子組生物單元的選擇性釋放的制作方法

子組生物單元的選擇性釋放的制作方法
【專利摘要】提供了一種從包括在異質組生物單元中的子組生物單元的實體一個或多個成員單獨釋放的方法。該方法包括通過連接體將包括所述子組生物單元的所述組生物單元結合至所述實體。結合之后，確定在所述實體上的所述一個或多個成員的位置。一旦位置被確定，則就將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員。通過分離連接體，局部物理脈沖將一個或多個成員從實體單獨釋放。
【專利說明】子組生物單元的選擇性釋放

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從包括在異質組生物單元中的子組生物單元的實體一個或多個成員單獨釋放的方法、一種通過檢測從受試者獲得的子組生物單元來檢測所述受試者疾病的方法、以及一種將子組生物單元的一個或多個成員從一組生物單元中分離的方法。

【背景技術】
[0002]用于分析細胞生物學的現代技術已經創建了日益增加的制備由同質群體細胞或者檢測或分離單個細胞或者小顆粒構成的樣品的需求。基因組和蛋白質組的研究、遺傳克隆、干細胞研究、以及基于細胞的篩選都將從增強的能力中獲益，以獲得單個細胞或小同質生物樣品用于隨后的分析。這些樣品包括各種分子，比如DNA或RNA以及細胞或生物體。
[0003]在從混合群體中選擇細胞的情況下，必須分析具有所需特征的各個細胞，之后識別和分離所需的子群。用于哺乳動物細胞的標準分類方法需要細胞分散在單細胞懸浮液中，并且采用以此方式自然生長的造血細胞是最成功的。這些方法不太適用于貼壁細胞，目前最常見的細胞表型。
[0004]通常，通過將貼壁細胞電鍍在生長表面上然后使用顯微鏡尋找它們而對它們進行分析。用于將所關注的細胞與混合群體細胞分離的傳統分選技術通常需要將貼壁細胞從它們的不利于細胞健康的生長表面酶或機械釋放，或者涉及用于基于有限稀釋或對選擇性環境的基因工程抗性的選擇的擴展協議。
[0005]分離提供適于下游分析的完好細胞或顆粒的異質群體的單個細胞或顆粒或其中的低數量的有效方法仍不見蹤影。


【發明內容】

[0006]本發明提供了用于將適于下游分析和診斷的單細胞或顆粒分離的新方法。
[0007]提供了一種從包括在異質組生物單元中的子組生物單元的實體一個或多個成員單獨釋放的方法。該方法包括通過連接體將包括所述子組生物單元的所述組生物單元結合至所述實體。結合之后，確定在所述實體上的所述一個或多個成員的位置。一旦位置被確定，則就將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員。通過分離連接體，局部物理脈沖將一個或多個成員從實體單獨釋放。
[0008]一種通過檢測從受試者獲得的子組生物單元來檢測所述受試者疾病的方法，其中，所述子組生物單元是表示此外所提供的疾病。該方法包括提供包含至少一個子組生物單元的異質組生物單元，該組生物單元從受試者獲得，且該組生物單元中的每個成員通過連接體被結合至實體，最好是固體支承。確定在實體上的子組生物單元的位置。然后，將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員。通過分離連接體，局部物理脈沖將一個或多個成員從實體單獨釋放。然后收獲子組生物單元的一個或多個成員。通過收獲子組生物單元的一個或多個成員，分離子組生物單元的一個或多個成員。然后對于存在表示該疾病的至少一個標記，分析所收獲的一個或多個成員。
[0009]公開了一種將子組生物單元的一個或多個成員從一組生物單元中分離的方法。該方法包括:
[0010]提供包括至少一個子組生物單元的異質組生物單元，該組生物單元中的每個成員通過連接體被結合至實體，最好是固體支承；以及
[0011]確定子組生物單元的所述一個或多個成員的位置；
[0012]將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員，其中，通過分離所述連接體，所述局部物理脈沖將所述一個或多個成員從所述實體單獨釋放；
[0013]分離子組生物單元的所釋放的一個或多個成員。

【具體實施方式】
[0014]描述了一種從包括在異質組生物單元中的子組生物單元的實體一個或多個成員單獨釋放的方法。該方法包括:通過連接體將包括所述子組生物單元的所述組生物單元結合至所述實體；確定在所述實體上的所述一個或多個成員的位置；將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員，其中，通過分離所述連接體，所述局部物理脈沖將所述一個或多個成員從所述實體單獨釋放。
[0015]術語“單獨釋放”是指可以釋放子組的一個或多個成員，而不釋放另一子組的任何其他成員。在一實施例中，可以單獨釋放子組的單個成員，而不釋放該子組或任何其他子組的任何其他成員。
[0016]“實體”是指子組生物單元所結合至的對象。在一實施例中，該實體是結合基體。在一實施例中，該結合基體是固體支承。下面將對固體支承的實施例進行進一步說明。
[0017]術語“子組生物單元的成員”涉及子組的單獨的部分。在其中生物單元是細胞的實施例中，成員可以是單個細胞。在其中生物單元是病毒顆粒的實施例中，成員可以是單個病毒顆粒。在其中生物單元是大分子的實施例中，成員還可以是屬于子組大分子的單個大分子。除了已經列出的實施例之外，生物單元還可以是細胞、細胞器、細胞組分的一部分，比如蛋白質核酸、受體、標記、代謝物等。任何一個所述生物單元的成員將據此得出。
[0018]術語“異質組生物單元”涉及其中不是所有成員都相同的組。組的一個或多個成員在至少一個特征方面不同于該組的其他成員。子組的一個或多個成員相同的話稱為同質子組對象。例如，異質組生物單元可以是細胞，且該組可以包括不同的細胞類型，例如表達不同表面標記的細胞。在一實施例中，這樣的表面標記可以具有特定子類型的細胞比如癌細胞的特征。
[0019]如上所述,包括子組生物單元的一組生物單元通過連接體結合至實體。該連接體是能夠結合該組生物單元的成員和該組生物單元的成員所結合至的實體的結構。因此，連接體形成了成員與實體之間的連接，從而允許成員被結合至實體。此外，連接體被形成為使得其可以在施加物理脈沖時被分解成多個部分。然后，這使得可以從實體釋放成員。下面對連接體的具體實施例作進一步說明。
[0020]在一實施例中，生物單元通過使用離心被固定在實體上。離心以足以允許細胞更迅速地接觸實體而不會對細胞造成損害的速度進行。在一實施例中，細胞與實體直接接觸。在另一實施例中，細胞與連接至實體的連接體接觸。這種方法的優點在于可以更迅速地固定細胞。本文將對用于實施該方法的示例性裝置進行說明。
[0021]在上述方法中，確定所述一個或多個成員的位置。所述一個或多個成員的位置的確定可以采用本領域技術人員所公知的任何合適的裝置來完成。在一實施例中，該位置的確定通過采用顯微鏡、掃描顯微鏡或光學掃描儀觀察來進行。在一實施例中，采用特別結合至子組生物單元的一個或多個成員的熒光染料使所述一個或多個成員可見，并且光學熒光顯微鏡可用來定位。在一實施例中，顯微鏡是具有照相機和掃描或定位平臺的自動顯微鏡，自動基于一個或多個成員的染色或它們的形狀等，使用自動圖像處理來找到一個或多個成員的位置。限定一個或多個成員的位置的坐標列表然后被轉移至控制單元，用于定位物理脈沖來釋放一個或多個成員。在另一實施例中，顯微鏡是手動顯微鏡。操作者選擇子組生物單元的一個或多個成員。子組生物單元的所選擇的一個或多個成員的坐標列表被轉移至控制單元，用于定位物理脈沖來釋放一個或多個成員。
[0022]一旦確定子組生物單元的一個或多個成員的位置，則就將局部物理脈沖施加至要被釋放的一個或多個成員。因此，可以精確地施加局部脈沖。在一實施例中，局部脈沖被施加至子組生物單元的單個成員。這具有的優點是，可以單獨或共同地釋放并收獲子組生物單元的每個成員。
[0023]在一實施例中，物理脈沖選自光子光源、熱源及布置。布置是光源或熱源與其他部件例如自由空間光學、光纖、機械布置的組合。具體的實施例集中于光源、光纖耦合光源、包括在每個交叉處具有光發射元件帶有可尋址像素的矩陣的陣列光源；或包括在每個交叉處具有電阻加熱元件帶有可尋址像素的矩陣的陣列熱源。
[0024]在一實施例中，光子光源選自LASER、LED、氣體放電燈、金屬蒸汽燈、或者其他種類的熱或非熱光源。LASER的波長可能是可見或不可見的。光源的波長可以在UV、可見光或IR的范圍內。LED可以是高功率LED。LED或高功率LED可能是可見的、不可見的或UV。
[0025]在一實施例中，熱源選自紅外LASER、紅外LED或者高功率LED或電阻加熱器。
[0026]在一實施例中，該布置可以選自聚焦光源、光纖耦合光源、陣列光源、帶有用于產生光的可尋址像素的矩陣或帶有用于產生熱的可尋址墊的矩陣。
[0027]局部物理脈沖單獨釋放將通過分離連接體被釋放的子組生物單元的一個或多個成員，從而允許所述成員從實體中分離。然后可以收獲所釋放的成員。
[0028]本文所描述的方法具有若干優點。在將生物單元比如細胞從實體釋放之前可以對其進行分析、操縱及處理。該方法允許非特定地結合至實體，即所有成員可被結合，獨立于其所屬的子組。這使得可以按順序地定位、釋放和收獲不同子組的成員，及在第一輪中，具有特征I的子組I的一個或多個成員被定位、釋放和收獲。之后，通過使用具有結合生物單元的相同實體，具有特征2的子組2的一個或多個成員可以被定位、釋放和收獲等。剩余的細胞還可以被進一步操縱和觀察，并且在該操縱后或基于另一特征，子組生物單元的新的一組成員可以被觀察、選擇、釋放及收獲。
[0029]在一實施例中，可以采用本文所述的方法來選擇、釋放和收獲單個的生物單元，比如細胞。還可以選擇、釋放和收獲多個細胞或批量的細胞。
[0030]本文所述的方法的特別優點在于，由于用于分離連接體分子的物理脈沖可以被定位，所以可以采用顯微鏡、掃描顯微鏡或光學掃描儀觀察成員，單獨地選擇和分離。
[0031]由于精確的定位和分辨率，并且由施加物理脈沖的短時間，一個或多個成員的收獲應該提供聞純度。
[0032]通過使用例如流動、重力、光鑷、機械或磁力、微移液器或操縱器，收獲可以包括用于下游分析的進入收集容積的細胞的收集。這樣的裝置對本領域技術人員來說是公知的。
[0033]采用本方法，可以實現在實體上的生物單元的高組裝密度，由于因減少浪費區域的物理脈沖的精確定位。
[0034]由于同樣的連接體分子用于結合所有的生物單元，所以可以獲得高產，獨立于成員所屬的子組。
[0035]本方法的一個特別的優點是，由于用于釋放成員的平緩的方法，可以獲得高細胞完整性。不會施加可能損害生物單元的劃痕或高力。生物單元的生理環境在成員的處理和收獲過程中保持不變。這保存所收獲的生物單元的完整性。進一步的優點是，子組生物單元的一個或多個成員可以被收獲得比使用其它機械方法要快得多，特別是如果必須釋放大量細胞的話。
[0036]通過本文描述的方法所收獲的一個或多個成員可以被直接送入下游分析，而不需要復雜的洗滌程序或附加的處理。此外，還不能污染可能影響生物單元完整性的環境液體。
[0037]在使用熱脈沖代替光脈沖的情況下，優點在于，對可用于定位要被釋放并收獲的生物單元的一個或多個成員的熒光染料的光學性能沒有干擾。此外，如果使用熱脈沖，則在光學檢測時對結合生物單元沒有干擾。
[0038]在一實施例中，光脈沖與試劑的組合可以用來釋放生物單元的一個或多個成員。這將允許在不存在試劑而不會影響結合至實體的情況下光學檢測這些成員。然后，在存在試劑的情況下，將會出現子組生物單元的一個或多個成員的釋放。在一實施例中，該試劑是光酸產生劑。
[0039]根據本發明，生物單元通過連接體結合至實體。連接體可以是任何合適的域(domain), (i)能夠將生物單元結合至實體，以及(ii)能夠采用物理脈沖來釋放子組生物單元的一個或多個成員。連接體的選擇將取決于(i)生物單元的種類，(ii)實體，以及(iii)用于釋放子組生物單元的一個或多個成員的物理脈沖。本領域技術人員要知道用于將化學化合物、核酸、蛋白質、細胞、細胞器或其他生物單元連接至實體的不同方案。連接體可以共價或非共價地結合至實體。可以實現連接至實體的表面，如本文所公開。用于結合生物單元的連接體可以在結構上相同或不同。在一具體實施例中，所述連接體是相同的。
[0040]連接體可以根據用于釋放子組生物單元的一個或多個成員的物理脈沖來限定。連接體可以包括:
[0041](i)光子可裂解部分，用于由從光源產生的物理脈沖釋放；
[0042](ii)熱可裂解部分，用于由從熱源產生的物理脈沖釋放；
[0043](iii)連接體的一部分，其可由電荷激活，以及光敏感試劑，其在由光激活時產生然后激活連接體的電荷。在本實施例中，由光脈沖所觸發的分離不會發生在加入試劑之前。
[0044]在一實施例中，連接體包括部分a和部分b，其中，在將該組生物單元結合至實體的過程中部分a結合部分b，并且部分a在施加局部物理脈沖時與部分b分離。因此，部分a和部分b是包括在連接體分子中的結合配體。取決于部分a和部分b的性質以及它們的結合機理，部分a通過特定類型的物理脈沖與部分b分離。在一實施例中，部分a通過由物理脈沖產生的熱與部分b分離。在一實施例中，部分a在被結合的成員的位置在高達50°C的溫度與部分b分離。本實施例的優點在于，不會損害被釋放的生物單元的成員。這是如果生物單元是活細胞的特別情況。在一實施例中，所述部分a通過光子引起的構象變化與部分b分離。
[0045]在一實施例中，所釋放的一個或多個成員在釋放后被收獲。然后，所收獲的一個或多個成員可以經受特定的處理或分析。在收獲從實體釋放的一個或多個成員之后，進一步的一個或多個成員從實體釋放。進一步的一個或多個成員可以屬于相同的子組，或者它們可以屬于通過連接體結合至實體的不同的子組生物單元。
[0046]在一實施例中，該組生物單元是包括子組細胞的異質組細胞。細胞的一個或多個成員在至少一個特征方面不同于細胞的另外一個或多個成員。因此，一子組細胞也在至少一個特征方面不同于另一子組細胞。在一實施例中，子組細胞包括一個或多個成員，其中所述一個或多個成員是稀有細胞。稀有細胞是在異質組細胞內低頻出現的細胞。異質組細胞內的稀有細胞的比例為至多5%。在一具體實施例中，該比例為1%。在進一步的具體實施例中，該比例為至多0.1%。在進一步的具體實施例中，該比例為至多0.01%。該方法特別用于識別和收獲稀有細胞，因為該方法允許識別單個細胞，并且從異質組細胞釋放這些單個細胞，隨后收獲以及進一步分析。稀有細胞可以是癌細胞。在一實施例中，稀有細胞可以是循環腫瘤細胞。在另一實施例中，稀有細胞可以是在患者血液中的循環腫瘤微栓子。通過使用本方法來識別稀有腫瘤細胞，可以在腫瘤本身可通過標準裝置檢測很早之前檢測出腫瘤，并且患者可以在非常早的階段得到治療，從而提高存活率。另外，通過使用此方法，還可以監測治療的進展。此外，可以分析腫瘤細胞的類型。
[0047]在一實施例中，在所述組細胞中，同質子組細胞對總細胞的比例為至多50%，尤其是在5%至50%的范圍內，特別是在10%至30%的范圍內。該方法可用于檢測更大子群的細胞，例如特定類型的細胞比如特定的血細胞。
[0048]在該方法的一實施例中，子組細胞表不疾病。在一實施例中，所述疾病是癌癥。在一實施例中，所述子組包括一種類型的細胞。
[0049]癌細胞的特征在于特定的標記。可提及的示例是:特別是致癌基因和腫瘤抑制基因比如 p53, ras 家族基因 erb-B2, c-myc, mdm2, c-fos, DPC4, FAP，nm23, RET, WTl 等，LOHS,例如關于p53，DCC，APC，Rb等，以及遺傳性腫瘤中的BRCAl和BRCA2，MSH2，MLHl，WTl等的微隨體不穩定性；以及腫瘤的RNA比如CEA，細胞角蛋白，例如CK20，BCL-2, MUC1，特別是本文的具體腫瘤的結合變體，MAGE3, Muc 18,酪氨酸酶，PSA, PSM, BA46, Mage-1等，要不然就是形態的 RNA 比如 maspin, hCG，GIP, motilin, hTG，SCCA-1, AR，ER，PR，各種激素等；此外，特別是影響轉移性更新的RNA和蛋白，即涉及血管生成、運動性、粘附性以及基質降解的表達分子，比如 bFGF，bFGF-R, VEGF, VEGF-R 比如 VEGF-Rl 或 VEGF-R2，E-鈣粘蛋白(cadherin)，整合素(integrins),選擇素(selectins), MMP, TIMP, SF, SF-R等,細胞周期分布或擴散分布，比如細胞周期蛋白(cyclins)(例如，細胞周期蛋白D，E和B的表達比)，Κ?67, pl20, p21，PCNA 等,或凋亡更新，比如 FAS (L+R), TNF (L+R),穿孔素(perforin),粒酶(granzyme) B,BAX, bcl-2,胱天蛋白酶(caspase) 3 等。
[0050]還可以針對另一種疾病。
[0051]可替代地，子群細胞包括一種細胞類型。例如，這些細胞可以是心血管細胞或血管細胞或由炎癥過程所釋放的血管細胞，或者胎兒細胞，例如母體血液中的胎兒細胞，干細胞(例如癌性干細胞)，表示微小殘留疾病的細胞，癌細胞(比如白血病細胞)，白血細胞。在本上下文中，該方法可以用于基因分型、診斷、預后，監控治療等。
[0052]在本方法的一實施例中，連接體包括寡核苷酸，其中部分a是第一寡核苷酸，部分b是部分地互補于第一寡核苷酸序列的第二寡核苷酸。
[0053]在一實施例中,連接體的部分b包括標記物b,其中所述實體涂有用于所述標記物b的結合配體(bpb)。因此,連接體的部分b可以結合至在實體上的結合配體bpb來固定連接體和生物單元。在一實施例中，標記物b是生物素，結合配體bpb是抗生物素蛋白。對于本領域技術人員來說，可以用于將連接體的部分b結合至實體的進一步的結合配體對是熟知的。
[0054]在所述連接體的一實施例中，連接體包括能夠結合該子組的成員的細胞結合部分。此細胞結合部分應非特定地結合至成員。這確保沒有特定子組生物單元的選擇。該細胞結合部分在部分a與部分b分離時與部分b分離。因此，該細胞結合部分與連接體的部分a相關聯。在一實施例中,連接體的細胞結合部分與連接體的部分a共價地相關聯。這種實施例的示例示于圖2b)中。在另一實施例中，細胞結合部分通過非共價結合與部分a相關聯。在一具體實施例中，細胞結合部分包括標記物c,部分a包括標記物a。在該實施例中，標記物c和標記物a能夠將結合配體bpa非競爭性地結合。這種實施例的示例示于圖2a)中。bpa和bpb可以是相同類型的結合配體。然而，在一實施例中，部分a和c的標記物不同于部分b的標記物。在該實施例中，用于部分a和c的標記物的結合配體bpa不同于部分b的標記物的結合配體bpb。
[0055]在一進一步的實施例中，所述連接體包括細胞連接體，其包括能夠以非競爭性的方式結合至部分a的結合配體的標記物。該細胞連接體還包括能夠結合生物單元的生物單元結合部分。
[0056]因此，在一具體實施例中，連接體被設計成如圖3所示。
[0057]連接體的可分離部分是部分a與部分b，如本文所述。
[0058]目前，可在連接體中用作標記物的許多親和標記物是公知的。通常根據尺寸將這些分成3類:小標記物最多具有12個氨基酸，中等尺寸的標記物最多具有60個，大標記物具有60個以上。小標記物包括Arg-標記物、His-標記物、Strep-標記物、FLAG標記物、T7-標記物、V5-肽標記物、c-Myc-標記物，中等尺寸的標記物包括S-標記物、HAT-標記物、鈣調蛋白結合肽、幾丁質結合肽以及一些纖維素結合域。后者可以包含多達189個氨基酸，且然后同GST-和MBP-標記物一樣被看作大親和標記物。
[0059]可能的標記物和結合配體對包括但不限于生物素-抗生物素蛋白或鏈霉親和素。進一步的示例性成對標記物和標記物結合配體包括:
[0060]6xHis/ 六-His 抗體
[0061]5xHis/ 五-His 抗體
[0062]RGSHHHH/RHS-His 抗體
[0063]4xHis/ 四-His 抗體
[0064]GST-標記物/GST-標記物抗體
[0065]鏈球菌標記物/鏈霉親和素
[0066]生物素/鏈霉親和素
[0067]GST-標記物/GST抗體
[0068]Flag-標記物(例如DYKDHK或DYKDDD) /Flag-標記物抗體
[0069]此外，可以使用半抗原及相應的抗體。半抗原是用于許多分子生物學應用中的具有高免疫原性的小分子。流行的半抗原包括地高辛DNP (二硝基苯酚)、生物素以及熒光素。
[0070]本發明進一步涉及一種通過分離和分析從受試者中所獲得的子組生物單元來檢測所述受試者的疾病的方法。該方法包括提供包含至少一個子組生物單元的異質組生物單元，所述組生物單元從受試者獲得，且該生物單元的每個成員通過連接體結合至實體，最好是固體支承。此外，該方法包括確定所述子組生物單元的位置。一旦位置被確定，則該方法就包括將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員，其中所述局部物理脈沖通過分離所述連接體來將所述一個或多個成員從所述實體單獨釋放。從實體釋放的子組生物單元的一個或多個成員被收獲，從而分離子組生物單元的所述一個或多個成員。對于表示疾病的至少一個標記來說，分析子組生物單元的所收獲的一個或多個成員。本文描述了用于此類標記的示例。
[0071]在一具體實施例中，所述疾病是癌癥。然而，該疾病還可以是另一種疾病，其特征在于至少在疾病的早期階段存在稀有細胞。
[0072]可以以各種方式從受試者獲得該組生物單元。它們可以在樣品的形式被獲得。“樣品”指的是懷疑含有子組生物單元的一些材料。如本文所用，該術語包括標本(例如活檢或醫學標本)或培養物(例如微生物培養物)。樣品可以是液體、固體(例如糞便)或組織。樣品可以包括取自患者的材料，包括但不限于培養物、血液、唾液、腦脊髓液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰、精液、針吸出物等。就人的樣品或組織樣品或患者樣品或患者細胞或組織樣品或標本來說，每個指的是從受試者或患者的組織所獲得的相似或生物或生物化學的化合物的集合。組織樣品的來源可以是固體組織，以及來自新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣品或活檢或吸出物；血液或任何血液成分；體液比如腦脊髓液、羊水、腹膜液、或間質液；或者來自在受試者的懷孕或發育中的任何時間的細胞。組織樣品可以含有在性質方面不與組織自然混合的化合物，比如防腐劑、抗凝血劑、緩沖劑、固定劑、營養物、抗生素等。例如，生物單元可以是細胞或其部分、細胞成分比如特定的蛋白質、核酸、受體、標記、代謝產物等、組織或器官的一部分，等等。
[0073]例如可以通過從受試者抽取體液樣品來獲得樣品。血漿可以由血液制備。白細胞或其它血細胞成分比如淋巴細胞可以與從受試者所抽取的血液分離。
[0074]上述方法涉及一種通過檢測表示疾病的子組生物單元來檢測受試者疾病的方法。通常已知的是，體的生物單元表示該體的疾病。本文給出了眾多的示例。因此，這些單元(例如特定的細胞、蛋白質、核酸、小分子化合物等)的檢測表示疾病。
[0075]受試者可以是哺乳動物，更具體地是人或動物。
[0076]與生物單元通過連接體而被結合至的固體支承分離并且在分離之后被收獲的子組生物單元可被進一步處理以確定其是否表示疾病。在一實施例中，可以分離生物單元的子成分。作為示例，如果該生物單元是細胞，則通過本領域人員所熟知的方法，比如免疫測定、PCR或其它擴增方法比如TMA、LCR、NASBA等、質譜法等，可對子組細胞的成分比如核酸或蛋白質或激素或其它分子進一步分析，以便確定它們是否表示疾病。
[0077]在一實施例中，對于表示疾病的至少一個標記來說，所收獲的且由此分離的子組生物單元的一個或多個成員被分析。這種標記可以是對于在疾病中上調或下調所公知的核酸，或者它們可以是蛋白質或包含在子組生物單元的一個或多個成員中的其它成分。
[0078]在本發明的另一方面，提供了一種將子組生物單元的一個或多個成員與組生物單元分離的方法。該方法包括提供包含至少一個子組生物單元的異質組生物單元，該組生物單元的每個成員通過連接體結合至實體，優選的是固體支承。其還包括確定子組生物單元的所述一個或多個成員的位置。在確定位置后，其包括將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員，其中所述局部物理脈沖通過分離所述連接體，隨后通過分離子組生物單元的一個或多個成員，來將所述一個或多個成員從所述實體單獨釋放。
[0079]該方法的進一步的具體實施例如本文所限定。
[0080]本文所用的術語“分離”指的是所分離的一個或多個成員從而與剩余的細胞分離。在本發明的具體實施例中，將子組對象與一組對象分離的方法進一步限定成在根據本發明的將子組對象與固體支承特別釋放的方法的上下文中如上所述。可以加入對本領域技術人員來說所公知的額外的分離步驟。
[0081]還公開了一種在其中可以執行本文所述的方法的裝置。這種裝置包括由至少一個透明板所創建的具有一定寬度和長度的淺腔體。在一實施例中，所述板是玻璃板。該裝置的腔體的深度可以是固定的，或者其可以由可移動的蓋來調節。在一實施例中，根據所要求的表面來選擇透明板的尺寸。在另一實施例中，該尺寸是標準化的尺寸，比如標準顯微鏡載片的或SBS標準多孔板的尺寸。腔體的深度可以在從幾十個微米至數個毫米的范圍內變化。在一實施例中，該深度在10微米與I毫米之間。在更具體的實施例中，該深度在50微米與I毫米之間。在進一步的具體實施例中，深度在大于50微米與小于I毫米之間。在更具體的實施例中，深度約為100微米。此深度的優點在于，對結合至連接體的細胞進行優化，連同所優化的細胞分布均勻性和所優化的沉降時間及所優化的消耗體積一起。這對于優化染色所需的以識別細胞的試劑的量特別有用。在一實施例中，該深度是可調節的。這具有其可根據特定的應用來進行選擇的優點。
[0082]在一實施例中，該裝置還包括在入口和出口的于板的寬度上的一個或多個通道。這些通道允許腔體的均勻流動分布和填充，而不封閉氣泡。均勻的流動分布增強細胞的染色和洗滌。
[0083]腔體、透明板和通道可以封閉在具有側壁和上下壁的模塊中，存在兩個或更多個流體端口，至少一個在腔體通道的每一側，用于通過沿表面及自模塊的腔體將液體、染色流體、試劑和乳劑或細胞懸浮液添加到通道中。可以選擇這些端口的不同格式，比如流體通過其可以用針或連接管來吸取的開放端口、隔片。為了填充離心，可以使用移液或泵。為了離心，入口連接端口需要具有足夠的體積，以在離心過程開始之前包含最初所移液的體積。可以通過光學掃描儀或顯微鏡物鏡接近光學透明板來識別子組生物單元。
[0084]在另一實施例中，室的蓋可被去除以機械地接近。
[0085]下面的非限制性示例說明了本發明的某些實施例。
[0086]示例
[0087]圖1示出了通過連接體(3)而被結合至實體(2)的細胞(I)的示意圖。
[0088]圖2示出了用于將物理局部脈沖施加在連接至基體(2)的細胞上的布置(24、24a)的陣列(20)。陣列(20)可以包括導線(22)和交叉(23)，具有用于溫度脈沖的電阻加熱元件(24 )、或用于光脈沖的位于每個交叉(23 )的光元件(24a)。接觸墊(25 )連接至用戶或計算機控制的電源，以便施加所需的電功率。
[0089]圖3a)和b)示出了結合至細胞(I)和實體(2)的連接體(3)的兩個不同實施例。圖3a)中的連接體(3)包括帶有標記物b (9)的部分(8)。標記物b (9)與結合配體bpb(10)相關聯。結合配體bpb (10)連接至實體(2)。連接體(3)還包括與部分b (8)相關聯的部分a (7)。部分a (7)包括標記物a (12)。標記物a (12)結合至結合配體bpa (14)。結合至細胞(I)的細胞結合部分(I I)包括標記物c (13)。標記物c (13)還結合至結合配體a (14)。圖3b)示出了連接體(3)的另一實施例。部分b (8)包括結合至結合配體bpb
(10)的標記物b (9)。結合配體bpb (10)結合至實體(2)。部分b (8)與部分a (7)相關聯。部分(7)包括結合至細胞(I)的細胞結合部分(11)。
[0090]圖4示出了用于在圖3a)中所示的示例性實施例的部分a和部分b的分離的過程。相同的原理應用于圖3b)所示的示例性實施例。
[0091]圖4a)示出了結合至細胞(I)和實體(2)的圖3a)的相同的連接體(3)。熱(15)被施加至部分a (7)和b (8)。這導致在圖4b)中所示的連接體(3)的部分a (7)和部分b (8)的分離。結果，細胞(Ia)從實體(2)釋放。
[0092]在圖5中，部分a (7)和部分b (8)通過來自光源(16)的光脈沖(36)分離，導致細胞(Ia)的脫離。
[0093]圖6示出了通過物理脈沖(36)來單獨分離細胞(I)的示意圖。a)通過使用聚焦光源(16)將物理脈沖(36)施加到細胞(I)上。b)細胞(Ia)被選擇性地且單獨地釋放，然后可以通過液體(18)的流動(17)而被收獲。
[0094]圖7示出了其中在光脈沖(36)后通過使用移液設備(19)(圖7a))來移除被選擇性地釋放或分離的細胞(Ia)的實施例，該移液設備允許分配包括要被分配到新表面或容器(2a)上(圖7b))的分離的細胞(Ia)的被抽吸的液體(18a)。然后可以對分離的細胞(la)作進一步分析，例如通過確定特別用于待測試的疾病的至少一種標記是否存在于分離的細胞(Ia)中。
[0095]圖8a)示出了其中磁性粒子(26)與部分a (7)相關聯且隨分離的細胞(la)—起分離的實施例。然后通過使用磁鐵(27)(圖8b))可以收獲被釋放的或分離的細胞(la)。
[0096]圖9是流過室(30)的實施例，其包括承座(31)、顯微鏡載片(32)和用于承受液體
(18)的隔室(33)、用于將液體(18)添加至隔室(33)的入口(34)以及用于從隔室(33)除去液體(18 )的出口( 35 )。每個隔室(33 )由密封件(21)包圍，以確保液體(18 )只能流過入口(34)和出口(35)。
[0097]圖10是離心室(40)的實施例。離心室(40)適于將生物單元(I)固定在實體(2)上。實體(2)可以包括生物單元(I)所連接至的連接體(3)，如圖1所示。室(40)包括流體入口端口(41)。液體(18)可以通過流體入口端口(41)而被添加至室(40)。室(40)還包括用于均勻流動分布(42)的通道。液體(18)從流體入口端口(41)流過用于均勻流動分布(42)的通道。室(40)包括主室(43)。通過允許包括細胞(I)的液體(18)至流體入口端口(41)并且允許其流過用于均勻流動分布(42)的通道至主室(43)，生物單元(I)比如細胞
(I)可被添加至主室(43)。室(43)還包括下部透明板(44)，其用作基座和構成主體的上部支架(45)。這種設計的優點在于，包括細胞(I)的液體(18)可以均勻地流入主室(43)。下部透明板(44)可以用作用于固定細胞(I)的基體(2)。在一具體實施例中，主室(43)的深度的變化范圍為從10微米至5毫米。在一更具體的實施例中，主室(43)的深度在50微米與150微米之間。主室(43)的深度的最具體的實施例是100微米。由此，細胞分布是最佳的。所公開的室具有的優點在于，確保了可重現、完全均勻的填充，而沒有氣泡。
[0098]圖11示出了室(40)的分解視圖。流體入口端口(41)還可以用作出口端口。室
(40)包括高度可調蓋(46)。入口端口(41)形成在該高度可調蓋(46)中。插入件(48)安裝在蓋(46)上。插入件(48)包括蓋密封件(47)和形成在插入件(48)的底部中的用于均勻流動分布(42)的通道。當組裝時，插入件(48)被裝配到形成主通道壁(45)的支座中。主室(43)(未示出)的下壁由底板(44)形成。組件安裝在底座(49)上。
[0099]在將細胞(I)固定在底板(44)上后，可以去除室(40)，并且固定的細胞可以通過選擇性的物理脈沖或如本文所述的其它適當的方法被單獨地釋放。
[0100]離心可以用來填充室。其還可以用來促進將細胞結合至表面(不論是否具有連接體化學)，加速沉降時間，并且可用于促進釋放和輸送所選擇的、分離的細胞。在本文所述的方法的一實施例中，通過連接體將包括所述子組生物單元的所述組生物單元結合至所述實體通過離心而得以促進。在一具體實施例中，離心是在如本文所述的室中進行的。在一實施例中，所分離的生物單元的收獲通過在如本文所述的室中的離心而得以促進。
[0101]示例1:可熱裂解的分子
[0102]通過使用可熱裂解的分子，實驗示例示出了該方法的可行性。為了容易分析可行性的目的，所使用的連接體分子包括染料。該染料對于本方法不是必需的。
[0103]在該示例中的分離基于包含在連接體中的兩個雜交的寡核苷酸的變性。變性溫度取決于寡核苷酸的設計，并應當高于環境溫度以確保穩定的結合且低于細胞可能會被損壞或顆粒分離的溫度。在一具體實施例中，連接體的寡核苷酸的變性溫度在35°C與50°C之間。對于某些應用來說，如果寡核苷酸不是自雜交的，則其可能是有利的。
[0104]如果使用IR光源來產生熱脈沖，則波長應該適于通過高吸收系數來加熱液體。在水溶液的情況下，應該使用SOOnm以上的光源。在一具體實施例中，波長接近當地吸收最大值(例如1470毫米、1550納米、1900納米、2870納米)。
[0105]在該示例中所使用的連接體分子是可以彼此雜交的兩種寡核苷酸。分子Sll標記有綠色熒光染料并且具有序列5’(CY3)-TTT-GCGAAGCGAAGCGTTTTTTTT-3’-(TEG-生物素)。分子S12標記有紅色熒光染料并且具有序列5’ (ATT0647N) -TTT-CGCTTCGCTTCGCTTTTTTTT-3’(TEG-生物素)。實體是涂有抗生物素蛋白的載玻片(Arraylt Corp, Sunnyvale, USA)。流室連接在載玻片上，用于起作用和培養。熒光掃描儀用于載片成像。
[0106]實驗Ia):分子與實體之間的結合的穩定性
[0107]對形成在分子Sll與涂有抗生物素蛋白的載玻片、以及分子S12與涂有抗生物素蛋白的載玻片之間的結合的穩定性進行了測試。
[0108]分子S12以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培養在涂有抗生物素蛋白的載玻片上達60分鐘。帶有所結合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的載玻片通過采用PBS，0.05% Tween-20沖洗而被洗滌。測量紅色熒光。為了測試結合的穩定性，帶有所結合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的載玻片在55°C的溫度下通過采用PBS洗滌而被加熱，隨后檢測紅色熒光染料。確定沒有減少熒光，表明由于連接體與涂有抗生物素蛋白的玻璃表面之間的穩定結合，加熱和洗滌沒有去除連接體。
[0109]分子Sll以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培養在涂有抗生物素蛋白的載玻片上達60分鐘。帶有所結合的分子Sll的涂有抗生物素蛋白的載玻片通過采用PBS，0.05% Tween-20沖洗而被洗滌。測量綠色熒光。為了測試結合的穩定性，帶有所結合的分子11的涂有抗生物素蛋白的載玻片在55°C的溫度下通過采用PBS洗滌而被加熱，隨后檢測綠色熒光染料。確定沒有減少熒光，表明由于連接體與涂有抗生物素蛋白的玻璃表面之間的穩定結合，加熱和洗滌沒有去除連接體。
[0110]示例Ib):熱去除分子
[0111]分子S12以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培養在涂有抗生物素蛋白的載玻片上達60分鐘。帶有所結合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的載玻片通過采用PBS，0.05% Tween-20沖洗而被洗滌。
[0112]分子Sll以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培養在帶有所結合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的載玻片上達60分鐘。帶有雜交的分子S12和Sll的涂有抗生物素蛋白的玻璃表面通過采用PBS，0.05% Tween-20沖洗而被洗滌。在該點測量紅色和綠色熒光。然后，通過采用PBS，0.05% Tween-20沖洗，由加熱帶有連接體的載玻片來測試分子Sll的分離的去除。再次測量紅色和綠色熒光。65%至70%的分子Sll從載玻片去除，同時可以檢測到沒有去除分子S12。
[0113]示例2:在沒有空間分辨率的情況下去除熒光珠
[0114]連接體和實體如在示例I中所述。突光珠從Spherotech Inc., lakeForest, USA(TFP7052-5)獲得。它們的直徑為7至8微米，并且涂有生物素和熒光黃染料。使用如在圖9中所示的流動室，連同光學熒光顯微鏡和采用均勻載片加熱的電阻加熱一起，即完整的載片被均勻地加熱。
[0115]分子S12固定在如示例I中所述的載玻片上。通過以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下達60分鐘，隨后采用PBS，0.05% Tween-20沖洗，加入生物素用于在涂有抗生物素蛋白的載玻片上的結合位點的飽和。分子Sll以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培養在帶有所結合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的載玻片上達30分鐘。接著是在室溫下培養達30分鐘，隨后采用PBS，0.05% Tween-20沖洗。通過以1uMPBS,0.05% Tween-20在室溫下培養達30分鐘，隨后采用PBS，0.05% Tween-20沖洗，抗生物素蛋白結合到聯接至分子Sll的生物素。然后，將生物素涂覆的熒光珠結合至所稀釋的抗生物素蛋白，以0.lw/v%，通過在室溫下在黑暗中培養達30分鐘，隨后采用PBS，0.05%Tween-20 沖洗。
[0116]在采用50mm/s沖洗且沒有加熱的前后進行成像。可以檢測到沒有去除。結合至載玻片的珠的數量保持不變(+/-6 % )。
[0117]成像同樣是在沖洗前后進行，同時加熱室中的液體達60°C和70°C。熒光珠的去除率為40%至60%，余下的珠被均勻地分布。直接結合至玻璃表面而無需連接分子的珠以100mm/s的沖洗速度和加熱至超過60°C而保留在表面上。
[0118]加熱溫度是在熱源附近的溫度。希望在生物單元附近的溫度較低。
[0119]示例3:在具有空間分辨率的情況下去除熒光珠
[0120]連接體分子Sll和S12、實體如在示例I中所述。熒光珠如在示例2中那樣。設置包括如在示例2中的流動室和光學熒光顯微鏡。然而，比如圖2中所示的局部電阻加熱元件布置在流動室中，用于施加在載片上的局部加熱脈沖。在該實驗中，我們使用了單一的加熱結點，代替加熱元件陣列。
[0121]涂覆和雜交以及結合的過程如在示例2中所述。
[0122]在采用50mm/s沖洗且沒有加熱的前后進行成像。可以檢測到沒有去除。結合至載玻片的珠的數量保持不變(+/-6 % )。
[0123]成像在以100mm/s沖洗且至1.5W達30秒的局部加熱脈沖的前后進行成像。在熱源附近的珠被完全沖走，同時位于進一步遠離熱源的珠保持結合。熱源周界內的所有珠被去除。直接結合至玻璃表面而無需連接分子的珠以100mm/S的沖洗速度并加熱至1.5W達60秒而保留在表面上。
[0124]示例4:可光子裂解的連接體分子
[0125]代替使用具有可由熱脈沖分離的部分a和部分b的連接體，部分a和部分b可以是可由光子裂解的分子。用于裂解這種連接體的適當光源取決于連接體的設計。分離波長的范圍為從低于450納米的可見光至低于200納米的UV。具體的范圍是280至350納米和/或360至450納米。通過連接體而結合至實體的生物單元的去除由離開連接體分子的光脈沖觸發。這樣的可光裂解的連接體的一示例示出在B1conjugate Chem.，Voll5, N0.5，2
004,pagel033, Scheme2:Photolysis of SSTN 中。在該示例中，297 納米的 UV 光脈沖裂解分子SSTN。可光裂解的合適分子的其它示例公開在W02011/058721中。
[0126]不例5:依賴電荷的固定和米用光脈沖與試劑的結合釋放
[0127]在本實施例中，分離過程必須首先由試劑激活，隨后由光脈沖觸發。在第一步驟中，該方法涉及采用陽離子連接體分子來培養細胞，以將電荷提供給細胞表面。然后，將細胞固定在帶電表面(玻璃或改性的玻璃表面)上。隨后進行細胞的分析、處理及選擇。
[0128] 為了去除單個細胞，首先加入光酸產生劑作為激活試劑。然后，光脈沖(UV)被施加至所選的細胞。由此，光酸產生劑產生補償表面電荷的電荷且從而降低結合力。局部光脈沖產生允許細胞選擇性釋放的離子濃度方面的局部變化。用于激活可光裂解的部分的光源的波長范圍為從低于460納米的可見光至低于200納米的UV ;特定的范圍是230至460納米。
【權利要求】
1.一種從包括在異質組生物單元中的子組生物單元的實體一個或多個成員單獨釋放的方法，包括: -通過連接體將包括所述子組生物單元的所述組生物單元結合至所述實體， -確定在所述實體上的所述一個或多個成員的位置， -將局部物理脈沖施加至所述一個或多個成員，其中，通過分離所述連接體，所述局部物理脈沖將所述一個或多個成員從所述實體單獨釋放。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述確定通過采用顯微鏡、掃描顯微鏡或光學掃描儀觀察來進行。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述連接體包括部分a和部分b，其中，所述部分a在將組生物單元結合至實體的過程中結合所述部分b，并且所述部分a在施加局部物理脈沖時與所述部分b分離。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述局部物理脈沖選自光子光源、熱光源或其他布置。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其中，所述部分a通過由所述物理脈沖產生的熱與部分b分離。
6.根據權利要求3 或4所述的方法，其中，所述部分a通過光子引起的構象變化與部分b分離。
7.根據權利要求5所述的方法，其中，所述部分a在被結合的成員的位置在高達50°C的溫度與部分b分尚。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，所述一個或多個成員在釋放后被收-M-犾。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，在收獲所述一個或多個成員之后，進一步的一個或多個成員從所述實體釋放。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中，所述組生物單元是包括子組細胞的異質組細胞。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述子組細胞包括一個或多個成員，其中，所述一個或多個成員是稀有細胞。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其中，所述子組細胞是 -表示疾病，或 -由一種類型的細胞構成。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的方法，其中，所述連接體分子包括寡核苷酸，其中，部分a是第一寡核苷酸，部分b是部分地互補于第一寡核苷酸序列的第二寡核苷酸。
14.根據權利要求1至13中任一項所述的方法，其中，連接體的部分b包括標記物，并且其中，所述實體涂有用于所述標記物的結合配體。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的方法，其中，所述的通過連接體將包括所述子組生物單元的所述組生物單元結合至所述實體通過離心而得以促進。
【文檔編號】C12N5/00GK104130968SQ201410177875
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2013年5月1日
【發明者】J.布蘭德-梅爾, C.徹魯比尼, A.德雷克斯勒, N.格沃德, M.科普, E.奧斯特布羅克, E.薩羅菲姆 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司