一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法

一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法。本發明所提供的制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法，包括以神經節苷脂為底物用蛋白質進行催化反應得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂反應物的步驟，所述蛋白質，是如下a)或b)的蛋白質：a)氨基酸序列是SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.4的蛋白質；b)將SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.4的蛋白質所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質。實驗證明本發明提供的制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法具有較強的實用性。
【專利說明】—種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】中一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法。
【背景技術】
[0002]單唾液酸四己糖神經節苷脂(GMl)被證明具有顯著的神經修護及再生活性，是神經退行性疾病或神經損傷的良好的治療藥物，目前已被應用于阿爾茨海默癥、帕金森癥等疾病的治療中。由于生產技術的制約，GMl的價格非常昂貴，而在神經系統疾病中，GMl用藥周期較長，一個療程最少也要三個月，如此一來，治療費用大幅增加，導致GMl普遍應用受到限制。
[0003]目前，GMl的生產主要是從動物腦組織，如豬腦、牛腦中進行提取。提取時用到大量的氯仿、甲醇等有機試劑，造成了環境污染。此外，由于豬腦組織的神經節苷脂(gangliosides,GLS)中，GMl的含量較低，僅為10-20%，大部分是多唾液酸神經節苷脂，如⑶la、⑶lb、⑶3和GTlb等。直接提取時大部分的多唾液酸神經節苷脂被當作廢棄物丟棄掉，最后提取得到的GMl還不到神經節苷脂總脂的10%，一方面造成了豬腦原材料的浪費，另一方面也增加了成本。
[0004]豬腦中多唾液酸神經節苷脂⑶la、⑶Ib和GTlb的含量占總神經節苷脂的50-60%。對比各種神經節苷脂的結構可知，GMl可通過水解⑶la，⑶Ib和GTlb的唾液酸殘基得到。以往，有研究者通過部分酸水解豬腦神經節苷脂(gangliosides，GLS)來制備GMl0但酸水解的穩定性差，不同批次之間質量不穩定。此外，酸水解的專一性差，容易產生副產物，造成了 GMl產率偏低，且后續的產品分離純化比較困難。也有研究者利用GLS作為誘導劑，與唾液酸水解酶產生細菌共同培養，通過這些細菌分泌的唾液酸水解酶來生物轉化GLS，制備GM1。生物轉化與酸水解相比，具有條件溫和、專一性好等優越性。但是由于細菌分泌的唾液酸水解酶一般是誘導酶，即使用GLS進行誘導，分泌的唾液酸水解酶的量也非常少，造成了這一生物轉化過程的效率很低，這一生產過程不適合放大，不適用于工業規模的應用。此外，細菌菌種容易出現退化、變異等問題，給生產過程增添了不穩定性。現在急需通過基因工程的手段，直接克隆和表達所需要的酶的基因，實現GMl的穩定制備。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的方法。
[0006]本發明提供的制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的方法，包括以神經節苷脂GLS為底物用蛋白質進行催化反應得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl反應物的步驟，所述蛋白質的名稱為Cce sia-Ι,來源于纖維菌(Cellulosimicrobium sp.)21,是如下a)或b)或c)的蛋白質:
[0007]a)氨基酸序列是SEQ ID N0.2的蛋白質；
[0008]b)氨基 酸序列是SEQ ID N0.4的蛋白質；
[0009]c)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質；
[0010]d)將SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質。
[0011]其中，SEQ ID N0.2由703個氨基酸殘基組成，是天然唾液酸水解酶Cce sia_l (名稱為N Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4由724個氨基酸殘基組成，是重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι (名稱為R Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4是在SEQ ID N0.2的氨基末端添加氨基酸序列:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的氨基酸序列。
[0012]上述c)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ IDN0.1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上SEQ ID N0.1所示的信號肽的編碼序列得到。上述d)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述d)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ IDN0.3所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上SEQ ID N0.3所示的His-Tag的編碼序列得到。
[0013]上述方法中，所述方法包括從所述反應物中純化得到單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的步驟。
[0014]上述方法中，所述以神經節苷脂為底物用Cce sia-Ι進行催化反應在液體中進行，所述液體中Cce sia-Ι 和所述神經節苷脂的配比為IIU Cce sia_l:0.5_2mg所述神經節苷脂(如0.84IU Cce sia-1:lmg所述神經節苷脂)，所述IU為Cce sia-Ι的唾液酸水解酶酶活。
[0015]上述方法中，所述催化反應進行1-3小時，所述1-3小時可為1-2小時或1.5-2小時或2-3小時或2-2.5小時或2小時。
[0016]上述方法中，所述催化反應在30-42°C，所述30-42°C可為30-37°C或37-42 °C或37。。。
[0017]上述方法中，所述純化包括以下步驟:將所述反應物進行離心，使單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl進入上清液中，收集上清液，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的上清液，將所述上清液干燥，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的干燥粉，除去所述干燥粉中的雜質，得到單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。
[0018]上述方法中，除去所述干燥粉中的雜質包括以下步驟:將所述干燥粉溶于溶液A中，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的液體混合物，將所述液體混合物進行硅膠柱層析，用所述溶液A洗脫，收集含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的級分，將所述級分干燥，得到單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。
[0019]上述方法中，所述離心在常溫、6000rpm條件下進行IOmin ;所述溶液A由氯仿和甲醇組成，所述溶液A中氯仿和甲醇的體積比為5:4。
[0020]Cce sia-Ι在制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl中的應用也在本發明的保護范圍，如Cce sia-Ι生物轉化神經節苷脂(GLS)和/或GDla和/或GDlb和/或GTlb制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。
[0021]與Cce sia-Ι相關的生物材料在制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl中的應用也在本發明的保護范圍，如所述生物材料生物轉化神經節苷脂(GLS)和/或GDla和/或GDlb和/或GTlb制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。所述生物材料為下述BI)至B16)中的任一種:
[0022]BI)編碼Cce sia-Ι的核酸分子；
[0023]B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒；
[0024]B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體；
[0025]B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0026]B5)含有BI)所述核酸分子的重組微生物；
[0027]B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0028]B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0029]B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物； [0030]B9)含有BI)所述核酸分子的轉基因動物細胞系；
[0031]B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系；
[0032]Bll)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0033]B12)含有B4)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0034]B13)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；
[0035]B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；
[0036]B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0037]B16)含有B4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。
[0038]其中，所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
[0039]上述生物材料中，BI)所述核酸分子具體可為如下I)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子:
[0040]I)編碼序列是序列表中SEQ ID N0.1的第106-2217位核苷酸的DNA分子或cDNA分子;
[0041]2)核酸序列是序列表中SEQ ID N0.1的第1-2217位核苷酸的DNA分子；
[0042]3)編碼序列是序列表中SEQ ID N0.3的第1-2175位核苷酸的DNA分子或cDNA分子;
[0043]4)與I)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼Ccesia-Ι的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0044]5)在嚴格條件下與I)或2)或3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼Cce sia-Ι的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0045]其中，SEQ ID N0.1由2217個核苷酸組成，SEQ ID N0.1的第1-105位核苷酸編碼信號肽，SEQ ID N0.1的第106-2217位核苷酸編碼SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。纖維菌(Cellulosimicrobium sp.)21中的Cce sia_l基因的基因組基因編碼SEQ ID N0.2的蛋白質。SEQ ID N0.3由2175個核苷酸組成，編碼SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID N0.3的第1-63位核苷酸為pET-28a(+)載體上的序列，SEQ ID N0.3的第13-30位核苷酸編碼His-Tag, SEQ ID N0.3的第64-2175位核苷酸編碼SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0046]本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼Cce sia-Ι的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的Cce sia-Ι的核苷酸序列70%或者更高同一'丨生的核苷酸,只要編碼Cce sia-1且具有唾液酸水解酶活性，均是衍生于本發明的核苷酸序列并且等同于本發明的序列。
[0047]這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發明的啟動子核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。
[0048]上述生物材料中，所述嚴格條件是在2XSSC，0.1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5XSSC，0.1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次 15min。
[0049]上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%、95%以上的同一性。
[0050]上述生物材料中,B2)所述的含有編碼Cce sia-Ι的核酸分子的表達盒(Cce sia-1基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達Cce sia-Ι的DNA，該DNA不但可包括啟動Ccesia-Ι基因轉錄的啟動子,還可包括終止Cce sia_l轉錄的終止子。進一步,所述表達盒還可包括增強子序列。
[0051]可用現有的表達載體構建含有所述Cce sia-Ι基因表達盒的重組載體。
[0052]上述生物材料中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。
[0053]上述生物材料中，B5)_B8)所述的微生物可為酵母、細菌、藻和真菌，如大腸桿菌。
[0054]上述生物材料中，B9)_B12)所述的轉基因植物細胞系和轉基因動物細胞系不包括繁殖材料。所述轉基因動物細胞系可為昆蟲細胞。
[0055]在本發明的一個實施方式中,Cce sia-Ι的編碼基因通過含有Cce sia-Ι的編碼基因的表達盒的重組載體導入大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)中。所述重組載體為用SEQ ID N0.2的第106-2217位所示的DNA分子替換pET_28a(+)的Nde I和BamH I識別位點間的片段得到的重組載體pET_28a/Cce sia-lo
[0056]Cce sia-1在催化神經節苷脂GLS制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl中的應用也在本發明的保護范圍。
[0057]上述BI)至B16)任一種與Cce sia-Ι相關的生物材料在催化神經節苷脂GLS制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl中的應用也在本發明的保護范圍。
[0058]實驗證明，可以利用Cce sia-Ι作為唾液酸水解酶，以神經節苷脂作為底物進行催化反應得到單唾液酸四己糖神經節苷脂(GMl)。利用本發明的Cce sia-Ι制備單唾液酸四己糖神經節苷脂，反應條件溫和，對設備要求低，生產過程無需高溫或者冷卻，能耗低，由于酶催化具有高效、專一的選擇性，且轉化率高，達到95%，生物轉化速率快，在2h內即可完成，此法生產GMl無副產物產生，純化方便。反應絕大部分溶劑為水，三廢排放低，綠色環保，并實現了 GMl的穩定制備，解決了傳統的生物轉化與酸水解制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的產量低、原料浪費、成本高、質量不穩定等問題。本發明提供的制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法具有較強的實用性。
[0059] 牛物材料保藏說明
[0060]生物材料的分類命名:纖維菌(Cellulosimicrobium sp.)[0061]生物材料的菌株編號:21
[0062]生物材料的保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0063]生物材料的保藏單位簡稱:CGMCC
[0064]生物材料的保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101
[0065]生物材料的保藏日期:2013年05月14日
[0066]生物材料的保藏中心登記入冊編號=CGMCC N0.7587
【專利附圖】

【附圖說明】
[0067]圖1為Cce sia-Ι基因的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為DNA marker,泳道2為Cce sia-Ι基因的PCR擴增產物。
[0068]圖2為重組載體pET-28a/Cce sia-1的Nde I和BamH I雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為pET-28a(+)的Nde I和BamH I雙酶切產物，泳道2為DNAmarker，泳道3為pET-28a/Cce sia-1 的Nde I和BamH I雙酶切產物。
[0069]圖3為蛋白誘導表達的聚丙酰胺凝膠電泳圖。其中，泳道I為蛋白質分子量marker，泳道2為重組菌pET_28a/E.co I i BL21 (DE3)誘導前總蛋白溶液；泳道3為重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)誘導后總蛋白溶液;泳道4為重組菌pET_28a/Cce sia-1/E.coli BL21 (DE3)誘導前總蛋白溶液；泳道5為重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coliBL21 (DE3)經IPTG誘導后總蛋白溶液；泳道6為Ni柱純化后的Cce sia-Ι蛋白。
[0070]圖4為重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι水解豬腦神經節苷脂GLS的反應產物的HPLC-氨基柱分析圖譜。其中，曲線a為神經節苷脂標準品圖譜；曲線b為神經節苷脂GLS圖譜；曲線c為神經節苷脂GLS轉化2h后的圖譜。
[0071]圖5為重組表達載體pET_28a/Cce sia-1的構建示意圖。
[0072]圖6為重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的生物學特性。其中，a為最適pH曲線；b為PH穩定性曲線；c為最適溫度曲線；d為溫度穩定性曲線。
【具體實施方式】
[0073]下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0074]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0075]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0076]纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21由東北師范大學從土壤中篩選得到，于2013年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.7587。
[0077]實施例1、唾液酸水解酶重組載體的構建
[0078]將來自纖維菌(Cellulosimicrobiumsp.) 21 (保藏號為 CGMCC N0.7587)的唾液酸水解酶的多核苷酸(SEQ ID N0.1)通過PCR的方式獲得，克隆到表達載體pET_28a中，得到可以表達唾液酸水解酶的重組質粒。具體步驟包括:
[0079]I)纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21基因組DNA的提取:將纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21在LB瓊脂培養基上,37 °C活化12h。活化的菌種接一環至LB液體培養基中，37 °C、200rpm振蕩培養12h。6000rpm、4 V離心10min收集菌體，用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，按照說明書提取纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21 基因組 DNA。
[0080]2) Cce sia-Ι 基因的擴增:
[0081]以纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21的基因組DNA為模板進行PCR,擴增Ccesia-Ι 基因。擴增引物為:Primer-FS' -GGAATTCCATATGCACCACACGACCCTCGCCCCC-3' ；Primer-R5' -CGGGATCCTCATCAGGACCAGTCGGTCGCCA-3'。擴增條件為:98°C預變性30s ;98°C 10s，65°C 40s，72°C lmin，30個循環；72°C延伸lOmin。I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，如圖1所示。對獲得的片段進行測序，測序結果表明獲得的片段含有SEQ IDN0.1所示的DNA分子，SEQ ID N0.1所示的DNA分子是天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι的編碼序列，編碼SEQ ID N0.2所示的唾液酸水解酶Cce sia-Ι，將該天然唾液酸水解酶Cce sia-Ι命名為N Cce sia-lo
[0082]3)重組載體 pET_28a/Cce sia-1 的構建
[0083]如圖5所示，用PCR產物純化試劑盒回收PCR產物。用限制性內切酶Nde I和BamHI (New England Biolabs)酶切回收的 PCR 產物與 pET~28a (+)載體(Novegan)(圖 2),酶切結束后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，DP209)回收酶切產物。膠回收試劑盒回收的經過相同酶切處理的pET-28a(+)載體與PCR產物在T4DNA連接酶(TAKARA，2011A)的作用下連接過夜。連接產物轉化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，篩選陽性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，驗證序列的正確性。將用SEQ IDN0.1的所示Cce sia-Ι基因替換pET_28a(+)的Nde I和BamH I位點間的片段(保持pET_28a (+)的其它序列不變)得到的重組 載體命名為pET_28a/Cce sia-lo將含有pET_28a/Cce sia_l重組表達載體的陽性克隆命名為重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)。重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)表達SEQ ID N0.4所示的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι，將該重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι命名為R Cce sia-l0 SEQ ID N0.4的第22-724位氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。pET-28a/Cce sia-1中含有SEQ ID N0.4第1-2175位核苷酸所示的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的編碼基因。
[0084]將空載體一pET_28a(+)載體導入Ε.coli BL21 (DE3)得到含有pET_28a(+)的重組菌pET-28a/E.coli BL21 (DE3)，作為空載體對照菌。
[0085]實施例2、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的制備
[0086]1、將實施例1 的重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)接種于含 50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養基上，37 °C培養過夜。挑一環接種到60ml含有50 μ g/ml卡那霉素的LB與I %甘油的液體培養基中，37°C、200rpm培養至0D600為2.0 (以含有50 μ g/ml卡那霉素的LB與1%甘油的液體培養基為空白對照)，即為種子液。將種子液按照1:50的比例接種到3L發酵培養基中(發酵培養基的溶劑為水，其溶質及濃度為:1% (質量百分比濃度)胰蛋白胨、0.5% (質量百分比濃度)酵母提取物、1% (質量百分比濃度)NaCl、I %(體積百分比濃度)甘油、0.14% (質量百分比濃度)磷酸二氫鉀、0.24% (質量百分比濃度)磷酸氫二鉀、0.25% (質量百分比濃度)硫酸鎂，ρΗ7.0)，在寶興FUS-5L發酵罐中進行發酵。培養溫度37°C，空氣流量3L/min，壓力0.05MPa,轉速160rpm，氨水調pH，使發酵過程中PH保持在7.2。發酵過程中溶氧上升時開始補料，補料培養基的溶劑為水，其溶質及濃度為:35% (體積百分比濃度)甘油、5% (質量百分比濃度)蛋白胨和2% (質量百分比濃度)酵母抽提粉。待0D600到達18-20(以發酵培養基為空白對照)時降溫至25°C，并加
0.4mM IPTG誘導12h。誘導結束后，5000rpm離心10min收集菌體，用PBS洗菌體I次后重新懸浮在IL的PBS緩沖液中，超聲破碎細胞，15000g、4°C離心30min，收集上清液，上清液即為重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導后總蛋白溶液。同時取誘導前的重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21菌體，用PBS洗菌體I次后重新懸浮在IL的PBS緩沖液中，超聲破碎細胞，15000g、4°C離心30min，收集上清液，得到重組菌pET_28a/Cce sia-1/E.coli BL21 (DE3)的誘導前總蛋白溶液。
[0087]2、按照本實施例中步驟I的方法，將實施例1的重組菌pET-28a/Cce sia-1/E.coli BL21 (DE3)替換為重組菌pET_28a/E.coli BL21 (DE3)，其它步驟不變，分別得到重組菌 pET-28a/E.coli BL21 (DE3)的誘導后總蛋白溶液和重組菌 pET_28a/E.coli BL21 (DE3)的誘導前總蛋白溶液。
[0088]3、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的純化
[0089]在重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導后總蛋白溶液中加入咪唑使其終濃度為10mM，得到總蛋白的咪唑溶液，將總蛋白的咪唑溶液與20ml的Ni Sepharosefastflow凝膠(GE healthcare)在4°C條件下緩慢振蕩30min,得到蛋白-凝膠混合物,將蛋白-凝膠混合物裝入直徑為1.6cm、高IOcm的玻璃層析柱中。然后用2倍層析柱體積的IOmM咪唑/PBS溶液洗脫，再用5倍層析柱體積的250mM的咪唑/PBS溶液洗脫。收集250mM咪唑洗脫的級分，得到含有重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶液，用截留分子量為IOkDa的超濾膜(Millipore公司產品)除去酶液中的咪唑,得到純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-lo
[0090]4、將重組菌pET_28a /Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導后總蛋白溶液、重組菌 pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導前總蛋白溶液、重組菌 pET_28a/E.coliBL21(DE3)的誘導后總蛋白溶液、重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導前總蛋白溶液和純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果如圖3所示，表明只有重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導后總蛋白溶液和純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι和重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導前總蛋白溶液中有75kDa的蛋白(即Cce sia-Ι)條帶，重組菌pET_28a/E.coli BL21 (DE3)的誘導后總蛋白溶液和重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導前總蛋白溶液均沒有該75kDa的蛋白(即 Cce sia-Ι)條帶。
[0091]用考馬斯亮藍G-250法測定重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)誘導后總蛋白溶液的蛋白含量為39.9mg/ml。
[0092]5、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι活性的測定
[0093]I)以突光底物 2 ' -(4-Methylumbelliferyl)- a -D-N-acetylneuraminicacid sodium salt hydrate (4_MU_NeuAc)檢測重組唾液酸水解酶Cce sia-1和野生型菌株唾液酸水解酶的酶活力。唾液酸水解酶酶活力測定體系為:100 μ I反應體系中，依次加入10μ I適當稀釋的重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導后總蛋白溶液或重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導后總蛋白溶液或野生型菌株纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21 的總蛋白溶液，10 μ 14_MU_NeuAc (ImM)和 80 μ I Tris-HCl 緩沖液(50mM, ρΗ7.5)，37°C反應10min后，加入100 μ IlM NaOH終止反應。參照4-MU標準曲線計算唾液酸水解酶的酶活。
[0094]唾液酸水解酶的酶活單位(IU)定義為每分鐘催化底物生成I μ mol4-MU所需要的酶量為1IU。
[0095]根據檢測的結果計算得到的重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導后總蛋白中唾液酸水解酶的酶活為17IU/mg總蛋白，重組菌pET-28a/E.coli BL21(DE3)的誘導后總蛋白并無唾液酸水解酶酶活。實驗結果表明Cce sia-Ι蛋白具有唾液酸水解酶酶活，證明Cce sia-Ι蛋白為唾液酸水解酶。
[0096]重組菌pET_28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導后總蛋白中唾液酸水解酶的酶活為17IU/mg總蛋白，野生型菌株纖維菌(Cellulosimicrobium sp.) 21總蛋白中唾液酸水解酶酶活為0.25IU/mg總蛋白，表明重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21(DE3)的誘導后總蛋白中唾液酸水解酶的酶活是野生型菌株總蛋白中唾液酸水解酶的酶活的68倍，說明重組菌pET-28a/Cce sia-l/E.coli BL21 (DE3)的誘導后的總蛋白具有更高的唾液酸水解酶酶活。其中，總蛋白含量均用用考馬斯亮藍G-250法測定。
[0097]2)將純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι按照上本實施例中步驟5中I)的測定酶活的方法測定唾液酸水解酶酶活，結果表明純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的唾液酸水解酶比活力為42IU/mg蛋白。
[0098]實施例3、重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的生物學特性
[0099]1、溫度對重組唾液酸水解酶活力的影響
[0100]在20_80°C水浴中，以4-MU-NeuAc為底物，按照實施例2中步驟5中的I)的方法測定純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活力。實驗結果表明，重組唾液酸水解酶Ccesia-Ι的最適反應溫度為45°C (圖6中b)。
[0101]2、pH對重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι活力的影響
[0102]將適當稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι與底物4-MU_NeuAc在不同PH值的緩沖液中，37 °C條件下反應lOmin，測定重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι在不同PH條件下的酶活力。采用的緩沖液分別為:50mM NaAc-HAc緩沖液，pH2.0-6.0 ；50mMNa2HPO4-NaH2PO4 緩沖液，pH6.0-7.5 ；50mM Tris-HCl 緩沖液，pH7.5-9.0 ；50mM Gly-NaOH 緩沖液，pH9.0-11.0。實驗結果表明，重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的最適pH值為5.0 (圖6中a) ο
[0103]3、溫度對重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι穩定性的影響
[0104]將純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι分別在20、30、35、40、45、50、60°C的水浴中保溫Ih測定酶活力。以未處理的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι作為對照(酶活為100% )。實驗結果發現，純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι分別在20、30、35、40、45、50、60°C保溫Ih后，其殘余酶活力分別為73%,82%,66%,6.2%,3.5%,4.0%,6.4% (圖6中d)。
[0105]4、pH對重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι穩定性的影響
[0106] 將10 μ I適當稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液與50 μ I濃度為IOOmM的各種不同pH值(4.0-11.0)的緩沖液混合(采用的緩沖液分別為:50mM NaAc-HAc緩沖液，ρΗ4.0-6.0 ；50mM Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液，pH6.0-7.5 ；50mM Tris-HCl 緩沖液，ρΗ7.5-9.0 ；50mM Gly-NaOH 緩沖液，pH9.0-11.0)，分別在 4°C冰箱中保溫 Ih 后，取 10 μ I 保溫后的酶液測定殘余酶活。對照組為10 μ I適當稀釋的酶液與50 μ I去離子水混合(酶活為100% )，結果表明重組唾液酸水解酶Cce Sia-1在ρΗ4.0-11.0范圍內保溫Ih后，仍保留60%以上的酶活力(圖6中c)。
[0107]5、金屬離子或化學試劑對重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι活性的影響
[0108]將金屬離子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+、Ba2+和Mn2+分別與適當稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液混合,每種金屬離子的終濃度均有兩種,分別為5mM和50mM。在4°C保溫Ih后，以4-MU-NeuAc作為底物，測定重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的殘余的酶活力。將常用化學試劑DTT、EDTA和SDS分別與適當稀釋的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液混合，每種化學試劑的終濃度均有兩種，分別為5mM和50mM，在4°C保溫Ih后，以4-MU-NeuAc作為底物,測定重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的殘余的酶活力。在測定金屬離子或化學試劑對重組唾液酸水解酶活性的影響中，均將未處理的純化的重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶液的酶活設定為100%，實驗結果見表1。實驗結果表明，5mM K+、5mMHg2+、5mM Ba2+、5mM Mn2+和 5mM DTT 對重組唾液酸水解酶 Cce sia-1 有激活作用，50mM K+、50mMCa2\50mM Mg2+、和50mM Ba2+部分抑制了重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活，5mM Fe3\50mMFe3\50mM Cu2\50mM Hg2+、5mM SDS 和 50mM SDS 嚴重抑制了重組唾液酸水解酶 Cce sia-Ι 的酶活，其余金屬離子Ca2+、Na+、Mg2+、Cu2+和化學試劑EDTA對重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι的酶活抑制程度較輕或幾乎無影響。
[0109]表1、不同金屬離子和化學試劑對重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι酶活的影響
【權利要求】
1.制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法，包括以神經節苷脂為底物用蛋白質進行催化反應得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂反應物的步驟，所述蛋白質，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質: a)氨基酸序列是SEQID N0.2的蛋白質； b)氨基酸序列是SEQID N0.4的蛋白質； c)將SEQID N0.2所示的氨基酸 序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質； d)將SEQID N0.4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法包括從所述反應物中純化得到單唾液酸四己糖神經節苷脂的步驟。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述以神經節苷脂為底物用蛋白質進行催化反應在液體中進行，所述液體中所述蛋白質和所述神經節苷脂的配比為IIU所述蛋白質:0.5-2mg所述神經節苷脂,所述IU為所述蛋白質的唾液酸水解酶酶活。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述催化反應進行1-3小時，所述催化反應在30-42 °C。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述純化包括以下步驟:將所述反應物進行離心，使單唾液酸四己糖神經節苷脂進入上清液中，收集上清液，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂的上清液，將所述上清液干燥，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂的干燥粉，除去所述干燥粉中的雜質，得到單唾液酸四己糖神經節苷脂。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:除去所述干燥粉中的雜質包括以下步驟:將所述干燥粉溶于溶液A中，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂的液體混合物，將所述液體混合物進行硅膠柱層析，用所述溶液A洗脫，收集含有單唾液酸四己糖神經節苷脂的級分，將所述級分干燥，得到單唾液酸四己糖神經節苷脂； 所述溶液A由氯仿和甲醇組成，所述溶液A中氯仿和甲醇的體積比為5:4。
7.權利要求1所述方法中的所述蛋白質在制備單唾液酸四己糖神經節苷脂中的應用。
8.與權利要求1所述方法中的所述蛋白質相關的生物材料在制備單唾液酸四己糖神經節苷脂中的應用。
9.權利要求1所述方法中的所述蛋白質在催化神經節苷脂制備單唾液酸四己糖神經節苷脂中的應用。
10.與權利要求1所述方法中的所述蛋白質相關的生物材料在催化神經節苷脂制備單唾液酸四己糖神經節苷脂中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK104004801SQ201410254826
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】周義發, 高娟, 原野, 及莉, 冷佳益, 陳紅磊, 臺桂花 申請人:東北師范大學