離子液體用于玉米sod酶的提取的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種超氧化物歧化酶的提取方法，特別設及一種從植物中提取超氧化物歧化酶的方法。將玉米原料預處理后，打漿。利用離子液體、磷酸氫二鉀及水形成的離子液體雙水相體系對玉米漿中的超氧化物歧化酶進行選擇性的萃取。萃取液經磷酸鹽緩沖溶液反向萃取得到超氧化物歧化酶的粗酶液。對粗酶液進行熱變性法和凝膠柱層析法進行純化，純化后的酶液進行真空干燥得到超氧化物歧化酶精粉。離子液體雙水相體系經反向萃取分離出蛋白質和酶后，可以直接應用于下一次的萃取過程，多次重復利用不影響離子液體的萃取效率。
【專利說明】離子液體用于玉米SOD酶的提取
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種超氧化物歧化酶的提取方法，特別設及一種從植物中提取超氧化物歧化酶的方法，屬于精細化工【技術領域】。
【背景技術】
[0002]超氧化物歧化酶(SOD)是一種具有特定生物催化功能的蛋白質，為等電點偏酸性的酸性蛋白質，由蛋白質和金屬離子組成，它廣泛存在于自然界的動物、植物以及一些微生物體內。根據所含金屬離子(輔基)的不同，SOD可分為以下四種類型:第一類為Cu /Zn-SOD，呈藍綠色，相對分子量約為32k道爾頓，來源于動物血、豬肝、牛肝以及菠菜葉、面包酵母中，在某些原核生物中也存在；第二類為Mn-SOD，呈紫紅色，相對分子量約為40k道爾頓，主要存在于原核細胞和真核細胞以及線粒體的基質中，在高等植物中的過氧化物酶體中也含有。第三類為Fe-SOD，呈黃褐色，相對分子量約為38.7k道爾頓，主要存在真核生物如藻類，部分高等植物如油菜、檸檬、菠蘿、甜橙、番茄、銀杏等體內也存在。第四類為N1-SOD，是近年來才發現的一種新型S0D，目前只有從鏈球菌中分離得到，對其研究及報道較少。[0003]很多研究表明，活性氧(02_、.0H,H2O2>'02>RO0.)能與蛋白質、核酸和脂類發生反應，導致膜脂過氧化、堿基突變、DNA鏈的斷裂和蛋白質的損傷等。在動物體，活性氧導致細胞壞死、過敏反應、癌變或其他病理過程。在植物體內，活性氧可導致植物代謝失活、細胞死亡、光和作用速率降低，甚至造成植物品質降低、產量下降等。超氧化物歧化酶是能夠催化超氧陰離子自由基02_發生歧化反應，平衡機體代謝過程中產生的過多自由基，減輕或消除自由基對機體的危害，受到全世界學術界廣泛關注，使之成為涉及分子生物學、微生物學、醫學等學科領域及醫藥、化工、食品等生產行業的一個熱門研究課題。超氧化物歧化酶也是近年來應用最廣泛的酶，具有抗衰老、免疫調節、抑制腫瘤、調節血脂、抗輻射、消炎和美容等功效。
[0004]人們最早從動物的血液中提取SOD制成產品，由于國際上瘋牛病的蔓延，從動物血中提取的S0D，給人們在使用上帶來一些危險因素。從植物，特別是人們日常經常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及糧食中提取S0D，使用安全性非常高，避免了可能發生的交叉感染。利用全新的提取技術從植物中提取S0D，具有明顯的社會和經濟效益，市場前景廣闊。目前從植物中提取SOD的方法主要包括緩沖液提取法、超臨界CO2萃取法和熱變性法，其中以磷酸緩沖液法應用最為普遍。但該方法的缺點是浸出范圍廣，選擇性相對差，容易浸出大量的無效成分，且會引起一些有效成分的水解。超臨界CO2萃取法需要應用超臨界流體，雖然分離粗產品較為便捷，但同樣存在萃取過程選擇性差，萃取后的粗產品在酶的純化過程之前需要去除雜質。熱變性法是依據SOD的熱穩定性原理設計的。SOD的熱穩定性高，當溫度低于60°C時，短時間的熱處理不會使酶活力有明顯的變化，而一般的雜蛋白卻在溫度高于55°C時就易變性沉淀，因此，對SOD提液進行短時間的熱處理可以達到去除雜蛋白的目的。熱變性法作為一種初步的純化手段，操作簡便，經濟實惠，但熱變性過程容易導致酶的失活。
[0005]離子液體是近年來迅速發展起來的一種全新綠色介質和功能材料。離子液體具有不易揮發、不可燃、穩定性高、溶解能力強、功能可調節等優點，其應用領域正不斷地擴大，使其在生物活性物質的分離上展現了十分誘人的應用前景。離子液體雙水相萃取技術是近年來興起的新的生物質分離技術，該體系一般是由親水性離子液體、無機鹽(如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物等)和水形成的雙水相體系，它綜合了離子液體和雙水相體系的優點。作為一種高效的新型綠色分離體系，離子液體雙水相具有分相時間短、黏度低、萃取過程不易乳化、萃取率高、分離條件溫和、對生物活性物質不破壞且離子體系可以且易回收利用等優點，因此，離子液體雙水相這一新的萃取分離體系，廣泛用于生物活性物質的分離和純化。如大多數酶和蛋白質等都能用雙水相體系進行分離純化。離子液體雙水相萃取蛋白質機理屬于液-液萃取，當蛋白質進入雙水相體系后，由于表面性質、電荷作用和各種力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的作用和溶液環境的影響，使其在上、下相中的濃度不同，即各成分在兩相間的選擇性分配，從而達到萃取分離的目的。蛋白質與離子液體作用，主要有鹽析作用；與輔助鹽萃取劑發生配位作用生成配合物，配合物被萃取到離子液體中；或者調節PH，使蛋白質的疏水基團暴露出來，從而萃取到離子液體中等。
[0006]在傳統農作物中，玉米、大蒜、綠豆、飯豆、芝麻、黃豆這六種作物中SOD含量較高，并且以玉米中的含量最高，因此本發明以玉米為原料，采用離子液體雙水相體系對玉米中SOD中分離純化，以期建立一種簡便、高效的SOD分離純化路線。
【發明內容】
[0007]本發明是為解決常規SOD粗提過程中，萃取劑對酶選擇性較差且酶易變性失活的缺點，提出采用離子液體雙水相體系高效選擇性的萃取玉米中的蛋白質與S0D。該技術生產方法簡單易行，適合工業化生產過程。
[0008]本發明的技術方案由以下部分組成。
[0009]I)玉米原料的預處理。對玉米原料進行篩選、清洗、消毒、洗凈，晾干備用。將玉米粒浸入水池中，以質量比1: 2的水，溫度為28-32°C時浸泡18-36h，玉米粒完全溶脹后，發芽16-36h，粉碎打漿。
[0010]2)離子液體雙水相萃取。將離子液體、K2HPO4按比例加入到玉米漿中，攪拌萃取30-90min，當體系出現明顯分層時，萃取過程結束。過濾分離去除玉米漿中的固體，液體部分進行靜置分層，下層為含有蛋白質的離子液體層。
[0011]3)蛋白質與酶的反萃取。將含有蛋白質的離子液體層進行分離后，向其中加入pH值為7.8的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌60-90min后，蛋白質溶解于緩沖溶液中，而與離子液體相分離，緩沖溶液層為粗酶液。分離后的離子液體層可以直接用于下一次的萃取過程。
[0012]4)蛋白質的分離。將粗酶液緩慢升溫至60°C,保溫反應15-30min。降溫至0_4°C,離心分離蛋白質，其濾液為SOD酶濃縮液。
[0013]5) SOD的純化。將SOD酶濃縮液進行超濾和納濾處理，截留分子量大于15k道爾頓以上的物質。所得濾液繼續采用S^hadex G-75凝膠柱子層析分離。層析液濃縮后進行真空干燥，得SOD酶精粉。
[0014]上述的離子液體為咪唑衍生物，其結構式如I所示。[0015]
【權利要求】
1.離子液體用于玉米SOD酶的提取方法，其特征在于離子液體、磷酸氫二鉀及水形成雙水相體系用于提取玉米中的超氧化物歧化酶粗酶液，其中離子液體具有式(I)所示結構H3C'
2.根據權利要求1所述的離子液體用于玉米SOD提取方法，其特征在于離子液體雙水相體系的構成為離子液體的質量濃度為20-35%，磷酸氫二鉀的質量濃度為17-25%。
【文檔編號】C12N9/02GK103740667SQ201410029481
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月15日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】李美鳳 申請人:李美鳳