銅綠假單胞菌ⅲ型分泌系統毒素基因的lamp快速檢測試劑盒及其應用和方法
【專利摘要】本發明公開了銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統毒素基因的LAMP快速檢測試劑盒及其應用和方法，其LAMP快速檢測試劑盒含有銅綠假單胞菌ExoU和ExoS基因進行LAMP擴增的引物組，其中LAMP擴增ExoU基因的引物組如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.4所示，LAMP擴增ExoS基因的引物組如SEQ?ID?NO.5～SEQ?ID?NO.8所示，該試劑盒具有特異性好、靈敏度高等優點，可以快速檢測銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統中編碼強毒性效應蛋白的ExoU和ExoS基因，進而判斷銅綠假單胞菌菌株毒素基因型及毒性，為突發情況或例行監測中快速判斷銅綠假單胞菌菌株的毒力具有重要意義。
【專利說明】銅綠假單胞菌III型分泌系統毒素基因的LAMP快速檢測試劑盒及其應用和方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于檢測領域，具體涉及銅綠假單胞菌III型分泌系統毒素基因的LAMP快速檢測試劑盒，還涉及該試劑盒的應用和方法。
【背景技術】
[0002]銅綠假單胞菌是一種重要的機會致病菌，廣泛的分布于土壤、水體、動植物表面上。銅綠假單胞菌可感染燒傷或免疫力低下的患者，在囊性纖維化患者中能夠造成更嚴重的傷害甚至死亡。原因是銅綠假單胞菌分泌一些致病因子，這些致病因子會與宿主體內的特定位點相結合作用，從而使之具備強致病性。其中，毒性最強的致病因子是由III型分泌系統(Type III Secretion System, T3SS)傳遞的，銅綠假單胞菌可以通過其T3SS系統將毒力蛋白直接注入到宿主細胞中，干擾宿主細胞的信號傳導，改變宿主細胞的功能，創造有利于細菌生存和散布的環境。
[0003]因此，T3SS系統是銅綠假單胞菌中最重要的毒性物質，銅綠假單胞菌的毒性可以主要由編碼T3SS毒性效應蛋白的基因的存在性來判斷。銅綠假單胞菌的T3SS系統主要分泌四種毒素ExoU, ExoS, ExoT和ExoY,其中ExoT和ExoY對菌毒性的作用很小，而ExoU、ExoS最具破壞性并引起廣泛關注，ExoU —種擁有磷脂酶活性的壞死性毒素，ExoS是一類擁有鳥苷三磷酸酶激活蛋白活性和二磷酸腺苷核糖轉移酶活性的雙功能毒素。ExoU作為T3SS系統中最強的毒性效應蛋白，比ExoS的毒性更強。所以銅綠假單胞菌菌株呈現出不同的T3SS毒素基因型，由ExoU或ExoS基因(分別編碼EX0U、EX0S毒性效應蛋白)的存在來定義。無論是在環境或是臨床樣本中，一般每株銅綠假單胞菌只攜帶ExoU、ExoS基因中的一種。并且，攜帶ExoU基因的銅綠假單胞菌比攜帶ExoS基因的毒性更強。只有從臨床急性感染樣本或嚴重污染環境樣本中分離的銅綠假單胞菌株，才會攜帶ExoU基因。因此非常有必要檢測ExoU或ExoS基因的存在性，用以在突發情況或例行監測中判斷銅綠假單胞菌菌株的毒力。
[0004] 現已有研究用PCR技術來檢測銅綠假單胞菌的ExoU和ExoS基因。但是，PCR方法對儀器設備(如PCR儀)要求高、投入大，給技術的基層推廣造成了極大障礙。環介導等溫擴增技術(LAMP)是新的核酸擴增技術，其使用4-6條引物，針對目標DNA序列的6-8個區域，在等溫條件下進行反應，在一個小時內即可完成擴增。簡單快速，具有高度的特異性和靈敏度。并且，因為LAMP可在等溫條件下反應，所以無需昂貴的熱循環設備。因此，建立銅綠假單胞菌III型分泌系統重要毒素基因(ExoU、ExoS)的LAMP快速檢測技術具有重要的意義，但是目前還沒有相關研究。
【發明內容】
[0005]有鑒于此，本發明的目的之一在于提供銅綠假單胞菌III型分泌系統毒素基因的LAMP快速檢測試劑盒，本發明的目的之二在于提供上述LAMP快速檢測試劑盒的應用，本發明的目的之三在于提供應用上述LAMP快速檢測試劑盒的方法。
[0006]為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案:
[0007]1、銅綠假單胞菌III型分泌系統毒素基因的LAMP快速檢測試劑盒，含有銅綠假單胞菌ExoU和ExoS基因進行LAMP擴增的引物組，
[0008]其中LAMP擴增ExoU基因的引物組如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.4所示，LAMP擴增ExoS基因的引物組如SEQ ID N0.5~SEQ ID N0.8所示。
[0009]優選的，所述試劑盒中還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、甜菜堿和MgSO4。
[0010]優選的，所述試劑盒中dNTPs的濃度為0.3mM、Bst DNA聚合酶的濃度為8U/ μ L、PCR反應緩沖液為IOXPCR反應緩沖液，甜菜堿的濃度為0.8Μ、MgSO4的濃度為4.0mM。
[0011]更優選的，所述試劑盒中還包括陽性質控品和陰性質控品，所述陽性質控品分為ExoU基因陽性質控品和ExoS基因陽性質控品，所述ExoU基因陽性質控品為銅綠假單胞菌PA14基因組DNA，所述ExoS基因陽性質控品為銅綠假單胞菌PAOl的基因組DNA，所述陰性質控品為水。
[0012]2、所述LAMP快速檢測試劑盒在非疾病診斷中用于判斷銅綠假單胞菌毒素基因型。
[0013]3、利用所述LAMP快速檢測試劑盒在非疾病診斷中判斷銅綠假單胞菌毒素基因型的方法，包括如下步驟:從銅綠假單胞菌中提取基因組DNA，然后以提取的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5~SEQ ID N0.8所示核苷酸序列為引物進行LAMP擴增反應，將擴增獲得的LAMP產物進行電泳即可。
[0014]更優選的，所述LAMP擴增的條件為先63°C擴增反應30分鐘，再在80°C終止反應2分鐘。
[0015]本發明的有益效果在于:本發明公開了銅綠假單胞菌III型分泌系統毒素基因的LAMP快速檢測試劑盒，該試劑盒可以檢測銅綠假單胞菌編碼強毒性效應蛋白的ExoU和ExoS基因，進而判斷銅綠假單胞菌菌株的T3SS毒素基因型及毒性，該試劑盒具有特異性和靈敏度高的優點，遠遠優于常規PCR方法，并且檢測周期短可用于在突發情況或例行監測中快速判斷銅綠假單胞菌菌株的毒力，具有重要意義；同時該試劑盒不需要高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖:
[0017]圖1為本發明試劑盒檢測結果圖(M:DL2000DNA Marker ;1_4 =LAMP檢測銅綠假單胞菌ExoS基因(1-3:模板為銅綠假單胞菌PA14的基因組DNA ；4:非模板水對照)；5_8:LAMP檢測銅綠假單胞菌ExoU基因(5-7:模板為銅綠假單胞菌PAOl的基因組DNA ;8:非模板水對照))。
[0018]圖2為ExoS和ExoU基因靈敏度試驗結果(1-5分別表示模板DNA濃度為10pg、lpg、100fg、10fg 和 O)。
【具體實施方式】[0019]下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0020]實施例1、銅綠假單胞菌模板DNA的制備
[0021]銅綠假單胞菌模板DNA的制備，包括如下步驟:
[0022]I)分別選取攜帶ExoU或ExoS基因的銅綠假單胞菌PA14和PAOl接種于LB肉湯中，然后在37°C、220rpm條件下培養12h ；
[0023]2)取步驟I)的細菌培養液500 μ L，然后在1000Orpm條件下離心lmin，棄上清，收
集沉淀；
[0024]3)將步驟2)收集的菌體沉淀懸浮在0.2mL裂解液中(Tri s_HCl IOmM pH8，EDTAlmM, NaCllOOmM, SDSl% (w/v), Triton X-1002% (w/v))，之后加入 0.2mL Tris 飽和酹/氯仿/異戍醇(25:24:1)和0.3g半徑為106 μ m的玻璃珠(Sigma, USA)。使用研磨器(BioSpec, Bartlesville, USA)研磨細胞,持續2個循環(每個循環20s),進行機械破壁；
[0025]4) 12000g離心10min，取上清液轉至另一新離心管中。加入等體積的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提兩次，12000g分別離心10min。小心吸取上清液，用乙醇清洗得到的DNA沉淀，-20°C沉淀30min ；
[0026]5) 12000g離心10min，棄掉上清液，將液體吸凈；吹干沉淀，加入50 μ L蒸餾水溶解，分別得銅綠假單胞菌ΡΑ14和PAOl基因組DNA，保存于_20°C備用。
[0027]實施例2、設計LAMP引物組
[0028]以銅綠假單胞菌ExoU 基因(GeneBank:CP000438)和 ExoS 基因(GeneBank:AE004091)基因為目標基因，利用在線設計軟件Primer Explorer V4software (FujitsuLimited, Japan [http: //primerexplorer.jp/e/])設計 LAMP 引物，具體引物如下:
[0029]擴增ExoU基因所需要的引物組:
[0030]ExoU-FIP:5，-agtacgggactccccttgccgaagttgccggaaagcgtta-3，(SEQ ID N0.1)；
[0031]ExoU-BIP:5，-gcagatcactctgcgccagtcaatggtggccgactgag-3，(SEQ ID N0.2)；
[0032]ExoU_F3:5，-ggttgccctaaagagcacg-3，(SEQ ID N0.3)；
[0033]ExoU_B3:5，-gccgcttaggaccagact-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0034]對ExoS基因擴增時所需要的引物組:
[0035]ExoS-FIP:5， -gtcggccgatactctgctgac_taatgagcgaggtcgcact_3， (SEQ IDN0.5)；
[0036]ExoS-BIP:5，-atggcctggtgaagcggttc-ttcggcgtcactgtggat-3，(SEQ ID N0.6)；
[0037]ExoS_F3:5，-caccgaccagttgcatcag-3’ (SEQ ID N0.7)；
[0038]ExoS_B3:5，-gagaccaagcgccatcac-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0039]實施例3、LAMP擴增反應
[0040] 分別以實施例1提取的銅綠假單胞菌PA14和銅綠假單胞菌PAOl基因組DNA為模板，分別以實施例2設計擴增ExoU基因和擴增ExoS基因的引物組進行LAMP反應，LAMP反應體系為:10 μ M引物FIP4.8 μ L, 10 μ M弓丨物ΒΙΡ4.8 μ L, 10 μ M弓丨物F30.6 μ L, 10 μ M弓丨物Β30.6μ L,2.5mM dNTPs4 μ L、8U/μ L Bst DNA 聚合酶 I μ L、10 X PCR 反應緩沖液 3 μ L、5M甜菜堿5 μ L、150mM MgSO40.8 μ L，模板DNAl μ L，用無菌水補足體積至30 μ L，然后在63°C擴增反應30分鐘，再在80°C條件下2分鐘終止反應。
[0041]按照上述方法重復3次試驗，以驗證其重復性。
[0042]實施例4、LAMP結果分析
[0043]用IXTAE緩沖液配置質量分數為2%的瓊脂糖凝膠，微波爐加熱使瓊脂糖完全溶解后加入溴化乙錠(Ethidium bromide, EB)至終濃度為0.2 μ g/mL,倒膠后待膠凝固后取實施例3中3次擴增的LAMP產物進行檢測，檢測時擴增產物中加入相當于LAMP產物體積1/6的上樣緩沖液(0.25%溴酚藍；0.25%二甲基苯腈藍；0.25%蔗糖)混勻，然后分別將混合樣添加到上樣槽中，并在120V/cm電壓下進行恒壓電泳。然后用凝膠成像儀(BioRad，Hercules,USA)掃描并產生圖像并進行圖像分析，結果如圖1所示。結果顯示，檢測組出現梯狀條帶，檢測結果為陽性，對照組無條帶，其檢測結果為陰性。
[0044]因此，本發明設計的LAMP引物能夠分別特異擴增ExoU基因或ExoS基因，并且重復性好，能夠用于檢測銅綠假單胞菌III型分泌系統重要毒素基因(ExoU和ExoS)。
[0045]實施例5、樣本檢測試驗
[0046]對銅綠假單胞菌及非銅綠假單胞菌的ExoU及ExoS基因進行LAMP檢測。使用5株銅綠假單胞菌(銅綠假單胞菌PA14、PA01、PA103、PAK、PKE117)，以及14株非銅綠假單胞菌株(熒光假單胞菌、斯氏假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌、洋蔥假單胞菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、短乳桿菌、長雙歧桿菌、醋酸桿菌、丁酸梭菌、脆弱擬桿菌)，結果如表1所示。
[0047]表1銅綠假單胞菌及非銅綠假單胞菌ExoU和ExoS基因的LAMP檢測
[0048]
【權利要求】
1.銅綠假單胞菌III型分泌系統毒素基因的LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于:含有銅綠假單胞菌ExoU和ExoS基因進行LAMP擴增的引物組， 其中LAMP擴增ExoU基因的引物組如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.4所示，LAMP擴增ExoS基因的引物組如SEQ ID N0.5~SEQ ID N0.8所示。
2.根據權利要求1所述的LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、甜菜堿和MgS04。
3.根據權利要求2所述的LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中dNTPs的濃度為0.3mM、Bst DNA聚合酶濃度為8U/μ L、PCR反應緩沖液為10 XPCR反應緩沖液，甜菜堿的濃度為0.8M、MgSO4的濃度為4.0mM。
4.根據權利要求1-3任一項所述的LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還包括陽性質控品和陰性質控品，所述陽性質控品分為ExoU基因陽性質控品和ExoS基因陽性質控品，所述ExoU基因陽性質控品為銅綠假單胞菌PA14基因組DNA，所述ExoS基因陽性質控品為銅綠假單胞菌PAOl的基因組DNA，所述陰性質控品為水。
5.權利要求1-4任一項所述LAMP快速檢測試劑盒在非疾病診斷中用于判斷銅綠假單胞菌毒素基因型。
6.利用權利要求1-4任一項所述LAMP快速檢測試劑盒在非疾病診斷中判斷銅綠假單胞菌毒素基因型的方法，其特征在于，包括如下步驟:從銅綠假單胞菌中提取基因組DNA，然后以提取的基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5~SEQID N0.8所示核苷酸序列為引物進行LAMP擴增反應，將擴增獲得的LAMP產物進行電泳即可。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述LAMP擴增的條件為先63°C擴增反應30分鐘，再在80°C終止反應2分鐘。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911459SQ201410177718
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】石慧, 闞建全, 田維娜, 袁連玉 申請人:西南大學