arx/A皿W愿)LYW在不同溫度下對含量為750Pgkg—'的土壤中異噁草酮的降解效果將木糖氧化無色桿菌"c力r，o力acterxj^osonV朋s)LYWCGMCCNs.2773用牛肉膏蛋白胨培養液(含牛肉膏，3g/L;蛋白胨，5g/L;PH7.0-7.2的培養液)在30'C的條件下進行增值培養，用于下述效果檢測實驗。在黑土(有機質含量3.557%，田間最大持水量37.5%，全氮0.195%，pH值7.12)中加入終濃度為750Pgkg—1的異噁草酮，分成6份每份32kg，其中三份分別按照109cfu/kg黑土的量接種木糖氧化無色桿菌"c/znmokzcterxy/owx/(i(my)LYWCGMCC処.2773，將該菌株與土壤混勻，調節土壤含水量為田間最大持水量的60%，然后分別置于15。C、20°C、28°C恒溫培養箱中放置作為三個實驗組，分別記為15。C處理、2(TC處理、28'C處理；另外三份土壤不接種任何菌，調節土壤含水量為田間最大持水量的60%，分別置于15"、20°C、28°C恒溫培養箱中放置作為三個空白對照組，分別記為15°。CK、20°CCK、28°CCK。各組分別在培養后的第5、13、21、29、37、45、53、60天后，測定土壤中各處理異噁草酮的殘留量，計算各組處理異噁草酮的半衰期。各處理土壤中異噁草酮的殘留量測量結果如圖l所示，當溫度為15t、2CTC、28°〇時，三個空白對照組于第60天測定各對照土壤中異噁草酮的殘留量(圖1中15。CCK、20°CCK、28°CCK)，分別為673.38，642.52和622.67Pgkg—、而添加LYW菌后的三個處理組(圖1中15°C處理、20°C處理、28°C處理)殘留量分別為133.45，74.86和52.38Pg.kg一1，殘留率分別為17.79%、9.98%、6.98%，說明木糖氧化無色桿菌(^c/zro附o6a"erxj;/awx/t/ara)LYWCGMCC對黑土中異噁草酮具有很強的降解能力，并且溫度為2(TC28i:的范圍內降解效果好。7各組處理異噁草酮的半衰期結果如圖2所示，結果表明在15'C、20°C、28"C條件下，異噁草酮在黑土中自然降解的半衰期(圖2中CK)分別為433.22天，256.72天和247.55天，而在LYW菌的作用下(圖2中處理)，其降解半衰期分別為20.33天、15.83天和14.09天。結果表明木糖氧化無色桿菌(」c/rawo6acterxj;/ayoxW"〃5)LYWCGMCC能大幅度降低土壤中異噁草酮的半衰期，使土壤中異噁草酮快速降解。2、木糖氧化無色桿菌"cAro/zw力acz^nj^osa^V朋s)LYW對含量為200Hg*kg—'的土壤中異噁草酮的降解效果在黑土(有機質含量3.557%，田間最大持水量37.5%，全氮0.195%，pH值7.12)中加入終濃度為200Pgkg—1的異噁草酮，分成4份每份28kg，其中兩份分別按照109cfu/kg土壤的量接種木糖氧化無色桿菌(^c/ramo6acter;qy/osox/flfa朋)LYWCGMCCW.2773，將該菌株與土壤混勻，分別調節土壤含水量為田間最大持水量的60%和田間最大持水量的40%，然后分別置于25。C恒溫培養箱中放置作為2個菌處理組；另外2份黑土中不接種任何菌，分別調節土壤含水量為田間最大持水量的60%和田間最大持水量的40%，分別置于25'C恒溫培養箱中放置作為2個空白對照組，分別在持續定期測定土壤中各處理異噁草酮的殘留量，并計算計算各組處理異噁草酮的半衰期。各處理土壤中異噁草酮的殘留量測量結果如圖3所示，結果表明于第65天測定含水量為田間最大持水量的40%的空白對照組土壤(圖3中40%CK)和含水量為田間最大持水量的60%的空白對照組土壤(圖3中60%CK)中異噁草酮的殘留量，分別為172.79^g*kg—169.77Pg*kg—'，而添加木糖氧化無色桿菌UcAramo6a"erxy/cwox^fl似)LYWCGMCCM.2773后含水量為田間最大持水量的40%的菌處理組土壤(圖3中40%處理)和含水量為田間最大持水量的60%的菌處理組土壤(圖3中60%處理)中異噁草酮的殘留量，分別為殘留量分別為14.84^'kg—1口9.88Pgkg—、各組處理異噁草酮的半衰期結果如圖4所示，結果表明異噁草酮在黑土中自然降解的半衰期(圖2中CK)分別為266.60天和223.60天，而添加木糖氧化無色桿菌"c/zramo6acto"xy/woxWa似)LYWCGMCCW.2773的含水量為田間最大持水量的40%的菌處理組土壤和含水量為田間最大持水量的60%的菌處理組土壤(圖4中處理)中異噁草酮的降解效果明顯好于未加菌處理(空白對照組)，其降解半衰期分別為15.44和13.13天，比空白對照(圖4中CK)相應含水量的土壤中異噁草酮的降解半衰期分別提前了251.16天和210.47天。3、木糖氧化無色桿菌"cAro/zw/^cz^r;fj^asoxiWa/7S)LYW對500Hgkg—1異噁草酮的降解效果在黑土(有機質含量3.557%，田間最大持水量37.5%，全氮0.195%，pH值7.12)中加入終濃度為500Wkg—'的異噁草酮，分成4份每份28kg，其中兩份分別按照1(fcfu/kg土壤的量接種木糖氧化無色桿菌(Jc/zramo^cferxy/ayoxWflm)LYWCGMCCJV2.2773,將該菌株與土壤混勻，分別調節土壤含水量為田間最大持水量的60%和田間最大持水量的40%，然后分別置于25。C恒溫培養箱中放置作為2個菌處理組；另外2份黑土中不接種任何菌，分別調節土壤含水量為田間最大持水量的60%和田間最大持水量的40%，分別置于25i:恒溫培養箱中放置作為2個空白對照組，分別在持續定期測定各處理土壤中異噁草酮的殘留量，并計算各組處理異噁草酮的半衰期。各處理土壤中異噁草酮的殘留量測量結果如圖5所示，結果表明于第65天測定含水量為田間最大持水量的40%的空白對照組土壤(圖5中40%CK)和含水量為田間最大持水量的60%的空白對照組土壤(圖5中60%CK)中異噁草酮的殘留量，分別為456.12Pg*kg—'和453.33Pg.kg—'，而添加木糖氧化無色桿菌(^c/zramo6fl"erx少/osoxWa似)LYWCGMCC后含水量為田間最大持水量的40%的菌處理組土壤(圖3中40%處理)和含水量為田間最大持水量的60%的菌處理組土壤(圖3中60%處理)中異噁草酮的殘留量，分別為殘留量分別為46.82wkg人32.3叫gkg-1。各組處理異噁草酮的半衰期結果如圖6所示，結果表明異噁草酮在黑土中自然降解的半衰期(圖2中CK)分別為462.10天和407.73天，而添加木糖氧化無色桿菌"c/zramo6acterx_y/awxWara)LYWCGMCCW2.2773的含水量為田間最大持水量的40%的菌處理組土壤和含水量為田間最大持水量的60%的菌處理組土壤(圖6中處理)中異噁草酮的降解效果明顯好于未加菌處理(空白對照組)，其降解半衰期9分別為16.82天和14.20天，比空白對照(圖6中CK)相應含水量的土壤中異噁草酮的降解半衰期分別提前了445.27天和393.53天，說明LYW菌對土壤中高濃度的異噁草酮也可以起到快速降解的作用。權利要求1、木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)LYWCGMCC№.2773。2、木糖氧化無色桿菌"c/2ramo6a"erx3//ow/c/<mOLYWCGMCC在降解異噁草酮中的應用。3、木糖氧化無色桿菌"c/zramo6ac^"xj;/o卵x/(^似)LYWCGMCCW2.2773在生物凈化受異噁草酮污染水體或土壤中的應用。全文摘要本發明公開了一株木糖氧化無色桿菌及其在降解異噁草酮中的應用。該木糖氧化無色桿菌為木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)CGMCC№.2773。該菌株可以在高濃度異噁草酮環境下生長，并且可以高校降解異噁草酮，為微生物降解長殘留除草劑異噁草酮的研究提供了重要的基礎，可用于受異噁草酮污染的水體、土壤的生物凈化。文檔編號C12N1/20GK101463337SQ20091007622公開日2009年6月24日申請日期2009年1月6日優先權日2009年1月6日發明者劉亞光,趙長山,閆春秀申請人:東北農業大學