一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種植物細胞懸浮培養方法，特別是一種鹿蹄草細胞懸浮方法，屬生物【技術領域】。本發明鹿蹄草細胞懸浮培養方法包括外植體的選擇與滅菌，愈傷組織誘導，細胞懸浮培養，培養細胞的擴大繁殖四個步驟。本發明可在較短時間內獲得大量鹿蹄草懸浮細胞，解決鹿蹄草資源需求問題，具有生產周期短，增殖速度快的優點，可用于藥用植物成分的提取和制藥工業。
【專利說明】一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物細胞懸浮培養方法，特別是一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法，屬生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]鹿蹄草(Pyrolarotundifolia L)為鹿蹄草科(Pyrolaceae)鹿蹄草屬(Pyrola)植物，具有較高的藥用價值。有文獻報道其具有增強機體免疫力、改善心腦血管系統功能等藥效，并應用于腸道感染、肺炎、高血壓等疾病的治療，療效顯著。目前該植物資源基本來源于野生采挖，難以大規模應用，且對采集地生態環境及野生鹿蹄草資源造成極大損害。雖然已有研究人員對鹿蹄草的引種馴化進行了研究與探討，但依然存在引種馴化率低，栽培條件難于控制等問題。本發明提供一種鹿蹄草細胞懸浮培養的方法，能夠在較短時間內獲得大量鹿蹄草懸浮細胞，通過生物技術手段解決鹿蹄草資源需求的問題。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法，該方法能夠在較短時間內獲得大量鹿蹄草懸浮細胞，可為提取鹿蹄草有效成分提供充足原料。
[0004]本發明采用如下技術方案:
[0005](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無病害的鹿蹄草葉片，無菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，隨后放入0.1%~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，隨后用無菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺中進行。
[0006](2)愈傷組織誘導:在超凈工作臺中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無菌手術刀切成邊長3~8mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導培養基上。愈傷組織誘導培養基配方為:MS+6-BA0.3 ~0.7mg / L+2, 4-D0.3 ~0.7mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L+ 瓊脂 5 ~8g / L，PH值為5.6~6.0 ;培養溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強度1000~30001x。
[0007](3)細胞懸浮培養:在超凈工作臺中，將生長良好的愈傷組織用無菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細胞液體培養基中振蕩培養。懸浮細胞液體培養基配方為:MS+6_BA0.5~
1.0mg/L+2, 4-D0.2 ~0.5mg / L+蔗糖 20 ~40g / L，PH 值為 5.6 ~6.0 ;接種量為每IOOmL培養基中加入10~50g愈傷組織，培養溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強度1000~30001x，振蕩速度30~lOOrpm。培養10~15d，得到鹿蹄草懸浮細胞。
[0008](4)培養細胞的擴大繁殖:在無菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細胞按照體積比1: 10~1: 15的比例接種至增殖培養基中，振蕩培養。增殖培養基配方為:MS+6-BA0.2 ~0.6mg/L+2, 4-D0.3 ~0.5mg / L+蔗糖 20 ~40g / L，PH 值為 5.6 ~6.0 ;培養溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強度1000~30001x，振蕩速度30~lOOrpm，得到大量鹿蹄草懸浮細胞。
[0009]采用本發明制備鹿蹄草懸浮細胞，生產周期短、增殖速度快、產量大、能耗少，操作便捷，利于大規模生產操作。【具體實施方式】
[0010]實施例一:
[0011](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無病害的鹿蹄草葉片，無菌水清洗2遍，在75 %乙醇中浸泡2min，隨后放入0.1 %的HgC12溶液中浸泡25s，隨后用無菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺中進行。
[0012](2)愈傷組織誘導:在超凈工作臺中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無菌手術刀切成邊長5mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導培養基上。培養基配方為:MS+6-BA0.4mg /L+2，4-D0.4mg/L+蔗糖30g / L+瓊脂6g / L，PH值為5.8 ;培養溫度為25°C，每天光照0h，即黑暗培養。
[0013](3)細胞懸浮培養:在超凈工作臺中，將生長良好的愈傷組織用無菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細胞液體培養基中振蕩培養。培養基配方為:MS+6-BA0.7mg /L+2, 4-D0.3mg / L+蔗糖30g / L，PH值為5.8 ;接種量為每IOOmL培養基中加入20g愈傷組織，培養溫度為25°C，每天光照0h，即黑暗培養，振蕩速度80rpm。培養10d，得到鹿蹄草懸浮細胞。
[0014](4)培養細胞的擴大繁殖:在無菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細胞按照體積比1: 10的比例接種至增殖培養基中，震蕩培養。培養基配方為:MS+6-BA0.3mg /L+2, 4-D0.4mg / L+蔗糖30g / L，PH值為5.8 ;培養溫度為25°C，每天光照0h，即黑暗培養，振蕩速度80rpm。培養15d ，3000rpm離心得鹿蹄草細胞，稱鮮重，與步驟(2)中所得愈傷組織相比，增重12倍。
[0015]實施例二:
[0016](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無病害的鹿蹄草葉片，無菌水清洗2遍，在75 %乙醇中浸泡Imin，隨后放入0.15 %的HgCl2溶液中浸泡40s，隨后用無菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺中進行。
[0017](2)愈傷組織誘導:在超凈工作臺中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無菌手術刀切成邊長3mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導培養基上。培養基配方為:MS+6-BA0.3mg /L+2，4-D0.3mg/L+蔗糖20g / L+瓊脂5g / L，PH值為5.6 ;培養溫度為20°C，每天光照16h，光照強度lOOOlx。(3)細胞懸浮培養:在超凈工作臺中，將生長良好的愈傷組織用無菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細胞液體培養基中振蕩培養。培養基配方為:MS+6-BA0.5mg /L+2, 4-D0.2mg / L+蔗糖20妙L，PH值為5.6 ;接種量為每IOOmL培養基中加入IOg愈傷組織，培養溫度為20°C，每天光照16h，光照強度10001X，振蕩速度30rpm。培養15d，得到鹿蹄草懸浮細胞。
[0018](4)培養細胞的擴大繁殖:在無菌條件下，將步驟⑶中所得鹿蹄草懸浮細胞按照體積比1: 15的比例接種至增殖培養基中，振蕩培養。培養基配方為:MS+6-BA0.2mg /L+2, 4-D0.3mg / L+蔗糖20g / L，PH值為5.6 ;培養溫度為20°C，每天光照16h，光照強度ΙΟΟΟΙχ，振蕩速度30rpm。培養15d，3000rpm離心得鹿蹄草細胞，稱鮮重，與步驟(2)中所得愈傷組織相比，增重8倍。
[0019]實施例三:
[0020](I)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無病害的鹿蹄草葉片，無菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡3min，隨后放入0.1%的HgC12溶液中浸泡20s，隨后用無菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺中進行。
[0021](2)愈傷組織誘導:在超凈工作臺中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無菌手術刀切成邊長8mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導培養基上。培養基配方為:MS+6-BA0.7mg /L+2, 4-D0.7mg / L+蔗糖40g / L+瓊脂8g / L，PH值為6.0 ;培養溫度為30°C，每天光照16h，光照強度10001χ。
[0022](3)細胞懸浮培養:在超凈工作臺中，將生長良好的愈傷組織用無菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細胞液體培養基中振蕩培養。培養基配方為:MS+6-BA1.0mg /L+2, 4-D0.5mg / L+蔗糖40g / L，PH值為6.0 ;接種量為每1OOmL培養基中加入50g愈傷組織，培養溫度為30°C，每天光照16h，光照強度10001χ，振蕩速度lOOrpm。培養10d，得到鹿蹄草懸浮細胞。
[0023](4)培養細胞的擴大繁殖:在無菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細胞按照體積比1: 12的比例接種至增殖培養基中，振蕩培養。培養基配方為:MS+6-BA0.6mg /L+2, 4-D0.5mg / L+蔗糖40g/L，PH值為6.0 ;培養溫度為30°C，每天光照16h，光照強度10001χ，振蕩速度lOOrpm。培養15d，3000rpm離心得鹿蹄草細胞，稱鮮重，與步驟(2)中所得愈傷組織相比，增重10倍。
【權利要求】
1.一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法，其特征在于按照如下步驟進行: (1)外植體的選擇與滅菌:以鹿蹄草葉片作為外植體。采集健康無病害的鹿蹄草葉片，無菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，隨后放入0.1%~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，隨后用無菌水清洗5遍。所有操作在超凈工作臺中進行。 (2)愈傷組織誘導:在超凈工作臺中，將滅菌后的鹿蹄草葉片用無菌手術刀切成邊長3~8mm的小葉片，接種到愈傷組織誘導培養基上，培養溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強度1000~30001x。 (3)細胞懸浮培養:在超凈工作臺中，將生長良好的愈傷組織用無菌研缽碾碎分散，接種到懸浮細胞液體培養基中振蕩培養,接種量為每IOOmL培養基中加入10~50g愈傷組織，培養溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強度1000~30001x，振蕩速度30~IOOrpm0培養10~15d。(4)培養細胞的擴大繁殖:在無菌條件下，將步驟(3)中所得鹿蹄草懸浮細胞按照體積比1: 10~1: 15的比例接種至增殖培養基中，振蕩培養，培養溫度為20~30°C，每天光照O~16h，光照強度1000~30001x，振蕩速度30~lOOrpm。
2.如權力要求I所述的一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法，其特征在于步驟(1)中外植體為健康無病害的鹿蹄草葉片，外植體清洗過程為無菌水清洗2遍，在75%乙醇中浸泡I~3min，隨后放入0.1 %~0.15%的HgC12溶液中浸泡20~40s，隨后用無菌水清洗5遍。
3.如權利要求1所述的一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法，其特征在于步驟(2)中愈傷組織培養基配方為:MS+6-BA0.3 ~0.7mg / L+2, 4-D0.3 ~0.7mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L+瓊脂5~8g / L，PH值為5.6~6.0。
4.如權利要求1所述 的一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法，其特征在于步驟(3)中懸浮細胞液體培養基配方為:MS+6-BA(X 5~L Omg/L+2, 4-D0.2~(λ 5mg / L+蔗糖20~40g /L, PH 值為 5.6 ~6.0。
5.如權利要求1所述的一種鹿蹄草細胞懸浮培養方法，其特征在于步驟(4)中增殖培養基配方為:MS+6-BA0.2 ~0.6mg / L+2, 4-D0.3 ~0.5mg / L+ 蔗糖 20 ~40g / L，PH 值為 5.6 ~6.0。
【文檔編號】C12N5/04GK103789253SQ201410080698
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】高寧, 劉博 , 程玉鵬 申請人:高寧