一種鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子及其表達基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子及其表達基因與應用，所述的鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子的表達基因PabHLH，核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。經試驗證明，本發明所述的鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子的表達基因PabHLH具有在制備生產聯芐類化合物中的應用前景。
【專利說明】—種鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子及其表達基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子及其表達基因與應用，屬于基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]苔類植物是活性天然產物的寶庫，其中含有的聯芐類化合物是苔類植物所特有的，具有多種多樣的生物活性，為人們開發新藥物提供了前體化合物。然而由于苔類植物自然資源有限，原材料的來源受到限制。通過對聯芐類化合物生物合成途徑及其調控機制研究，運用代謝工程的手段，在同源或異源的植物中進行過表達，達到提高目標化合物產量的目的，是解決該類化合物來源的 一條途徑。苔類植物特有的聯芐類化合物和黃酮類化合物來源于一共同的苯丙烷途徑，該途徑受R2R3-MYB、MYC(bHLH)和WD40蛋白等各種類型轉錄因子的調控。
[0003]因此通過篩選調控該途徑轉錄因子的調控基因，從而實現苔類植物過量表達聯芐類化合物的目的，是提高聯芐類化合物產量的有效途徑。
[0004]鈍鱗紫背苔(Plagiochasma)，是一種小型的綠色植物，結構簡單，沒有莖葉分化，只有扁平的葉狀體，沒有真正的根和維管束。
[0005]目前，尚無通過過量表達bHLH轉錄因子提高聯芐類化合物含量的報道。
【發明內容】
[0006]本發明針對現有技術的不足，提供一種鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子及其表達基因PabHLH與應用。
[0007]本發明的技術方案如下:
[0008]一種鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]上述鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子的表達基因PabHLH，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所
/Jn ο
[0010]一種重組表達載體,表達載體中插入了上述表達基因PabHLH。
[0011]優選的，所述表達載體為植物表達載體pCAMBIA1301。
[0012]一種重組細胞，含有上述重組表達載體。
[0013]優選的，所述的重組細胞通過將上述表達載體轉化感受態大腸桿菌BL21 (DE3)后獲得。
[0014]上述鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子、上述表達基因PabHLH、上述重組細胞在制備生產聯芐類化合物中的應用。
[0015]有益效果
[0016]本發明首次利用RT-PCR方法從鈍鱗紫背苔cDNA文庫中篩選出I個基因表達量和聯芐類化合物含量呈正相關的bHLH轉錄因子，5’RACE獲得了其全長cDNA序列。通過構建GFP融合蛋白轉化洋蔥表皮細胞，證明該基因定位在細胞核，酵母單雜交實驗證明該基因具有轉錄激活活性。在鈍鱗紫背苔中過量表達bHLH基因提高了轉基因植物中聯芐類化合物含量。構建該基因RNAi載體，轉化鈍鱗紫背苔，相應聯芐類化合物含量降低。從而為通過代謝工程手段提高聯芐類化合物含量提供了一個候選基因。并且，通過根瘤農桿菌介導的方法將該基因轉入鈍鱗紫背苔，經過比較分析證明，轉基因植株聯芐化合物含量增加，從而證明鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子的表達基因PabHLH具有在制備生產聯芐類化合物中的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1:PabHLH基因5’ -RACE擴增產物的電泳圖；
[0018]其中:圖A:第一輪PCR擴增產物的電泳圖；
[0019]圖B:第二輪PCR擴增產物的電泳圖；
[0020]圖2:表達基因PabHLH擴增產物電泳圖；
[0021]其中:圖A =PabHLH全長cDNA擴增結果；
[0022]圖B =PabHLH基因組DNA擴增結果；
[0023]圖C =PabHLH內含子和外顯子分析。
[0024]圖3 =PabHLH的轉錄激活活性。
[0025]其中:圖A:PabHLH及PabHLH各截短片段PCR擴增；
[0026]圖B:對照質粒pGBKT7與PabHLH及PabHLH各截短片段重組質粒分別轉化酵
[0027]母AH109后于單缺培養基SD-Trp與三缺培養基SD-Trp-His-Ade上的生長情況。
[0028]圖4 =PabHLH的亞細胞定位。
[0029]其中:圖A:軟件預測定位；
[0030]圖B:融合載體 pCAMBIA1301GFP-PabHLH 與空載體 pCAMBIA1301GFP 通過農
[0031]桿菌介導瞬時轉化洋蔥表皮細胞，兩者在洋蔥表皮細胞中的表達情況；
[0032]左:激發光下綠色熒光信號；中:自然光下洋蔥表皮細胞；右:左圖與中圖疊加。
[0033]圖5:鈍鱗紫背苔愈傷組織遺傳轉化過程。
[0034]其中:圖A:愈傷組織與含有目的基因的農桿菌共培養；
[0035]圖B:篩選培養基上篩選陽性克隆；
[0036]圖C:經PCR鑒定的陽性克隆；
[0037]圖D:陽性克隆分化出小葉片。
[0038]圖6:農桿菌介導的PabHLH轉化愈傷組織及陽性鑒定。
[0039]其中:圖A:過表達轉基因愈傷組織陽性克隆鑒定；
[0040]圖B:轉RNAi載體愈傷組織陽性克隆鑒定。
[0041]圖7 =PabHLH轉基因愈傷組織實時定量PCR分析。
[0042]其中:圖A:過表達轉基因愈傷組織中PabHLH基因表達分析；
[0043]圖B:轉RNAi載體愈傷組織PabHLH基因表達分析。
[0044]圖8:轉基因愈傷組織化學成分分析。
[0045]其中:圖A:過表達轉基因愈傷組織和野生型愈傷組織中聯芐類化合物含量；
[0046]圖B:轉RNAi載體愈傷組織和野生型愈傷組織中聯芐類化合物含量變化；
[0047]圖C:野生型、過表達和轉RNAi載體愈傷組織聯芐類化合物HPLC分析結果；[0048]Pl:半月苔酸；P2:片葉苔素C;P3:核子木素E;P4:異地錢素C;P5:新地錢素A。【具體實施方式】
[0049]下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。
[0050]實施例1.表達基因PabHLH的克隆[0051 ] 1.1CTAB-PVP法提取鈍鱗紫背苔總RNA
[0052](I)取新鮮鈍鱗紫背苔植物材料，洗凈后用濾紙吸干多余水分。加液氮研磨材料，反復2-3次至材料成粉末狀，取少量至提前預冷的離心管中。
[0053](2)加lml65°C預熱的CTAB-PVP提取液，振蕩緩和均勻。
[0054]上述CTAB-PVP提取緩沖液按如下方法配制:
[0055]IOOmM Tris.HCl (ρΗ8.0) ,2% CTAB (w/v) ,2% PVP (w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高壓蒸汽滅菌之后巰基乙醇加至0.2% ;以上溶液用DEPC處理過的ddH20配制，高壓滅菌后備用。
[0056](3)65°C溫浴 30min,期間每隔 6_10min 振蕩一下。
[0057](4)冷卻后加入600 μ I氯仿，振蕩混合均勻。
[0058](5) 4? 13，OOOrpm 離心 lOmin。
[0059](6)取上清轉移至新離心管，加入600 μ I氯仿，振蕩混合均勻后4°C 13，OOOrpm離心 IOmin0
[0060](7)重復上步(即用氯仿抽提三次)。
[0061](8)小心吸取上清轉移至新的1.5ml離心管中，加入1/3體積的8M LiCl，_20°C靜置3h以上(或4°C靜置過夜)。
[0062](9) 4°C 13，OOOrpm 離心 IOmin,棄上清。
[0063](10)加入800 μ 175%乙醇洗滌沉淀。離心棄上清后揮干剩余乙醇。
[0064](I I)加入40 μ I Proteinase K處理后的滅菌水溶解RNA，制得總RNA。使用BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測定提取的RNA濃度及質量，經檢測，RNA濃度為773.7 μ g/ml, 260/280 為 1.93，260/230 為 1.89。
[0065]1.25’ RACE 的一鏈 cDNA 合成
[0066]采用試劑盒SMART? RACE cDNA Amplification Kit (購自 Clontech 公司)來進行5’ -RACE, cDNA第一鏈合成步驟如下:
[0067](I)在0.5ml離心管中加入以下成分:
[0068]3μ I 總 RNA ；1 μ 15，-CDS primer ；1 μ ISMART II A Oligo，混勻，7(TC 變性 lOmin，置于冰浴中2min, 13000rpm短暫離心3_5s使成分聚集管底。
[0069](2)在上述管中加入以下成分:2.0 μ 15Xfirst-strand buffer ；1.0 μ I DTT ( 二硫蘇糖醇，濃度 20mmol/L) ；1.0 μ IdNTP mix (eachlOmmol/L) ； 1.0 μ I PowerScript ReverseTranscriptase。
[0070](3)輕 輕混勻各成分，短暫離心，42°C空氣浴中反應1-1.5hr。
[0071](4)加入 100 μ I Tricine-EDTA buffer 稀釋第一鏈反應產物。
[0072](5) 72°C加熱 7min，樣品 5’ -RACE-Ready cDNA 貯存于 _20°C冰箱中保存。[0073]1.3 目的片段的 5’ -RACE
[0074]對cDNA文庫中EST測序，對PabHLH部分序列信息進行分析后，設計兩個3’端巢式引物 PabHLHGSP 與 PabHLHNGSP，其可以與 SMART? RACE cDNA Amplification Kit (購自Clontech公司)所帶引物UPM與NUP形成嵌套。
[0075]Universal Primer A Mix (UPM)
[0076]Long:5’ - CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3’
[0077]Short:5’ - CTAATACGACTCACTATAGGGC - 3’
[0078]Nested Universal Primer A (NUP)
[0079]5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3’
[0080]PabHLHGSP:CTGCTGGGGTCTGAACGCTGGGGTG ；
[0081 ] PabHLHNGSP:CCTGGGGTAATGCTCTGCCTTTG ；
[0082]嵌套PCR的第一輪反應體系為:
【權利要求】
1.一種鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.權利要求1所述鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子的表達基因PabHLH，核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
3.一種重組表達載體，表達載體中插入了權利要求2所述的表達基因PabHLH。
4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達載體為植物表達載體PCAMBIA1301。
5.一種重組細胞，含有權利要求3所述的重組表達載體。
6.如權利要求5所述 的重組細胞，其特征在于，所述的重組細胞通過將上述表達載體轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)后獲得。
7.權利要求1所述鈍鱗紫背苔bHLH轉錄因子、權利要求2所述表達基因PabHLH、權利要求5所述重組細胞在制備生產聯芐類化合物中的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK104004075SQ201410239571
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】程愛霞, 武一鳳, 婁紅祥 申請人:山東大學