慢病毒干擾載體pll3.7-Neo及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo及其構建方法。該載體是以pll3.7作為骨架質粒，通過PCR擴增的方法在質粒pEGFP-C3中的SV40啟動子序列及其Neo/Kana的基因表達框兩端加入Not1和EcoR1的酶切位點，并將此序列克隆入pll3.7質粒，從而替換pll3.7中的CMV啟動子序列及其下游的GFP基因表達框，構建成帶有Neo/Kana篩選標志并且不表達GFP蛋白的pll3.7-Neo慢病毒干擾載體。該干擾載體帶有Neo篩選標志，并且去除了GFP的基因表達框，便于對各種蛋白的過表達和敲除同時進行，并且不影響對目的蛋白在細胞中定位的觀察。
【專利說明】慢病毒干擾載體pi 13.7-Neo及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種以pll3.7為骨架，去除了 GFP蛋白的表達序列并且插入Neo篩選標志的慢病毒干擾載體。
【背景技術】
[0002]慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)基礎上改造而成的病毒載體系統。它能高效的介導基因表達或RNAi干擾作用，具有廣泛感染譜，可以有效的感染分裂期和靜止期細胞，并且能夠長期穩定表達外源基因，因此成為導入外源基因的有力工具。目前市售的各種慢病毒載體主要分為兩大類，一類是過表達載體，另一類是干擾載體。這兩類載體大都帶有puix)抗性基因和(或)綠色熒光蛋白GFP基因，便于穩定細胞株的篩選和目的蛋白的定位。在細胞生物學以及細胞信號通路的研究中，往往需要在細胞中同時過表達或者敲除多個蛋白，然而現有慢病毒載體篩選標志基因的單一性，無法滿足在一株細胞中同時過表達或者敲低兩個以上蛋白，限制了慢病毒感染技術在復雜信號通路研究中的應用。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是針對現有的慢病毒載體存在的問題，發明一種帶有Neo篩選基因，但刪除GFP蛋白表達序列的慢病毒載體，從而便于對各種蛋白的過表達和敲除同時進行，并且不影響對目的蛋白在細胞中定位的觀察。
[0004]本發明提供的一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo,其核苷酸序列為SEQ ID NO:1。
[0005]本發明提供的一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo的構建方法，包括如下步驟:
[0006](I)、根據pEGFP -C3載體中的從2160到3672共1512個堿基對，即SV40和Neo/Kana片段的堿基序列設計上下游引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且在上下游引物中分別加入Notl和EcoRl的酶切位點；
[0007](2)利用PCR擴增技術，以PEGFP-C3質粒為模板，擴增SV40和Neo/Kana片段，瓊脂糖電泳后切膠回收；然后利用Notl和EcoRl切除片段兩端的保護堿基；
[0008](3)pll3.7質粒經Notl和EcoRl雙酶切，切除從3065到4431共1366個堿基對，即CMV和GFP片段，瓊脂糖電泳，將大片段切膠后回收；
[0009](4)利用T4連接酶將上述經Notl和EcoRl雙酶切后SV40和Neo/Kana片段與P113.7的大片段連接，轉化大腸桿菌DH5a后，將菌液涂在含有卡那霉素的LB培養平板上，過夜培養；
[0010](5)挑取單克隆，進行擴大培養；提質粒后進行PCR鑒定和酶切鑒定，結果分別如圖1、2，表明構建成功，構建成功的pll3.7-Neo載體的結構如圖3所示，核苷酸序列為SEQID NO:1。
[0011]本發明慢病毒干擾載 體pi 13.7-Neo帶有Neo篩選標志，并且去除了 GFP的基因表達框，其便于對各種蛋白的過表達和敲除同時進行，并且不影響對目的蛋白在細胞中定位的觀察，為細胞復雜信號通路的研究提供了新的工具。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1:PCR鑒定pll3.7-Neo載體構建成功的PCR產物電泳圖。圖中:M泳道為核酸maker, I泳道以pEGFP_C3載體為模板，2泳道以新構建的pll3.7-Neo載體為模板。
[0013]圖2:pll3.7載體雙酶切產物電泳圖。圖中:M泳道為核酸maker，I泳道為pi 13.7-Neo載體雙酶切產物。2泳道為pi 13.7載體雙酶切產物。
[0014]圖3:構建成功的pll3.7-Neo載體結構圖。
[0015]圖4:pll3.7-Neo-β-catenin重組載體的菌液PCR產物電泳圖。圖中M泳道為核酸maker，I泳道以pi 13.7-Neo載體為模板作為對照。2-7泳道為pll3.7-Neo-β -catenin-1,8-13 泳道為 ρ113.7_Neo_β-catenin-2,14-19 泳道為pll3.7-Neo-β -catenin-3。
[0016]圖5:ρ113.7-Neo-β-catenin重組載體測序圖。圖中I為pll3.7-Neo-β -catenin-1 的測序結果，圖中 2 為 pll3.7-Neo-β -catenin-2 的測序結果，圖中3為pi 13.7-Neo-β-catenin-3的測序結果。
[0017]圖6:Western Blot實驗檢測β-catenin蛋白表達量。
[0018]圖7:Realtime_PCR 實驗檢測 β-catenin mRNA 達量。
【具體實施方式】
[0019]以下具體實施例是為了進一步闡述本發明，而不用于限定本發明的范圍。實施例中未注明具體試驗條件和試驗方法的按照常規條件或制造廠商所建議的條件實施。
[0020]本發明所使用的各種器材和試劑盒均為本領域所熟知的產品，可市售獲得。
[0021]實施例1
[0022]1、根據pEGFP-C3載體中的從2160到3672共1512個堿基對，即SV40和Neo/Kana片段的堿基序列設計引物，并且在上下游引物中分別加入Notl和EcoRl的酶切位點。引物序列為SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0023]2、利用PCR擴增技術，以pEGFP-C3質粒為模板，用上述引物擴增SV40和Neo/Kana片段，瓊脂糖電泳后切膠回收。然后利用Notl和EcoRl將擴增片段兩端的保護堿基切除。
[0024]3、ρ113.7質粒在37。。經Notl和EcoRl雙酶切2h,切除從3065到4431共1366個堿基對，即CMV和GFP片段，瓊脂糖電泳，將大片段切膠后回收。
[0025]4、利用T4連接酶將PCR擴增出的SV40和Neo/Kana片段與上述經Notl和EcoRl雙酶切后的P113.7的大片段在16°C過夜連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α后，將菌液涂在含有卡那霉素的LB培養平板上，過夜培養。
[0026]5、 挑取單克隆于5mlLB培養基中進行擴大培養，提取質粒后進行PCR鑒定和酶切鑒定，結果分別如圖1、2，表明構建成功，構建成功的P113.7-Neo載體的結構如圖3所示，核苷酸序列為SEQ ID NO =10
[0027]實施例2
[0028]本實施例以在過表達融合蛋白GFP-GRP78的DLDl穩定細胞株中敲除β -catenin為例做進一步說明，具體步驟如下:[0029]1、針對人源的 β-catenin (GenBank ΝΜ_001098209.I)基因，設計三條 shRNA 干擾序列，并且在序列的兩端分別加入Hpal和Xhol的酶切位點，分別命名為β-catenin-1、β _catenin_2、i3_catenin_3。
[0030]
【權利要求】
1.一種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo,其特征在于核苷酸序列為SEQ ID NO:1。
2.—種慢病毒干擾載體pll3.7-Neo的構建方法，其特征在于包括如下步驟: (1)根據PEGFP-C3載體中SV40和Neo/Kana片段的堿基序列設計上下游引物SEQIDNO:2和SEQ ID NO:3，并在上下游引物中分別加入Notl和EcoRl的酶切位點； (2)利用PCR擴增技術，以PEGFP-C3質粒為模板，擴增SV40和Neo/Kana片段，瓊脂糖電泳后切膠回收；然后利用Notl和EcoRl切除片段兩端的保護堿基； (3)pll3.7質粒經Notl和EcoRl雙酶切，切除CMV和GFP片段，瓊脂糖電泳，將大片段切膠后回收； (4)利用T4連接酶將上述經Notl和EcoRl雙酶切后SV40和Neo/Kana片段與pll3.7的大片段連接，轉化大腸桿菌DH5α后，將菌液涂在含有卡那霉素的LB培養平板上，過夜培養; (5)挑取單克隆，進行擴大培養；提質粒后進行PCR鑒定和酶切鑒定。
【文檔編號】C12N15/867GK103882062SQ201410092705
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】李宗偉, 張立超, 李漢卿, 李卓玉, 史通麟, 武海麗 申請人:山西大學