一種早期旱脅迫誘導高羊茅dreb2基因的篩選試劑盒及方法
【專利摘要】本發明公開了一種早期旱脅迫高羊茅DREB2基因的篩選試劑盒及方法。本發明以PEG6000旱脅迫處理(0h、6h、12h、18h和24h)的高羊茅為實驗材料，利用Illumina/Solexa測序平臺的RNA-seq技術進行混合轉錄組測序分析，以已登記的DREB2基因序列為探針進行本地Blast(Local?Blast)，篩選早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2基因。本發明方法可以快速、全面的篩選旱脅迫誘導的高羊茅DREB2候選基因，對抗旱機制研究和植株抗性分子育種具有重要指導意義。
【專利說明】一種早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2基因的篩選試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]DREB2s (Dehydration Responsive Element Binding Protein2)是一類植物特有的轉錄因子，隸屬于AP2/EREBP轉錄因子家族，在植物逆境信號轉導途徑中有重要作用。Liu等和Kasuga等首次從擬南芥[Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.]中克隆得到了 DREB2A轉錄因子，發現其與干旱應答兀件 CRT/DRE (C-Repeat/Dehydration-Responsive Element,核心序列:A/GCCGAC)或GCC-BOX(核心序列:TAGCCGCCA)特異性結合，參與調控干旱、高鹽和低溫等耐性相關基因的表達，在植物的非生物脅迫應答過程中發揮重要作用。在GenBank數據庫注冊的編碼DREB2S序列涉及20多個物種，這其中包括模式植物、重要的大田作物和旱鹽脅迫生境條件下生長的植物，目前人們更熱衷于在逆境適應性強的植物材料中挖掘新的DREB2基因，DREB2s基因功能及調控機制的研究則主要以模式植物擬南芥為研究對象。DREB2s促使下游含DRE元件的脅迫誘導基因發揮作用，使植物的抗逆性得到綜合改良。Qin等將玉米ZmDREB2A轉化到擬南芥，發現其過量表達能夠激活下游HSPs和HsfA3等熱激相關基因的表達，轉ZmDREB2A植物的耐旱和耐熱性提高。PgDREB2A可以增加轉基因煙草的耐鹽和抗旱性，并且在滲透脅迫和熱脅迫條件可以上調下游基因，轉PgDREB2A煙草耐鹽性、抗熱性顯著提高，而TO代種子產量和植株表型與野生型無異。但是，植物中過量表達有些來源的DREB2s，在提 高植株抗逆性的同時，會對植物產生一定的毒害作用，導致轉基因植物生長遲緩，影響植物的生長發育，表現為生長的延遲及植株的矮化。Sakuma等對轉基因植株生長遲緩原因研究時發現，使用誘導型啟動子RD29A可以避免AtDREB2A過量表達引起的生長遲緩。35S:AtDREB2A CA轉基因植株生長矮化，而且矮化程度與AtDREB2A CA和其下游功能基因RD29A的表達水平成正比，而轉全長基因的35S:AtDREB2A FL轉基因植株的生長矮化現象不明顯。
[0003]高羊茅(Festucaarundinacea = Lolium arundinaceum)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是我國目前使用量增長最快的草種，在我國大部分地區可以栽培，是南方地區綠期最長的冷季型草坪。高羊茅的夏季生長需水量較大，夏季干旱和高溫環境條件是限制其生長的主要因素。提高環境的適應性，培育節水、耐旱抗高溫型品種是目前高羊茅育種的主要目標之一。植物抗逆性狀非常復雜，往往與數量性狀位點連鎖，而高羊茅的遺傳背景復雜(PPGlG2G3G4，2n = 6x = 42)，基因組較大(5.27~5.83X 106kb)，且為種子繁殖為主的異花授粉植物，采用傳統的選擇育種獲得的品種(品系)多為異質雜合群體，選育周期長，性狀不穩定，獲得優良抗性品種十分困難。隨著植物分子生物學和基因工程技術的迅猛發展，利用基因工程技術改良高羊茅性狀成為可能。DREB2S轉錄因子可調控下游大量逆境脅迫基因的表達，利用該轉錄因子有望綜合改良植物的抗逆性。因此，對具有產業化潛力的DREB2轉錄因子進行基因功能和抗逆調控機制研究，利用它們改造高羊茅，將有助于高羊茅等草坪植物的抗逆基因工程育種。
[0004]與轉錄組學研究的方法(基因芯片技術、SAGE技術和MPSS技術、EST技術、高密度全基因組芯片)相比，RNA-Seq技術是全新的轉錄組研究方法，可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，用序列片段的數量表示基因的轉錄水平，能夠檢測可變剪接和新基因，對轉錄體結構的分析有了明顯的提高，而且不同批次樣品間基因表達的數據易于進行比較。這些獨特的優勢，使得RNA-Seq技術成為目前深入研究生物體轉錄組復雜性的強大工具。
[0005]利用RNA-seq技術系統分析高羊茅DREB2轉錄因子，為揭示高羊茅DREB2候選基因、剖析DREB2參與的植物抗逆調控分子網絡提供了新的思路，將加快FapDREB2在高羊茅和其他植物的抗逆基因工程育種的步伐。
[0006]數字基因表達譜(Digital Gene Expression Profiling, DGE)是利用高通量測序，系統、快速地檢測某一物種特定組織在特定狀態下的基因表達情況的技術。DGE已被廣泛應用于基礎科學研究領域。已有研究報道利用DGE對黃肉獼猴桃果實著色過程中相關差異基因、脂多糖活化巨噬細胞的基因表達、莖瘤芥根和莖組織轉錄組比較和小尾寒羊高繁性狀相關基因的篩選和解析研究。
[0007]本地Blast (Local Basic Local Alignment Search Tool)是在本地化的蛋白質或DNA數據庫中進行相似性序列比較的工具，已經被用于某一物種特定組織中某一個或家族的基因篩選。已有研究報道利用擬南芥WRKY轉錄因子家族基因序列為探針，對蘋果全基因組序列執行本地Blast搜索，結合生物信息學方法來篩選蘋果WRKY轉錄因子家族基因；以擬南芥和水稻ANK家族基因序列執行本地Blast搜索‘金冠’蘋果全基因組序列，結合結構域搜索工具⑶(conserved donmain)、perl程序等生物信息學方法,解析蘋果錨蛋白基因ANK家族基因。
【發明內容】
[0008]本發明旨在針對目前高羊茅抗旱分子機制相關信息的匱乏，提供一種早期旱脅迫高羊茅DREB2基因的篩選試劑盒及方法。
[0009]為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為:
[0010]所述早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑盒，所述試劑盒包括表1所述的探針(共38條):
[0011]表1
【權利要求】
1.一種早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括具有如下登錄號的探針:
AT1G06770
AT1G21910
AT1G75490
AT2G30580
AT2G38340
AT2G40340
AT2G40350
AT3G11020
AT3G23060
AT3G57600
AT5G03720
AT5G05410
AT5G18450
G1:38099059
G1:66710525
61:71534115
61:71534117
G1:169786768
G1:169786766
61:169786764
G1:169786762
G1:169786760
G1:169786758
G1:169786756
G1:169786754
G1:169786752
G1:169786750
G1:169786748
G1:169786746
G1:169786744
61:331123577
61:331123576
61:331123574
61:331123571
G1:374721234
G1:374721232
G1:374721228G1:374721226ο
2.如權利要求1所述探針在制備早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑中的應用。
3.一種早期旱脅迫誘導高羊茅DREB2候選基因的篩選方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)將50d齡的高羊茅植株根系分別浸泡在質量百分比濃度為20%的PEG6000中Oh，6h，12h，18h和24h ;其中，Oh為對照組，6h、12h、18h和24h為處理組； (2)用Trizol法分別提取經步驟(1)模擬旱脅迫處理后的高羊茅葉片的RNA，各處理和對照組的混合RNA作為總轉錄組測序的樣本來源；采用高通量測序技術平臺IlluminahiSeq?2000進行轉錄組深度測序，得到若干讀段原始數據，將所得的讀段原始數據進行過濾，過濾原則為:①去除包含接頭的讀段過濾時使用的接頭序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 ;②去除含有未知堿基比例10%以上的讀段；③去除低質量且堿基大于50%的讀段，所示低質量是指質量值小于5的讀段去除平均質量值小于15的讀段，得到可用讀段，然后對可用讀段進行de novo拼接后組裝得到高羊茅混合轉錄組庫，高羊茅混合轉錄組庫中獨立基因的平均長度為691bp，N50長度為1279bp ； (3)采用權利要求1所述的探針對高羊茅混合轉錄組庫進行LocalBlast分析，設置Local Blast分析的輸出結果e-value閾值為le_5,篩選DREB2獨立基因； (4)將步驟(1)所述的4個處理組分別與對照組進行數字基因表達譜分析；獨立基因表達量統計分析使用RPKM法，計算得到體現基因表達量的差異基因數據庫，其計算公式為:
【文檔編號】C12Q1/68GK104004848SQ201410254825
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】張志飛, 張瑜, 王增裕, 陳桂華, 趙志麗 申請人:湖南農業大學, 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所