一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器的制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，通過輸液管依次將反應室、儲液罐和蠕動泵連接；反應室包括側壁、底壁、截流裝置、溢流插板、篩網架、靜壓槽、泄流槽、引流槽等構成的盒體和蓋體，截流裝置為閘門或堰流壩并且沿其縱向截面同一水平上開設有若干均勻排列的透水孔，靜壓槽側壁設有與引流槽相配合的溢流口,篩網架固定在盒體的兩側壁上。本發明還涉及一種層疊結構的生物反應器。本發明解決了現有灌注式培養中存在的流場不均一、營養傳遞不均勻容易造成細胞死亡的問題，適合組織細胞的三維培養，能夠提高組織工程產品的質量，本反應器具有擴展性好、通用性強、適用范圍廣的特點。
【專利說明】—種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器
【技術領域】
[0001]本發明屬于細胞培養裝置領域，涉及一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，尤其是多種組織器官共培養的生物反應器。
【背景技術】
[0002]通常情況下已構建好的工程化組織(或稱三維構建物)需要在體外進行一段時間的培養，使其成熟后才能移植或供研究用，而目前最常用的培養模式是采用培養板進行定期換液的靜態培養法，即先移去舊培養液再添加新培養液，然后放入培養箱中予以靜置培養，其優點是適合小批量的培養，換液周期可隨組織、細胞的不同而采取相應的策略。但其缺點顯而易見:一是營養液的消耗呈進行性下降，而代謝產物不斷增加，會對細胞造成一些生理性損傷；二是依靠彌散方式提供營養，存在營養供應受限的顯著缺點，甚至導致工程化組織內部的細胞得不到營養而死亡；三是周期性換液使營養成分呈周期性波動，不利于細胞的均勻生長。
[0003]在體內，豐富的毛細血管網構架起一個有效的傳質通道，為細胞提供充足的氧和營養物。因此體外培養時為了保證營養物的供應，須建立培養液有效循環的方法，目前有以下幾個策略:滾瓶培養、旋轉培養和灌注式培養，其中灌注式培養的優點尤為顯著，一方面，由于培養液連續地流經三維構建物內部或周圍，能夠克服營養物質傳遞受限的缺點，即使構建物厚度超過500 μ m也能得到可靠的營養供應；另一方面，灌注培養時的液流能夠產生一定的剪切力，提 供適當的機械刺激，有利于構建物的發育和成熟。Kalyanaraman等(Kalyanaraman BM, Dorothy MS, Steven TB.Medium Flow Rate Regulates Viability andBarrier Function of Engineered Skin Substitutes in Perfusion Culture.Tis Eng:Part A.2008, 14(5):583-93)已設計了一種生物反應室，進、出水口管是從培養室的底面兩側分別接入培養室，通過設置出液管的高度來控制培養室液面的高度，即培養室液面高于出水管后液體將溢進管子而流出，通過對構建的組織工程皮膚進行熟化培養，結果表明在灌注速度為5ml / min或15ml / min培養條件下,組織學結構好于靜態培養,其中,通過細胞活力檢測結果表明，在5ml / min的灌注速度下的細胞活力明顯好于靜態培養下的細胞活力；采用BrdU摻入法檢測細胞的增生情況也表明，在灌注速度5ml / min或15ml /min時的細胞增生情況明顯好于靜態培養下的細胞增生情況。對比還發現灌注速度50ml /min時只顯示少量細胞增生，實驗研究證明了低流速能夠增加細胞活力和維持表皮的屏障，適合于移植，而高流速產生高的剪切力則可導致細胞的變性壞死。
[0004]盡管現有的灌注式培養裝置簡單地實現了液體的循環，但卻沒有考慮流場的整體情況，一方面，因培養液在循環過程中流速不穩定，變化頻繁，無法保證在流經待培植組織工程產品時處于低流速的均勻流場，對細胞增生不利；另一方面，處于邊緣的培養液不易流動，培養裝置內流場不均一，營養傳遞不均，容易造成細胞生長不均勻；況且，在流速不均的情況下液體對細胞所施加的剪切力大小不同，流速快時剪切力過大而使細胞易受到損傷，流速過低(接近靜止)時又不利于細胞增生。本發明人在第三軍醫大學學報第35卷第7期《基于準靜態平面流場的新型皮膚組織工程灌注式生物反應室設計與初步模擬》中公開了一種灌注式生物反應器，包括培養基瓶、蠕動泵、無菌硅膠管、緩沖槽、溢流壩、培養室和泄流溝。該生物反應器是培養液通過溢流的方式來實現準靜態平面流場，培養液進入緩沖槽，經高溢流壩溢流進入培養室，從而在培養中對組織細胞進行供養，然后培養液經低溢流壩溢出至泄流溝，最后培養液進入到下一層反應器緩沖槽中。利用這種生物反應器，由于培養液存在表面張力，流入緩沖槽的流速不恒定和不均勻所造成的壓頭不穩定，加之高溢流壩的泄流斜面不可能處于絕對平整，所以培養液在緩沖槽積蓄勢能后流經高溢流壩的泄流斜面時，形成一股或幾股不均勻的流液，更有甚者，在較低流速下泄流斜面的某些區域形成了斷流以致培養基在進入培養段流場時出現了不均勻的流場，造成某些區域的細胞得不到或得到很少的營養物質以及不能及時排除代謝產物而出現損傷或者死亡；而且現有的篩網大多固定在反應室的底壁上，必定需要一定的支架用來固定篩網，由此就會造成在流場方向上，固定篩網架的支柱后側不能形成均勻的流場也會對部分培養區域造成一定的影響。
[0005]由此可見，在灌注式培養中，使流經待培育組織細胞的液體流場均勻，流速始終保持在低流速，對提高組織工程產品質量、縮短培植時間、提高培育效率至關重要。
【發明內容】
[0006]針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供一種適用于三維組織細胞培養的生物反應器，該生物反應器能夠實現平面流場的培養液流速合適，流場均勻穩定；本發明還提供了一種結構緊湊、擴展性好、更加優化的層疊生物反應器。
[0007]為了解決上述技術問題，適用于三維組織細胞培養的生物反應器，包括儲液罐、蠕動泵和至少一個包括頂部敞口的長方體盒體和蓋體組成的反應室；盒體一端固定一截流裝置，與盒體構成靜壓槽，另一端固定一溢流插板，與盒體構成泄流槽，靜壓槽和泄流槽之間固定有與截流裝置和溢流插板均不接觸的篩網架；篩網架固定在盒體上，篩網固定在篩網架當中；截流裝置與溢流插板之間形成反應區域；反應室上設置一與靜壓槽連通并能將液體直接注入靜壓槽的進液孔，在盒體的壁上設置一與泄流槽連通并能將液體直接排出泄流槽的出液孔；截流裝置沿縱向截面同一水平上開設有若干均勻排列的能將靜壓槽內的液體勻速均勻引入反應區域的透水孔；靜壓槽的側壁上設置有溢流口，在盒體的側壁上設置有能將靜壓槽經溢流口溢出的多余液體通過進流口排入泄流槽的引流槽；截流裝置等于或低于盒體的深度，篩網架低于截流裝置的高度，溢流插板高于或等于篩網架上篩網的高度，溢流口的下緣低于截流裝置的上表面的高度并高于溢流插板上表面、進流口和透水孔上緣的高度，以在靜壓槽、反應區域和泄流槽中形成階梯狀的差位液面；輸液管將儲液罐、蠕動泵依次連接在出液孔與進液孔之間。
[0008]本發明中篩網架固定在盒體的兩側壁上，截流裝置、溢流插板和篩網架分別與盒體通過卡合連接，截流裝置、溢流插板與盒體接觸的面上以及篩網架與盒體側壁接觸的面上設有臺階狀的卡子，盒體的側壁與底壁上設置有與卡子相卡合的卡合凹槽。通過卡合連接方便反應室的拆卸與清洗，而且將篩網架固定在盒體的側壁上與以前的篩網架固定在底壁上相比，減少了篩網架支架對反應區域內培養液的阻擋，形成了均勻的流場。 [0009]優選的本發明中的溢流口包括U型槽以及在靜壓槽內U型槽旁設置的能通過定位軸轉動蓋合U型槽并能通過調節U型槽下緣高度來調節靜壓槽內液面高度的擋片。通過設置溢流口，能夠方便的調節靜壓槽內液面的高度以控制培養液均勻地流過截流裝置的透水孔。
[0010] 本發明中透水孔為若干個均勻排列的相同的條形孔、圓形孔、半圓形孔或異形孔。通過設置均勻排列的透水孔，可以實現培養基進入反應區域時形成均勻的流道，以實現均勻的流場。
[0011]本發明中，篩網的網平面上設置有與篩網架的支架等高的規格模具，規格模具可以為方形、圓形、三角形或異形結構。
[0012]本發明中優選的溢流插板高出篩網架上篩網高度為O~4mm。通過設置略高于篩網高度的溢流插板，可以使培養液與篩網上的培養物形成良好的接觸。
[0013]本發明的改進方案中，截流裝置為帶有透水孔的閘門，透水孔位于閘門的中下部。
[0014]本發明的另一改進方案中，截流裝置為帶有泄流斜面的堰流壩，堰流壩包括上壩體和下壩體，下壩體與篩網架相鄰的一側具有泄流斜面，透水孔位于該堰流壩的上壩體，該泄流斜面與盒體底面呈15°~25。夾角，泄流斜面的高度為堰流壩高度的1/3~1/2。
[0015]通過上述兩種改進的截流裝置，與現有的截流裝置相比，培養液通過透水孔時不僅能夠產生勻速均勻的流場，而且拆卸、清洗更加方便。
[0016]本發明的另一種改進方案是提供了一種能夠批量生產的層疊盒體，該層疊盒體是通過盒體相互反向嵌合在一起構成。
[0017]本發明中盒體的側壁的上表面的外側設有臺階狀的凸緣，盒體的底壁的四周設有與側壁上表面的凸緣相嵌合的對象嵌合凹槽。多個盒體通過嵌合對接構成盒體的層疊盒體，蓋體蓋合在層疊盒體的頂部盒體上，蓋體與上部的盒體構成反應室，上部的盒體的底壁與相鄰下部的盒體共同組成一個反應室；層疊盒體中上部盒體的出液孔通過輸液管與下部盒體的進液孔連接，層疊盒體底部的盒體的出液孔通過輸液管、儲液罐、蠕動泵與頂部的反應室的進液孔相連接；層疊盒體與蓋體、輸液管、儲液罐、蠕動泵共同組成層疊生物反應器。
[0018]優選的上述改進方案中層疊盒體中的上部的盒體的出液孔設置在泄流槽的底壁上，并與其相鄰嵌合的下部的盒體的靜壓槽相連通，構成了下部盒體的進液孔，以便液體從層疊盒體的上部盒體直接流入下部盒體的靜壓槽當中。通過開設在底壁上的出液孔，簡化了層疊生物反應器的結構。
[0019]優選的層疊盒體中的盒體的數目為2到20個；
上述層疊生物反應器還可以在層疊盒體的外部設有由箱體和箱蓋組成并帶有與頂部盒體靜壓槽和底部盒體出液孔相配合的能使輸液管通過的孔道的無菌反應箱，層疊盒體位于箱體中，儲液罐和蠕動泵位于反應箱外。通過設置反應箱，可以使層疊生物反應器在無菌密閉的環境下進行反應。
[0020]上述外部帶有反應箱的生物反應器還可以在反應箱外圍設有循環水套，儲液罐和蠕動泵位于循環水套外。以便生物反應器內部處于恒溫狀態。
[0021 ] 在上述技術方案中，當向靜壓槽內注入培養液，培養液在靜壓槽內積蓄，調節溢流口的高度，多余液體從溢流口溢出，保證靜壓槽內形成穩定壓力后隨截流裝置上的透水孔緩慢地流入篩網架底部，而且流場中沒有了篩網架支架的阻擋，使反應盒體中部形成均勻的穩態平面流場，進行均勻的營養擴散；由于培養液是從靜壓槽內形成穩定壓力后自然浸流入篩網架底部的，故流入篩網架底部的培養液始終保持在較低的均勻穩定流速，該流速能夠為篩網架上的擬培養或生產的三維組織器官或組織工程產品提供均勻一致的剪切力，有利于細胞增生和組織發育。
[0022]本發明是一種適用于三維組織器官、細胞或組織工程產品灌注培養的生物反應器，尤其適用于對組織工程皮膚或其他膜狀組織如角膜、心瓣膜以及多種組織器官、細胞進行灌注培養包括共培養。其工作原理為:先將擬培養或生產的三維組織器官或組織工程產品的原料溶液注入篩網架上，在篩網架上放入規格模具制成特定形狀的規格，取出規格模具，蓋上蓋體；然后向靜壓槽內注入培養液，培養液在靜壓槽內積蓄，多余液體從溢流口溢出，保證靜壓槽內形成穩定壓力后經截流裝置上的透水孔流向篩網架，使反應盒體中部形成均勻的穩態平面流場，篩網架上的擬培養或生產的三維組織器官或組織工程產品恰好被流動的營養液浸沒，也可適當降低液面使篩網架上待培養的三維組織始終處于氣液界面培養狀態，為擬研究或生產的三維組織器官或組織工程產品提供充足的營養和適宜的剪切力，當反應盒體中部的液面蓄水高度高于溢流插板高度時，培養液經溢流插板頂部流入泄流槽，進而從出液孔流入儲液罐內，通過蠕動泵再將液體泵入靜壓槽內，實現封閉式的循環培養。
[0023]由于以上結構，本發明具有以下優點:1.通過設置溢流口和帶有能將靜壓槽內的液體勻速均勻引入反應區域的透水孔的截流裝置，培養液流過透水孔時，容易突破自身的張力形成均勻的流道，使培養液在流經篩網架時始終保持較低的穩定的均勻流速，反應盒體反應區域內形成穩定均勻的平面流場，有利于細胞增生；2、本發明的生物反應器可以單個獨立使用，也可以多個串聯或層疊使用，具有良好的擴展性，既能維持三維組織器官的生物學特性，保證了三維組織器官或產品的質量，又提高了基礎研究或生產的效率；3.本發明的截流裝置、規格模具、篩網架和溢流插板可根據實際需要拆取更換，不僅適合組織工程皮膚的培養，也適合膜狀材料如角膜、心瓣膜、神經、血管、腸系膜，或其它組織器官等的培養，而且可同時培養不同類型的組織器官，拆除篩網架后還可用于培養貼壁生長的種子細胞，具有通用性強、適 用范圍廣的特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1是本發明反應室的立體示意圖；
圖2是本發明盒體體壁的立體示意圖；
圖3是本發明生物反應器的結構示意圖；
圖4是本發明中閘門的立體示意圖；
圖5是本發明中堰流壩的立體示意圖；
圖6是本發明中篩網及篩網架的立體示意圖；
圖7是本發明層疊生物反應器的結構示意圖；
圖8是本發明實施例二的結構不意圖；
圖9是本發明流場的示意圖；
圖中:1、盒體；2、蓋體；3、截流裝置；4、閘門；5、堰流壩；6、透水孔；7、靜壓槽；8、溢流插板；9、泄流槽；10、上壩體；11、下壩體；12、泄流斜面；13、溢流口 ；14、定位軸；15、擋片；16、引流槽；17、進流口 ； 18進液孔；19、出液孔；20、篩網架；21、篩網；22、規格模具；23卡子；24、卡合凹槽；25、凸緣；26、嵌合凹槽；27、輸液管；28、儲液罐；29、蠕動泵；30、層疊盒體；31、箱體；32、箱蓋；33、循環水套；34、孔道。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖對本發明做進一步說明。
[0026]實施例一: 參見圖1、圖2、圖3、圖4、圖6、圖9，本發明一種適用于組織細胞三維灌注培養的生物反應器，包括儲液罐28、蠕動泵29和至少一個包括頂部敞口的長方體盒體I和蓋體2組成的反應室；盒體I 一端固定一截流裝置3，與盒體I構成靜壓槽7，另一端固定一溢流插板8，與盒體I構成泄流槽9，靜壓槽7和泄流槽9之間固定有與截流裝置3和溢流插板8均不接觸的篩網架20 ;篩網架20卡和在盒體I的兩側壁上，篩網21固定在篩網架20當中；截流裝置3沿縱向截面同一水平上開設有若干均勻排列的能將靜壓槽7內的液體勻速均勻引入反應區域的透水孔6，透水孔6為若干個均勻排列的條形孔、圓形孔、半圓形孔或異形孔；靜壓槽7與盒體I共用的側壁上設置有溢流口 13，溢流口 13包括U型槽以及在靜壓槽7內設置的能通過定位軸14轉動蓋合U型槽并能調節U型槽高度和大小的擋片15，在盒體I的側壁上設置有能將靜壓槽7經溢流口 13溢出的多余液體通過進流口 17排入泄流槽9的引流槽16 ;反應室上設置一與靜壓槽7連通并能將液體直接注入靜壓槽7的進液孔18，在盒體I的壁上設置一與泄流槽9連通并能將液體直接排出泄流槽9的出液孔19 ;截流裝置3等于或低于盒體I的深度，篩網架20低于截流裝置3的高度，溢流插板8高于或等于篩網架20上篩網21的高度，溢流口 13的下緣低于截流裝置3的上表面的高度并高于溢流插板8上表面、進流口 17和透水孔6上緣的高度；輸液管27將儲液罐28、蠕動泵29依次連接在出液孔19與進液孔18之間。
[0027]如圖2、圖3所示，本實施例中的截流裝置3為閘門4，蠕動泵29將儲液罐28中的培養液泵向靜壓槽7內的過程中，注入高于透水孔6高度的培養液，多余液體從溢流口 13溢出，通過溢流槽、進流口 17流入泄流槽9中，培養液通過閘門4上的透水孔6，并緩慢地流入篩網架20底部，使盒體I中部形成均勻的平面流場(參見圖9)，進行均勻的營養擴散，并使篩網21上的擬生產組織工程產品受到均勻一致的剪切力，避免因培養液營養擴散不均勻或剪切力過高而造成的細胞死亡。
[0028]為使本發明適用范圍更廣、拆裝清洗更便捷，盒體I側壁和底壁上具有卡合凹槽
24,閘門4、篩網架20和溢流插板8上具有能夠插入所述卡合凹槽24內卡合固定的卡子23,閘門4、篩網架20和溢流插板8可分離的固定在盒體I上。溢流插板8高于篩網架20上篩網21為O~4_，通過更換溢流插板8可以調節盒體I中部的液面高度，不僅能夠為組織工程皮膚提供氣液界面培養環境，而且也可為膜狀材料如角膜、心瓣膜、神經、血管、腸系膜等提供浸沒培養環境，通過更換閘門4、篩網架20、溢流插板8以及滑動溢流口 13旁的擋片15，可調節流場的剪切力大小及液面高度，用于其它三維組織器官如肝、腎、肺、骨、軟骨等組織及細胞如干細胞、癌細胞的培養，而且在移除篩網架20時，還可用于培養貼壁生長的種子細胞。
[0029]所述篩網架20可為一整體，也可為多個相互獨立的篩網架20，相隔一定的間距排列。所述規格模具22卡合在篩網架20的篩網21上并與篩網架20的支架等高，規格模具22根據產品品種需求可以設計為方形、圓形、三角形或異形結構。[0030](I)將擬研究三維構建物或擬生產組織工程產品的原料溶液注入篩網架20上，在篩網21上放入規格模具22制成特定形狀的規格，取出規格模具22，蓋上蓋體2 ;然后以400ml/min的高灌注速度向靜壓槽7內灌注培養液，當培養液的液面高度積蓄到一定程度時，滑動溢流口 13的擋片15以調節溢流口 13高度及大小，使培養液有少量液體剛要從溢流口 13溢出，產生穩定的靜壓，培養液從閘門4下透水孔6流向篩網架20 ;實驗對比表明，在該400ml/min的低流速條件下，每天灌注2次，每次半小時，培養10天，細胞增生是靜態培養條件下相同天數細胞增生的2.37倍，可縮短組織工程皮膚培育時間5天。
[0031](2)將擬研究三維構建物或擬生產組織工程產品的原料溶液注入篩網架20上，在篩網21上放入規格模具22制成特定形狀的規格，取出規格模具22，蓋上蓋體2 ;然后以200ml/min的中等灌注速度向靜壓槽7內灌注培養液，當培養液的液面高度積蓄到一定程度時，滑動溢流口 13的擋片15以調節溢流口 13高度及大小，使培養液有少量液體剛要從溢流口 13溢出，產生穩定的靜壓，培養液從閘門4下透水孔6流向篩網架20 ;實驗對比表明，在該200ml/min的低流速條件下，每天灌注2次，每次半小時，培養10天，細胞增生是靜態培養條件下相同天數細胞增生的2.48倍，可縮短組織工程皮膚培育時間5天。
[0032](3)將擬研究三維構建物或擬生產組織工程產品的原料溶液注入篩網架20上，在篩網21上放入規格模具22制成特定形狀的規格，取出規格模具22，蓋上蓋體2 ;然后以lOOml/min的低灌注速度向靜壓槽7內灌注培養液，當培養液的液面高度積蓄到一定程度時，滑動溢流口 13的擋片15以調節溢流口 13高度及大小，使培養液有少量液體剛要從溢流口 13溢出，產生穩定的靜壓，培養液從閘門4下透水孔6流向篩網架20 ;實驗對比表明，在該lOOml/min的 低流速條件下，每天灌注2次，每次半小時，培養10天，細胞增生是靜態培養條件下相同天數細胞增生的2.75倍，縮短組織工程產品培植時間5天。
[0033]實施例二:
如圖1、圖2、圖3、圖5、圖6、圖9所示，上述實施例一中，閘門4的功能也可以通過堰流壩5實現，所述堰流壩5包括上壩體10和下壩體11，下壩體11與篩網架20相鄰的一側具有泄流斜面12，透水孔位于該堰流壩的上壩體10，該泄流斜面12與盒體底面呈15°~
25。夾角，泄流斜面12的高度為堰流壩高度的1/3~1/2。因泄流斜面12具有一定高度，為避免流經泄流斜面12的培養液對篩網架20造成過大沖擊，可調整泄流斜面12的高度控制流向篩網架20的液體流速處于低流速狀態。
[0034]實施例三:
參見圖1、圖3、圖7，第一個實施例或第二個實施例中的生物反應器的盒體I的側壁的上表面的外側設有臺階狀的凸緣25，盒體I的底壁的四周設有與側壁上表面的凸緣25相嵌合的對象嵌合凹槽26。多個盒體I通過反向嵌合對接構成層疊盒體30,蓋體2蓋合在頂部的盒體I上；相鄰的層疊盒體30上部的盒體I的底壁與下部的盒體I構成反應室,頂部的盒體I與蓋體2構成反應室；其中盒體I的出液孔19位于盒體I的底壁上，開設在盒體I底壁上的出液孔19構成了下部盒體I的進液孔18并能將上部盒體I的泄流槽9中的液體直接輸入下部盒體I的靜壓槽7當中，頂部盒體I的進液孔18位于其反應室上，并通過蠕動泵29將底部盒體I出液孔19排出的液體直接泵入到頂部盒體I的靜壓槽7當中；層疊盒體30中的盒體I的數目可以是2到20個，層疊盒體30與蓋體2、輸液管27、儲液罐28、蠕動泵29共同構成層疊生物反應器。[0035]使用時，培養液自頂部盒體I的靜壓槽7流經截流裝置3、篩網架20、溢流插板8后流入泄流槽9，多余液體從溢流口 13經引流槽16流入泄流槽9，然后通過出液孔19直接注入下層盒體I的靜壓槽7，再從底部的盒體I的出液孔19流入儲液罐28，再經蠕動泵29將儲液罐28中的培養液泵入到頂部盒體I的靜壓槽7中，來實現培養液的封閉式循環。其中，安裝在中部的盒體I的數量可根據需要增加或減少。如此循環流動，所有流經盒體I的中部的液體流速始終處于低流速狀態，使篩網架20上的擬生產組織工程產品或擬培養的三維組織器官都能得到充足的營養和適宜的剪切力，保證了產品質量。
[0036]本實施方式中的層疊盒體30中的盒體I也可使用如圖1、圖3當中的盒體1，使用時層疊盒體30上部的盒體I的出液孔19和相鄰下部盒體I的進液孔18也可通過輸液管27連接。
[0037]實施例四:
附圖8是將實施例三中的層疊盒體30放入無菌反應箱中，反應箱由箱體31和箱蓋32組成，反應箱上開設有與層疊盒體30頂部盒體I的進液孔18和底部盒體I的出液孔19相配合的能使輸液管27通過的孔道34，層疊盒體30位于箱體31中，儲液罐28和蠕動泵29位于箱體31外。
[0038]在反應箱外圍還可以設一循環水套33，儲液罐28和蠕動泵29位于循環水套33外。使用時，反應箱可使層疊盒體30處于無菌環境下，循環水套可以使層疊盒體處于恒溫狀態，培養液在反應箱內外循環流動，流經盒體I的中部的液體流速始終處于低流速狀態，為反應箱內的擬生產組織工程產品或擬培養的三維組織器官提供了充足的營養和適宜的剪切力。在反應箱外面設置的循環水套33，保障了反應箱內處于恒溫的反應狀態。
[0039]本發明通過設置閘門4或堰流壩5，與溢流口 13相配合，無論在何種灌注速度下，都能使培養液在靜壓槽7內形成穩定的壓力，流經篩網架20時始終保持較低流速，盒體I中部形成均勻的穩態平面流場，克服了現有灌注式培養中存在的流場不均一、營養傳遞不均勻容易造成細胞壞死的問題，提高了產品質量、縮短了培育時間；還可用于三維構建物或組織器官的共培養研究和藥物篩選。本發明還具有擴展性好、通用性強、適用范圍廣的特點，實現了對組織工程產品的標準化培養，大幅降低了勞動強度，提高了生產效率，具有很好的推廣和應用價值。
[0040]顯然，上述描述的所有實施例是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明的實施例， 本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范疇。
【權利要求】
1.一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，包括儲液罐(28)、蠕動泵(29)以及蓋體(2)和至少一個頂部敞口的長方體盒體(1)組成的反應室；所述盒體(1) 一端設置有截流裝置(3)，與盒體(1)構成靜壓槽(7)，另一端設置有溢流插板(8)，與盒體(1)構成泄流槽(9)，靜壓槽(7)和泄流槽(9)之間設置有與截流裝置(3)和溢流插板(8)均不接觸的篩網架(20);所述反應室上設置有與靜壓槽(7)連通并能將液體直接注入靜壓槽(7)的進液孔(18 )，在盒體(1)的壁上設置有與泄流槽(9 )連通并能將液體直接排出泄流槽(9 )的出液孔(19);所述截流裝置(3)的高度等于或低于盒體(1)的深度，篩網架(20)的高度低于截流裝置(3)的高度，溢流插板(8)的高度高于或等于篩網架(20)上篩網(21)的高度；所述反應室的出液孔(19 )、進液孔(18 )、儲液罐(28 )與蠕動泵(29 )通過輸液管(27 )依次連接；其特征在于:所述靜壓槽(7)的側壁上設置有能夠調節靜壓槽(7)內液面高度以形成穩定靜壓的溢流口(13)，在盒體(1)的側壁上設置有能將靜壓槽(7)經溢流口(13)溢出的多余液體通過進流口(17)排入泄流槽(9)的引流槽(16);所述截流裝置(3)沿縱向截面同一水平上開設有若干均勻排列的能將靜壓槽(7)內的液體勻速均勻引入反應區域的透水孔(6);調節進液孔(18)中液體的流速與溢流口(13)的高度與大小以在靜壓槽(7)、反應區域和泄流槽(9)中形成階梯狀的差位液面。
2.根據權利要求1所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述篩網架(20)固定在盒體(1)的兩側壁上；所述截流裝置(3)、溢流插板(8)與盒體(I)接觸的面上以及篩網架(20)與盒體(1)側壁接觸的面上設有卡子(23)，盒體(1)的側壁與底壁上設置有與卡子(23)相卡合的卡合凹槽(24)。
3.根據權利要求1所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述溢流口(13)包括U型槽以及在靜壓槽內U型槽旁設置的能通過定位軸(14)轉動蓋合U型槽并能通過調節U型槽下緣高度來調節靜壓槽(7)內液面高度的擋片(15)。
4.根據權利要求 1所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述透水孔(6)為相同的條形孔、圓形孔、半圓形孔或其他異形孔。
5.根據權利要求1所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述溢流插板(8)的高度高于篩網架(20)上的篩網(21)的高度為O~4mm。
6.根據權利要求1所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述截流裝置(3)為長方體的閘門(4)，透水孔(6)位于閘門(4)的中下部。
7.根據權利要求1所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述截流裝置(3)為包括上壩體(10)與下壩體(11)的堰流壩(5)，堰流壩(5)在靜壓槽(7)—側為長方體，下壩體(11)與篩網架(20)相鄰一側為與堰流壩(5)底面齊平的泄流斜面(12);所述泄流斜面(12)與盒體(1)底面呈15°~25°夾角，泄流斜面(12)的高度為堰流壩(5)高度的1/3~1/2 ;所述透水孔(6)位于上壩體(10)上。
8.根據權利要求1所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述篩網(21)上設置有細胞附著的規格模具(22)，規格模具(22)為方形、圓形、三角形或異形結構。
9.根據權利要求1至8任一項所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:多個盒體(1)通過反向層疊對接固定構成層疊盒體(30)，蓋體(2)蓋合在頂部的盒體(1)上并與頂部盒體(1)構成頂部反應室，層疊盒體(30)的相鄰盒體(1)的出液孔(19)與進液孔(18)相連，儲液罐(28)和蠕動泵(29)通過輸液管(27)連接在層疊盒體(30 )底部盒體(1)的出液孔(19 )和頂部反應室的進液孔(18 )之間。
10.根據權利要求9任一項所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述層疊盒體中盒體的數量為2到20個。
11.根據權利要求9所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述盒體(1)的側壁上表面的外側設有臺階狀的凸緣(25)，盒體(1)底壁上開設有能與凸緣(25)相嵌合的嵌合凹槽(26),多個盒體(1)反向并通過凸緣(25)與嵌合凹槽(26)的對接構成層疊盒體(30 )。
12.根據權利要求9所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述層疊盒體(30)中底部盒體(1)的出液孔(19)位于盒體(1)的側壁上，其他盒體(1)的出液孔(19)位于盒體(1)的底壁上并能將泄流槽(9)中的液體直接輸入下部盒體(1)靜壓槽(7)內。
13.根據權利要求9所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述層疊盒體(30)的外部設有由箱體(31)和箱蓋(32)組成的反應箱，反應箱上開設有能使輸液管(27)通過的孔道(34)，儲液罐(28)和蠕動泵(29)位于反應箱外。
14.根據權利要求13所述的一種適用于三維組織細胞灌注培養的生物反應器，其特征在于:所述反應箱外圍設有循環水套(33)，儲液罐(28)和蠕動泵(29)位于循環水套(33)外。
【文檔編號】C12M3/00GK103966095SQ201410218150
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月22日 優先權日:2014年5月22日
【發明者】伍津津 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院