一種用于弓形蟲感染預防的疫苗和制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明首先提供一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列：1）序列表中SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列；2）與1）中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；3）對上述1）或2）所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預防功能的核苷酸序列。本發明還提供一種疫苗，其包括上述的核苷酸序列，以及醫學上可接受的載體。本發明的質粒DNA疫苗pVAX-HSP60可有效地預防和控制弓形蟲動物模型（昆明鼠）的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質粒pVAX-HSP60能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
【專利說明】一種用于弓形蟲感染預防的疫苗和制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學和分子生物學領域，具體地，涉及一種用于弓形蟲感染預防的疫苗。
【背景技術】
[0002]弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種呈世界性分布的專性細胞內寄生原蟲,具有十分廣泛的宿主范圍，能感染包括人類在內的幾乎所有的所有溫血動物。該病原能夠通過先天性或獲得性途徑感染宿主，絕大多數感染為隱性感染，并不表現出明顯的臨床癥狀；但對于惡性腫瘤、器官移植及艾滋病患者等免疫抑制及免疫缺陷人群卻是主要的致死病因。
[0003]在人類感染群體中，孕婦的發病率較高，且危害嚴重。弓形蟲可通過胎盤屏障垂直傳播給胎兒，常引起早產、流產、畸胎、死胎等不良癥狀，而且存活的胎兒也常伴有先天性疾病，如:智力障礙、弓形蟲性腦膜腦炎、中樞神經系統損傷和/或弓形蟲眼病等。在畜禽感染群體中，弓形蟲感染可引起體溫升高、腹瀉等癥狀，嚴重時可導致母畜早產、流產或死胎，并能和其他病原微生物 協同作用，造成嚴重的公共安全問題并會給畜牧業生產帶來巨大的經濟損失，因此防控弓形蟲病已刻不容緩。由于在臨床上常用的磺胺、嘧啶類藥物防治弓形蟲病時對人和動物的毒副作用較大，且容易復發，不能殺死包囊，并往往形成藥物殘留等問題，因此疫苗防治弓形蟲病成為控制該病流行最有效的措施之一。因DNA疫苗可誘發機體全身性的細胞和體液免疫應答而成為抗弓形蟲疫苗研究的熱點，而且這種有效的體液免疫免疫應答產生的特異性抗體，CD4+依賴的輔助性T淋巴細胞反應和CD8+依賴的細胞毒性T淋巴細胞應答是在抗弓形蟲感染動物模型中的重要因素。
[0004]目前，國內外學者對弓形蟲DNA疫苗的研究主要集中于一些與弓形蟲入侵宿主和致病毒力因子上，如:弓形蟲棒狀體蛋白(rhoptry protein, R0P)包括ROPl和R0P2，R0P18, R0P16,和 R0N4 等，致密顆粒抗原(dense granules antige, GRA)包括 GRA4, GRA6和GRA7等，微線體蛋白(microneme protein, MIC)包括MIC4, MIC8和MIC6等，以及膜表面抗原(surface antige, SAG)如:SAGl等。通過對這些疫苗候選抗原進行的免疫保護性的探索研究表明，它們都具有免疫原性并能誘導產生細胞和體液免疫應答以抵抗弓形蟲的攻擊感染，具有一定的免疫保護力，但是并沒有達到所期望的完全保護性效果。究其原因，由于弓形蟲生活史復雜，形態多樣，宿主范圍廣泛，不同性質的抗原其免疫原也不同，而其包囊和速殖子的致病機制也存在差異，雖然能找到各種不同的單一抗原成分為基礎的疫苗候選抗原，但是由于其含有的淋巴細胞結合位點少、受機體主要組織相容性復合體(Majorhistocompatibility complex, MHC)限制性大,而難以形成有效的抵抗力對抗弓形蟲不同形態的攻擊感染。因此僅靠這些少數的候選抗原基因也很難達到理想的效果，而找到更多的，更好的來源于不同弓形蟲階段的DNA疫苗候選抗原，尤其是與弓形蟲毒力相關的抗原基因是研究抗弓形蟲疫苗的一個重要途徑。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種用于弓形蟲感染預防的疫苗和制備方法及其應用。
[0006]熱休克蛋白，通常又稱為熱應激蛋白，是生物體在不利的環境因素刺激下應激合成的一組特殊的蛋白質，在免疫系統中扮演分子伴侶角色，在抗原經典遞呈與交叉遞呈途徑、巨噬細胞與淋巴細胞的活化以及樹突狀細胞的活化成熟中發揮重要作用。HSP蛋白家族成員參與弓形蟲的多個生物學過程，是其重要的毒力因子。弓形蟲熱休克蛋白60 (heatshock protein60,TgHSP60)是熱休克蛋白60亞家族的一員。該蛋白高度保守,定位于弓形蟲的線粒體中，是宿主抗原遞呈細胞活化的信號，能夠誘導宿主細胞因子的釋放和刺激免疫應答的產生，且具有分子伴侶的作用，而且可通過Toll樣受體4(Toll_like receptor4)介導宿主的先天性免疫應答以及細胞因子的釋放。因此，弓形蟲HSP60有望成為理想的疫苗候選抗原。
[0007]本發明提供一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列:
[0008]I)序列表中SEQ ID N0.1中所示的核苷酸序列；
[0009]2)與I)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；
[0010]3)對上述I)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預防功能的核苷酸序列。
[0011]本發明的第二個目的是提供一種重組蛋白，其氨基酸序列由權利要求1所述的核苷酸序列編碼。
[0012]優選地，所述重組蛋白的氨基酸序列參見序列表中SEQ ID N0.2。
[0013]本發明的第三個目的是提供一種重組載體，其包括權利要求1所述的核苷酸序列。
[0014]本發明的第四個目的是提供一種重組質粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列。
[0015]本發明的第五個目的是提供一種疫苗，其包括權利要求1所述的核苷酸序列，以及醫學上可接受的載體。
[0016]本發明的第六個目的是提供上述的核苷酸序列、重組蛋白、重組載體、重組質粒、疫苗在弓形蟲感染預防中的應用。
[0017]本發明的第七個目的是提供一種上述的疫苗的制備方法，步驟如下:
[0018](I)提取弓形蟲RH株總RNA;
[0019](2) RT-PCR 擴增 RH 株總 RNA ；
[0020](3)將步驟2中的擴增產物與載體連接；
[0021](4) pVAX I質粒的小量提取；
[0022](5)回收pVAX I載體及目的片段HSP60 ；
[0023] (6)連接pVAX I載體與目的片段HSP60 ；
[0024](7)將連接產物轉化至宿主菌中。
[0025]優選地，所述RT-PCR擴增RH株總RNA時所用引物為:
[0026]上游引物:5'-GGTACCATGCTTGCCCGCGCTTCAGC-3'；
[0027]下游引物:5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAGTACATGCCTCCCATGCCGC-3'。[0028]優選地，所述RT-PCR擴增RH株總RNA時PCR反應條件為:94°C預變性2min，94°C變性Imin, 60.4°C復性45s ;72°C延伸2min ；35個循環，最后，72°C延伸IOmin0
[0029]本發明的質粒DNA疫苗pVAX-HSP60可有效地預防和控制弓形蟲動物模型(昆明鼠)的感染，即可有效的延長小鼠的存活時間，減少腦包囊的荷蟲量。因此，質粒PVAX-HSP60能作為DNA疫苗候選抗原抗弓形蟲的感染。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中: [0031]圖1是pVAX-HSP60構建路線；
[0032]圖2是弓形蟲RH株死亡情況；
[0033]圖3 是 pMDl8_T 質粒；
[0034]圖4 是 pVAXI 質粒。
【具體實施方式】
[0035]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0036]本發明中實驗材料購自:
[0037]雌性KM鼠，6w齡左右，體重20±2g，購自蘭州大學醫學實驗中心。
[0038]宿主菌，弓形蟲RH、PRU株，pVAX I真核表達載體等材料，均為中國農業科學院蘭州獸醫研究所寄生蟲功能基因組學研究室保存并提供。
[0039]PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 (貨號:RR055B)、10XPCR Buffer(Mg2+free)>MgCl2 (25mmol/L)、dNTP Mixture (2.5mmol/L each)、Ex_Taq (5U/ μ L)(貨號:DDR100D)、pMD18-T Vector (貨號:D103A)、BamH I (貨號:D1010A)、XhoI (貨號:D1094A)、KpnI (貨號:D1068A)、PstI (貨號:D1073A)、XbaI (貨號:D1093A)、10XM BufferUOXKBuffer、10 X 6 X Loading Buffer:購自 TaKaRa 公司；
[0040]Wizard? SV Genomic DNA Purification System (貨號:A2360)、Tris-Cl、EDTA、IPTG、X-gal、T4DNA 連接酶:購自 Promega 公司；
[0041]RNAprep Pure Tissue Kit (貨號:DP431)、TIANprep Mini Plasmid Kit (貨號:DP103-02)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(貨號:貨號:DP209_02)、普通DNA產物純化試劑盒(貨號:DP204-02):購自天根生化科技(北京)有限公司；
[0042]氨節青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、瓊脂糖:購自Sigma公司；
[0043]其他化學試劑如NaCl、、無水乙醇等均為國產分析純級產品。
[0044]一、弓形蟲RH株pVAX-HSP60疫苗的制備方法如下:
[0045]1.弓形蟲RH株總RNA的提取:將弓形蟲RH株腹腔接種KM鼠，96h后，經頸椎脫臼致死，無菌收集小鼠腹水1.0mL,在10000轉/分鐘轉速下離心3~5min，棄上清，備用。用天根生化科技(北京)有限公司的試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit提取弓形蟲RH株總RNA，提取的具體方法和步驟參見說明書。
[0046]2.RT-PCR擴增:以所提取的弓形蟲RH株總RNA為模板，用大連寶生物工程公司PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒進行 HSP60 基因的 RT-PCR 擴增，使用方法參見說明書。其中，
[0047]上游引物:FHSP60:5' -GGTACCATGCTTGCCCGCGCTTCAGC-3'；
[0048]下游引物:RHSP60:5' -AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAGTACATGCCTCCCATGCCGC-3'；
[0049]PCR反應條件為:94°C預變性2min，94°C變性lmin，60.4 °C復性45s ;72 °C延伸2min ；35個循環，最后，72°C延伸IOmin0
[0050]3.PCR純化產物的連接:將步驟2中的擴增產物與PMD18連接，連接反應使用TaKaRa公司pMD?18_T Vector，使用方法參見說明書，連接條件為16°C反應2~4h或4°C連接過夜，連接產物標記為PMD18-HSP60。
[0051]4.HSP60的序列測定:將經菌液PCR和酶切鑒定均為陽性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司測序。測序結果參見序列表中SEQ ID N0.1，其編碼的蛋白序列參見序列表中 SEQ ID N0.2。
[0052]5.pVAX I質粒的小量提取:用天根生化科技(北京)有限公司TIANprep MiniPlasmid Kit進行pVAX I質粒提取,使用方法參照說明書。
[0053]6.pVAX I載體(圖4所示)及目的片段HSP60的回收:用Kpn I和Not I分別雙酶切pVAX I質粒及pMD18-HSP60重組質粒，并用天根生化科技(北京)有限公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體及目的片段，使用方法參照說明書。
[0054]7.pVAX I載體與目的片段HSP60的連接:將經切膠回收純化得到的HSP60基因片段定向亞克隆至PVAX I載體中。16 °C反應4~6h或4°C連接過夜，產物標記為pVAX_HSP60。其核苷酸序列參見序列表中SEQ ID N0.3。
[0055]8.連接產物的轉化與鑒定:將連接產物10 μ L轉化大腸桿菌DH5 α中，挑取若干單菌落作菌液PCR鑒定。產物標記為pVAX-HSP60。pVAX_HSP60構建路線見圖1。
[0056]二、培養基和溶液的配制:
[0057]a、溶液的配制:
[0058](I) LB液體培養基
[0059]稱取LB粉末5.0g，加適量的去離子水溶解，并定容至200mL，121°C高壓滅菌20min，4°C保存備用。
[0060](2) LB固體培養基
[0061]于LB液體培養基中加入2.0% (m/V)瓊脂粉，121°C高壓滅菌20min，待其冷卻到55°C~65 °C時傾注平板，待凝固后4°C保存備用。
[0062](3 ) Kan+LB選擇液體培養基
[0063]待(I)中制備的LB液體培養基高壓滅菌后冷卻至50°C~55°C時，加入Kan (卡那霉素)(終濃度為1000IU/mL)，搖晃混勻后4°C保存。
[0064](4 ) Kan+LB固體選擇培養基
[0065]待(2)中制備的LB固體培養基滅菌后冷卻至50°C~55°C時，加入Kan (終濃度為1000IU/mL)并輕輕搖動，混勻后迅速傾注平板，室溫凝固并于4°C保存備用。 [0066]b、質粒大量提取時溶液的配制:[0067](1)0.25mol/L Tris-Cl 溶液(ρΗ8.0)
[0068]稱取Tris-Cl粉末6.055g，并將其溶解到IOOmL ddH20中，調節pH值為8.0，定容到200mL，高壓滅菌后4°C保存備用。
[0069] (2) 0.5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8.0)
[0070]稱取Na2EDTA37.22g，溶于200mL ddH20中，振蕩混勻，調節pH值為8.0,高壓滅菌后4 C保存備用。
[0071](3) TE 溶液(pH8.0)
[0072]先將(I)中制備的0.25mol/L Tris-Cl溶液和(2)中制備的0.5mol/L EDTA溶液(ρΗ8.0)稀釋，并分別吸取 10mmol/L Tris-Cl 1.0mL 與 lmmol/L EDTA0.2mL，加入無菌ddH20后定容到100mL，4°C保存備用。
[0073](4) 10%SDS 溶液(pHL 2)
[0074]稱取SDS (十二烷基磺酸鈉)粉末10g，加入去離子水90mL后60°C水浴溶解，用濃HCl將其pH值調為7.2，并定容到IOOmL,現配現用，不宜長期保存。
[0075](5) 2moI/L NaOH 溶液
[0076]先于燒杯中加入去離子水160mL，稱取NaOH粉末16.0g并緩緩加入到去離子水中，邊加邊混勻，定容到200mL后于塑料瓶中4°C保存。
[0077](6) Solution I
[0078]取(I)中制備的0.25mol/L Tris-CllOmL，(2)中制備的 0.5mol/LEDTA2mL，加去離子水定容到lOOmL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0079](7) Solution II
[0080]取2mol/L NaOHlOmL, 10%SDS10mL，加去離子水定容到IOOmL,現配現用，常溫保存，不宜長時間存放。
[0081](8) Solution III
[0082]稱取KAc粉末58.884g，與冰乙酸23mL混合，加入適量去離子水溶解后定容到200mL，4°C 保存。
[0083](9) 3mol/L NaAc 溶液(ρΗ5.2)
[0084]稱取無水NaAc49.22g,加去離子水定容到200mL,高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0085](10) 5mol/L LiCl 溶液
[0086]稱取無水LiC142.4g，加去離子水定容到200mL，高壓蒸汽滅菌后4°C保存。
[0087](11) 10mg/mL 溶菌酶
[0088]使用前，稱取IOmg的溶菌酶，加lOmmol/L的Tris-Cl (PH8.0)即刻溶解定容至ImL，-20°C保存。
[0089]三、大量制備質粒
[0090]1.挑取步驟(一)和(二)中制備的已保存于-20°C的含有目的質粒(pVAX I，PVAX-HSP60)的陽性菌液于Kan+LB固體選擇培養基上劃線，37°C培養過夜。挑取板上的一個單菌落置于12mL Kan+LB液體選擇培養基中，搖床37°C，以180~220轉/分鐘的轉速培養12~16h。將上述培養菌液以體積比1:100的比例接種到裝有400mL Kan+LB液體選擇培養基的1000mL錐形瓶中，搖床37°C，在180~220轉/分鐘轉速下培養過夜。
[0091]2.將步驟I得到的細菌培養物置于冰中或4°C冰箱數分鐘，4°C，以9000轉/分鐘轉速離心5min，收集細菌培養物沉淀，棄上清(利用移液器小心吸出上清)，倒置離心管使上清盡量流出。用10mL4°C預冷的Solution I重懸菌體，旋渦振蕩，使細菌在Solution I中完全分散。(由于旋渦振蕩和Solution I的加入已足夠是菌液裂解分散，為了簡化操作，此處省去現有技術中進一步裂解分散的步驟:加入ImL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0),震蕩混勻)。
[0092]3.在步驟2得到的菌液中加入20mL新配制的Solution II，輕搖并上下顛倒混勻2~4次。再加入15mL4°C預冷的Solution III，立即輕搖混勻，以免產生局部沉淀。冰上或-20°C冰箱放置IOmin0加Solution II和Solution III的時間間隔控制在5min以內，以免過分裂解。4°C或室溫，在11000轉/分鐘下離心10min，利用4層紗布將上清過濾，轉移到兩個新50mL離心管中。
[0093]4.將步驟3得到的上清與14_16mL異丙醇(現有技術中此處需加入0.6倍體積的異丙醇的方法，本 申請人:通過實驗發現，異丙醇的加入量在0.6倍體積上下各Iml的范圍內，是不影響產物的提取質量和產量的)混勻，室溫放置lOmin。室溫下，在11000轉/分鐘下離心10min，棄上清，將空管倒置于濾紙上數分鐘，除去殘余。加入3mL ddH20充分溶解，再加入3mL預冷的5mol/L LiCl溶液(此時需先加ddH20，后加LiCl，才能使沉淀充分溶解，顛倒步驟易造成沉淀溶解不充分或不溶解)，充分混勻，此處不可用吹打的方式混勻。吹打混勻易使提取的質粒發生斷裂，兩只離心管合并為一管，冰中或_20°C冰箱放置lOmin。4°C或室溫，在11000轉/分鐘下離心10min，將上清分別轉移到一新50mL離心管中，加入等體積(12mL)預冷的異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin。4°C或室溫，在11000轉/分鐘下離心lOmin，小心棄上清，倒置控干管內液體，一般倒置10~15min即可。此時管壁會出現白色沉淀物即質粒。
[0094]5.在步驟4制備的白色沉淀物中加入3mL ddH20或TE溶液(pH8.0)溶解沉淀，并加入30 μ L10mg/mL RNase A (Takara公司產品)，37°C水浴Ih除去RNA。加入2倍體積(8mL)無水乙醇和1/10體積(400 μ L)。用3mol/L NaAc溶液，充分混勻，冰中或_20°C冰箱放置20min。4°C，在11000轉/分鐘下離心10min，小心將上清吸出(勿用傾倒的方式除去上清，易造成使吸附于管壁的沉淀分散，而非上清被倒出)，并將離心管倒置于濾紙上控干(主要控干殘余的試劑如:乙醇和NaAc，減少雜質，提高質粒的純度)。加入IOOyL ddH20或TE溶液(PH8.0)，充分洗脫質粒沉淀。利用分光光度計測量所得質粒的濃度并記錄，測出的濃度為10000mg/mL。因此，我們將以保存濃度為1000mg/mL (十倍稀釋)的量分裝于1.5mL離心管中，即每管保存有1000mg質粒,體積為ImL,分裝封口后于-20°C保存備用。
[0095]四、質粒DNA的純度檢測
[0096]以ddH20或TE (ρΗ8.0)為空白對照，用分光光度計測定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。雙鏈DNA純品的OD26tZOD28tl值為1.8，若樣品0D26(l/0D28(l值低于
1.8，說明樣品可能被蛋白質污染，需進一步純化。
[0097]五、重組質粒的免疫效果評價
[0098]1.KM鼠免疫與分組:為了降低應激反應，KM鼠買回后需飼養I周，然后將其隨機分為4個組，每組35只，具體分組見表1。
[0099]表1免疫實驗分組情況
[0100]
【權利要求】
1.一種用于弓形蟲感染預防的核苷酸序列，其含有選自以下的核苷酸序列: 1)序列表中SEQID N0.1中所示的核苷酸序列； 2)與I)中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列； 3)對上述I)或2)所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾，并具有弓形蟲感染預防功能的核苷酸序列。
2.一種重組蛋白，其氨基酸序列由權利要求1所述的核苷酸序列編碼。
3.根據權利要求2所述的重組蛋白，其特征在于:所述重組蛋白的氨基酸序列參見序列表中 SEQ ID N0.2。
4.一種重組載體，其包括權利要求1所述的核苷酸序列。
5.一種重組質粒，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
6.一種疫苗，其包括權利要求1所述的核苷酸序列，以及醫學上可接受的載體。
7.權利要求1所述的核苷酸序列、權利要求2或3所述的重組蛋白、權利要求4所述的重組載體、權利要求5所述的重組質粒、權利要求6所述的疫苗在弓形蟲感染預防中的應用。
8.—種權利要求6所述的疫苗的制備方法，步驟如下: (1)提取弓形蟲RH株總RNA;
(2)RT-PCR 擴增 RH 株總 RNA ； (3)將步驟2中的擴增產物與載體連接； (4)pVAXI質粒的小量提取； (5)回收pVAXI載體及目的片段HSP60 ； (6)連接pVAXI載體與目的片段HSP60 ; (7)將連接產物轉化至宿主菌中。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述RT-PCR擴增RH株總RNA時所用引物為: 上游引物:5' -GGTACCATGCTTGCCCGCGCTTCAGC -3'； 下游引物:5' -AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAGTACATGCCTCCCATGCCGC-3'。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于:所述RT-PCR擴增RH株總RNA時PCR反應條件為:94°C預變性2min，94°C變性Imin, 60.4°C復性45s ;72°C延伸2min ；35個循環，最后，72°C延伸IOmin。
【文檔編號】C12R1/90GK103966238SQ201410135774
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】周東輝, 路靜, 陳佳, 黃思揚, 宋慧群, 徐民俊, 朱興全 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所