一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開了一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，高壓超聲酶解劑，一步完成脫脂處理和蛋白提取，大大提高了提取效率，縮短了生產時間。提取過程綠色環保，快速方便，魚膠原蛋白分子量分布均勻，雜質少。
【專利說明】一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制品制備【技術領域】，特別涉及一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是結締組織中一種具有豐富生理功能的重要結構蛋白，它具有的獨特的大分子螺旋結構和聚集態結構，使其具有一定的熱穩定性和很高的機械韌性和強度，賦予了它用于食品、醫藥品、包裝材料的獨特之處。膠原蛋白具有很強的親水、保濕性能，其在食品中可用作添加劑，以改善食品的風味、提高食品的保藏穩定期，可用作食品的膠凝劑、穩定劑、乳化劑、增稠劑、發泡劑、粘合劑、澄清劑等。膠原蛋白作為天然的生物資源，目前在食品、醫藥、化妝品、營養保健品等高附加值工業中的應用越來越廣泛，越來越受到人們的重視。膠原蛋白所特有的極低的抗原性、極高的可生物降解性、生物吸收性、止血功能和促進細胞生長的功能，近幾年來在醫藥工業、臨床醫學和臨床治療中也有廣泛的應用。根據臨床要求的不同，對膠原進行相應的加工處理，可制備成膠原注射液、膠原止血粉劑、止血纖維、止血海綿、手術縫合材料、心臟瓣膜修復材料,外科敷料、皮膚移植材料，以及以管狀形式的血管、食管和氣管的替代材料等。這些材料被廣泛用于創傷和燒傷的修復、整形和美容，皮膚及神經生長，以及血管、瓣膜手術等，展現出良好的應用前景。
[0003]傳統的膠原蛋白提取方法是從豬、牛的皮和骨，以及禽類組織中提取。但近年來因瘋牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆發，使人們對牲畜與禽類膠原制品安全性產生疑慮。另外，由于宗教和習俗等原因，從豬皮牛皮中提取膠原蛋白受到很大限制，因此，尋找膠原蛋白的新來源顯得愈來愈迫切。從海水或淡水魚體廢棄物提取安全性高、吸收率高、生物活性更強的膠原蛋白將成為膠原蛋白產品提取的主要來源。
[0004]現有的魚膠原蛋白提取方法在前期處理時往往忽略了魚體廢棄物中脂肪的去除問題，使脂肪混入膠原蛋白中影響膠原蛋白的純度，并制約了其在下游領域的應用。此外，脂肪脫除方法一般采用酸、堿溶液或有機溶劑法，這些方法不但成本較高，脫脂不徹底，且化學試劑的使用容易使膠原蛋白變性，降低產品得率。傳統的膠原蛋白提取方法采用酸或堿降解膠原蛋白提取，這些方法會在降解過程中導致部分氨基酸破壞，產品安全性差，生物活性損失，生產中的廢液對環境造成污染；采用低溫生物酶解技術，不添加其他物質，可以提高產品品質(如CN102533914 A)，避免環境污染，但所需時間較長，產品分子量較低，且得到的膠原蛋白分子量分布不均。
[0005]為了加快魚膠原蛋白的生產周期，降低生產成本，制備能夠滿足不同分子量需要的魚膠原蛋白。本專利采用高壓超聲酶解技，一步完成脫脂處理和蛋白提取，大大提高了提取效率，縮短了生產時間。提取過程綠色環保，快速方便，魚膠原蛋白分子量分布均勻，雜質少，可作為原材料應用于營養保健品、化妝品、食品及醫用領域。
[0006]
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法。本發明的制備過程簡單易行、操作方便、成本低，制備的魚膠原蛋白分子量分布均勻，雜質少，可作滿足營養保健品、化妝品、食品及醫用等應用領域對不同分子量魚膠原蛋白的需求。
[0008]本發明的公開了一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，包括如下步驟:
(1)將干凈的魚體廢棄物剪切成50~200目的魚粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入蒸餾水、反應酶攪拌制成漿液，漿液在高壓、超聲處理下控制反應溫度為50~70°C，pH為7-9，攪拌0.5~2h ;
(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入少量氫氧化鈉，并加熱至80~90°C，攪拌20 ~30min ；
(4 )過濾漿液，濾液經透析得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0009]作為優選的技術方案:
其中，如上所述的一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，步驟(2)中所述的蒸餾水質量為所述的魚粉質量的3~10倍。
[0010]如上所述的一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，所述的反應酶是指脂肪酶與蛋白酶的混合物；其中脂肪酶是指中性脂肪酶和/或堿性脂肪酶，蛋白酶是指菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶和/或胰蛋白酶。本專利中酶解脫脂和酶解提取是同步進行的:酶解脫脂是利用脂肪酶的酶解作用，在適宜的溫度和攪拌速率下，脂肪酶可以迅速將甘油三酯的酯鍵水解成為甘油和脂肪酸；酶解提取是利用蛋白酶的酶解作用，催化蛋白質中的肽鍵水解，從而得到魚膠原蛋白溶液。
[0011]進一步地，所述的反應酶加入質量占魚粉質量的0.1~1%，其中脂肪酶與蛋白酶的質量比為1:2~4。由于本專利中酶解脫脂和酶解提取是同步進行的，為了使酶解脫脂與酶解提取的速率相配合且互不干擾，必須嚴格控制脂肪酶與蛋白酶的使用量和使用比例。
[0012]如上所述的一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，所述的高壓是指控制密閉容器中的壓力在1.5~3個標準大氣壓；所述的超聲處理是指采用超聲波發生器使密閉容器中的物質處于15~25kHz的超聲處理。高壓以及超聲處理可以有效提高蛋白酶的催化速率，但在超聲處理中，超聲頻率和時間需要控制，以避免處理過度使蛋白質變性。
[0013]如上所述的一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，所述的氫氧化鈉加入量占步驟(2)反應后漿液質量的0.1-0.5%。氫氧化鈉加入的目的是調節酶解反應后漿液體系為弱堿性，以使脂肪酶解生成的脂肪酸反應生成皂鹽。
[0014]如上所述的一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，所述的透析是指將濾液置于透析袋中經蒸餾水透析4-7天，其中所述的透析袋為截留分子量為1-300KD。采用透析處理可以除去濾液中原有的可溶性小分子雜物，并控制得到的魚膠原蛋白在所需的分子量范圍內。
[0015]如上所述的一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，所述的魚體廢棄物是指魚皮、魚鱗和/或魚鰾。在本專利中，將魚體廢棄物加工成細小的顆粒，這樣可以大幅提高酶解的效率，提高最終魚膠原蛋白的得率。
[0016] 申請人:意外的發現，堿性脂肪酶:菠蘿蛋白酶質量比為1:3，占魚粉重量0.7%，酶解pH值設定為8時,提取效果最好，提取率最聞與現有技術相比，本發明的有益效果是:
本專利采用高壓超聲酶解劑，一步完成脫脂處理和蛋白提取，大大提高了提取效率，縮短了生產時間。提取過程綠色環保，快速方便，魚膠原蛋白分子量分布均勻，雜質少，可作滿足營養保健品、化妝品、食品及醫用等應用領域對不同分子量魚膠原蛋白的需求。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0018]實施例1:
一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，包括如下步驟:
(1)將去除表面雜質干凈的魚皮、魚鱗、魚鰾剪切成小塊，并用破碎機切成50目的魚粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入為魚粉質量為3倍的蒸餾水和反應酶攪拌制成漿液，其中反應酶由中性脂肪酶和菠蘿蛋白酶組成，反應酶加入量占魚粉質量的0.1%，且中性脂肪酶與菠蘿蛋白酶的質量比1: 4，配制好的漿液在1.5個標準大氣壓、15kHz的超聲處理下控制反應溫度為50°C，pH為7，攪拌2h進行酶解反應；
(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入占其質量0.1%的氫氧化鈉，并加熱至90°C，攪拌20min ；
(4)過濾漿液，將濾液置于截留分子量為IKD的透析袋中經蒸餾水透析7天得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0019]實施例2:
一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，包括如下步驟:
(1)將去除表面雜質干凈的魚皮、魚鱗、魚鰾剪切成小塊，并用破碎機切成100目的魚
粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入占魚粉質量為5倍的蒸餾水和反應酶攪拌制成漿液，其中反應酶由中性脂肪酶和堿性蛋白酶組成，反應酶加入量占魚粉質量的0.3%，且中性脂肪酶與堿性蛋白酶的質量比1: 4，配制好的漿液在2個標準大氣壓、20kHz的超聲處理下控制反應溫度為55°C，pH為7.5，攪拌1.5h進行酶解反應；
(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入占其質量0.2%的氫氧化鈉，并加熱至80°C，攪拌30min ；
(4)過濾漿液，將濾液置于截留分子量為2KD的透析袋中經蒸餾水透析4天得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0020]實施例3:
一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，包括如下步驟:
(1)將去除表面雜質干凈的魚皮、魚鱗、魚鰾剪切成小塊，并用破碎機切成150目的魚
粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入占魚粉質量為7倍的蒸餾水和反應酶攪拌制成漿液，其中反應酶由中性脂肪酶和胰蛋白酶組成，反應酶加入量占魚粉質量的0.5%，且中性脂肪酶與胰蛋白酶的質量比1:3，配制好的漿液在2.5個標準大氣壓、25kHz的超聲處理下控制反應溫度為70°C，pH為7.5，攪拌Ih進行酶解反應；
(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入占其質量0.3%的氫氧化鈉，并加熱至90°C，攪拌30min ；
(4)過濾漿液，將濾液置于截留分子量為5KD的透析袋中經蒸餾水透析5天得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0021]實施例4:
一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，包括如下步驟:
(1)將去除表面雜質干凈的魚皮、魚鱗、魚鰾剪切成小塊，并用破碎機切成200目的魚
粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入占魚粉質量為9倍的蒸餾水和反應酶攪拌制成漿液，其中反應酶由堿性脂肪酶和菠蘿蛋白酶組成，反應酶加入量占魚粉質量的0.7%,且堿性脂肪酶與菠蘿蛋白酶的質量比1:3，配制好的漿液在3個標準大氣壓、15kHz的超聲處理下控制反應溫度為65°C，pH為8，攪拌0.5h進行酶解反應；
(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入占其質量0.4%的氫氧化鈉，并加熱至80°C，攪拌20min ；
(4)過濾漿液，將濾液置于截留分子量為IOKD的透析袋中經蒸餾水透析6天得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0022]實施例5:
一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，包括如下步驟:
(1)將去除表面雜質干凈的魚皮、魚鱗、魚鰾剪切成小塊，并用破碎機切成50目的魚
粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入占魚粉質量為10倍的蒸餾水和反應酶攪拌制成漿液，其中反應酶由堿性脂肪酶和堿性蛋白酶組成，反應酶加入量占魚粉質量的0.9%,且堿性脂肪酶與堿性蛋白酶的質量比1:2，配制好的漿液在2個標準大氣壓、20kHz的超聲處理下控制反應溫度為60°C，pH為8.5，攪拌Ih進行酶解反應；
(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入占其質量0.5%的氫氧化鈉，并加熱至90°C，攪拌30min ；
(4)過濾漿液，將濾液置于截留分子量為100KD的透析袋中經蒸餾水透析7天得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0023]實施例6:
一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，包括如下步驟:
(1)將去除表面雜質干凈的魚皮、魚鱗、魚鰾剪切成小塊，并用破碎機切成100目的魚
粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入占魚粉質量為7倍的蒸餾水和反應酶攪拌制成漿液，其中反應酶由堿性脂肪酶:菠蘿蛋白酶=1:3組成,反應酶加入量占魚粉質量的0.7%,配制好的漿液在1.5個標準大氣壓、15kHz的超聲處理下控制反應溫度為55°C，pH為8，攪拌
0.5h進行酶解反應；(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入占其質量0.1%的氫氧化鈉，并加熱至90°C，攪拌30min ；
(4)過濾漿液，將濾液置于截留分子量為300KD的透析袋中經蒸餾水透析7天得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0024]實施例7:
實驗條件篩選:
(1)將去除表面雜質干凈的魚皮、魚鱗、魚鰾剪切成小塊，并用破碎機切成200目的魚
粉；
(2)在密閉容器中加入魚粉，再加入占魚粉質量為9倍的蒸餾水和反應酶攪拌制成漿液，反應酶加入量占魚粉質量的0.7%，配制好的漿液在3個標準大氣壓、15kHz的超聲處理下控制反應溫度為65°C，調節pH值，攪拌0.5h進行酶解反應；
(3)在步驟(2)反應后得到的漿液中加入占其質量0.4%的氫氧化鈉，并加熱至80°C，攪拌70min ；
(4)過濾漿液，將濾液置于截留分子量為100KD的透析袋中經蒸餾水透析7天得到透明的魚膠原蛋白溶液。
[0025]具體操作時，以反應酶的組成種類和酶解pH中一個為變量(參見表一、二、三)，并通過如下公式計算提取率，確定最佳實驗條件。
[0026]膠原蛋白含量測定(以羥脯氨酸含量計)及純度、提取率計算，按照IS03496:1978(E)方法，測定羥脯氨酸含量。膠原蛋白含量等于羥脯氨酸含量乘以系數11.1。
[0027]膠原純度=11.lml/m2X 100%
其中，ml—測定的羥脯氨酸質量(g)，m2—測定羥脯氨酸時稱取的膠原質量(g)。
[0028]膠原蛋白提取率=(膠原純度XM1/M2) 100%
其中，Ml——成品膠原的質量(g), M2——魚體廢棄物的質量(g)。
[0029]表一改變反應酶的組成
【權利要求】
1.一種酶解法快速提取魚膠原蛋白的方法，其特征是:包括如下步驟， 將干凈的魚體廢棄物剪切成成50~200目的魚粉； 在密閉容器中加入魚粉，再加入蒸餾水、反應酶攪拌制成漿液，漿液在高壓、超聲處理下控制反應溫度為50~70°C，pH為7-9，攪拌0.5~2h ; 在步驟(2)反應后得到的漿液中加入少量氫氧化鈉，并加熱至80~90°C，攪拌20~30min ； 過濾漿液，濾液經透析得到透明的魚膠原蛋白溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是:步驟(2)中所述的蒸餾水質量為所述的魚粉質量的3~10倍。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的反應酶是指脂肪酶與蛋白酶的混合物；其中脂肪酶是指中性脂肪酶和/或堿性脂肪酶，蛋白酶是指菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶和/或膜蛋白酶。
4.如權利要求3所述的方法，其特征是:所述的反應酶加入質量占魚粉質量的0.1~1%，其中脂肪酶與蛋白酶的質量比為1:2~4。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的高壓是指控制密閉容器中的壓力在1.5~3個標準大氣壓；所 述的超聲處理是指采用超聲波發生器使密閉容器中的物質處于15~25kHz的超聲處理。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的氫氧化鈉加入量占步驟(2)反應后漿液質量的0.1-0.5%。
7.如權利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的透析是指將濾液置于透析袋中經蒸餾水透析4-7天，其中所述的透析袋為截留分子量為1-300KD。
8.如權利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的魚體廢棄物是指魚皮、魚鱗和/或魚鰾。
【文檔編號】C12P21/06GK103789382SQ201410050681
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月14日 優先權日:2014年2月14日
【發明者】鐘春燕, 鐘宇光 申請人:鐘春燕