基于亞硝酸鹽還原酶的工程菌及其實現方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程【技術領域】的亞硝酸鹽還原酶的工程菌及其實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增依次得到編碼亞硝酸鹽還原酶大亞基及亞硝酸鹽還原酶小亞基的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列依次連接到共表達載體pETDuet‐1，最終獲得重組共表達載體pETDuet‐NC‐ND；之后將該亞硝酸鹽還原酶表達載體轉化到大腸桿菌表達菌株。本發明針對現有技術存在的由于亞硝酸鹽還原酶在生物體內多為胞內酶且表達量較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，能夠應用基因工程手段實現亞硝酸鹽還原酶體外的大量表達合成，對于次生鹽漬化土壤的快速修復乃至實現精準農業具有重大意義。
【專利說明】基于亞硝酸鹽還原酶的工程菌及其實現方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種生物基因工程【技術領域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于亞硝酸鹽還原酶的工程菌及其實現方法。
【背景技術】
[0002] 從環境角度來講，N元素的積累，可造成肥料的浪費而且影響作物生長及土壤利 用，同時可通過農田的地表徑流和農田滲漏，導致農業面源污染；從食品安全角度來講，當 人體攝入過量的硝酸鹽，在體內硝酸鹽（Ν0Γ)容易還原成亞硝酸鹽（Ν0Γ)，亞硝酸鹽能使 細胞中攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成無攜氧能力的高鐵蛋白而造成組織缺氧，不僅如此，被 氧化成的高鐵蛋白還會降低已攜有氧的氧合血紅蛋白向身體組織釋放氧的功能，使人體缺 氧，嚴重時有使人窒息死亡的危險。更可怕的是亞硝酸鹽和二甲胺、三甲胺作用后會生成亞 硝胺。亞硝胺是一種具有強烈致癌性的化合物，在已發現的120種亞硝胺類化合物中，75% 被確認有致癌性，亞硝胺還有引起遺傳變異和怪胎的潛在危險，一旦這種物質進入蔬菜，對 人的影響是非常可怕的。因此，如何快速消除環境中殘存的亞硝酸鹽，便成為接下工作的重 中之重。
[0003] 生物修復法尤其是生物酶法的出現，為快速降解環境（如土壤和水體）中的亞硝 酸鹽提供了一個新的方法。一般而言，亞硝酸鹽還原酶在生物體內多為胞內表達且表達量 很低，不能滿足環境修復的需求。于是構建一種高效亞硝酸鹽還原酶轉基因過表達菌株，實 現亞硝酸鹽還原酶的高效表達就顯得尤為關鍵。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有技術存在的由于亞硝酸鹽還原酶在生物體內多為胞內酶且表達 量較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，提出一種基于亞硝酸鹽還原酶的工程菌及 其實現方法，能夠應用基因工程手段實現其體外的大量表達合成，對于次生鹽漬化土壤的 快速修復乃至實現精準農業具有重大意義。
[0005] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0006] 本發明涉及一種亞硝酸鹽還原酶的工程菌，該工程菌為外源表達亞硝酸鹽還原酶 的大腸桿菌。
[0007] 所述的亞硝酸鹽還原酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1亞硝酸鹽還原酶編碼基因，由亞硝酸鹽還原酶大亞基和亞硝酸鹽還原酶小亞基構 成，其核苷酸序列分別為260 lbp和354bp，分別編碼866和117個氨基酸。
[0008] 所述的亞硝酸鹽還原酶大亞基SG -NC的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，氨基酸 序列如SEQ ID No. 3所示；亞硝酸鹽還原酶小亞基SG -ND的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所 示，氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0009] 所述的亞硝酸鹽還原酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。
[0010] 所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現保藏于中國普通 微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101。 [0011] 本發明涉及上述工程菌的實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點的引物進行PCR擴增依次得到編碼亞硝酸鹽還原酶大亞基及小亞基的核苷酸序 列；然后將擴增得到的基因序列依次連接到共表達載體pETDuet - 1，最終重組共表達載體 pETDuet - NC - ND ;之后將該亞硝酸鹽還原酶表達載體轉化到大腸桿菌表達菌株內，獲得亞 硝酸鹽還原酶過表達重組菌株。
[0012] 所述的含有酶切位點的引物包括：
[0013] NC - Nco I - F:ACCATGGTGCCCACGGACACCTCGACCATCGT
[0014] NC - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCGCTGTGCGCTTCCTT
[0015] ND - Nde I - F:GTACATATGACCCTGGCACTCGAGACGACCACC
[0016] ND - EcoR V - R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTTCACCTCGT
[0017] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸lmin ;30個 循環后68°C終延伸5min。
[0018] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0019] 本發明涉及一種亞硝酸鹽還原酶的工程菌的應用，將其用于亞硝酸鹽還原酶的體 外高效表達，并最終實現亞硝酸鹽還原酶的工業發酵生產。 技術效果
[0020] 現有亞硝酸鹽還原酶在灰略紅鏈霉菌內為胞內酶且表達量很低，因此嚴重限制了 其使用范圍和效果；與現有技術相比，本發明提供了一種全新的亞硝酸鹽還原酶基因序列； 在特殊條件下（如高溫以及堿性）具有更穩定的生物學活性；本發明通過構建外源表達載 體，實現了亞硝酸鹽還原酶的體外過表達，并通過在表達重組蛋白C端添加聚組氨酸標簽 的方法，維持蛋白活性的同時也最大程度的保證了蛋白純度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021] 圖1為不同濃度硝酸鹽培養下亞硝酸鹽還原酶表達量變化圖；
[0022] 圖2為亞硝酸鹽還原酶大亞基（C)及小亞基⑶信號肽預測圖；
【具體實施方式】
[0023] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1
[0024] 本實施例中灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)分離自上海市浦江鎮收 集的腐爛秸桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。將該菌種接種于LB液體培養基，32 °C培養48h。
[0025] 上述LB液體培養基組分為：蛋白胨10. 0g/L，酵母提取物5. 0g/L，NaCl 10. 0g/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養基。
[0026] 1)灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組 DNA 提取：收集 2. OmL 菌 液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶（20mg/mL)和20 μ L EDTA 溶液（0·5Μ，ρΗ 8.0)，37°C處理 45min，加入 4yL RNase A(100mg/mL)，震蕩混勻 15s， 室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說明完成剩余操作，得到高純 度基因組DNA。通過0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保無明顯RNA條帶，基 因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0027] 2)灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組測序：確定全基因組 鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術，構建不同插入片段長度的文庫，采用Illumina Mise q(2X250bp)平臺進行測序。收集測序的原始數據，對帶接頭、低質量的數據進行過濾， 隨后采用Newbler v2. 8對去除接頭的測序數據進行從頭拼接，構建contig及scaffold，最 后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因組草圖。
[0028] 3)蛋白編碼基因功能預測：采用Glimmerf. 0軟件對全基因組序列進行基因預測。 基因預測模型選取自我訓練基因預測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作為 基因預測模型訓練的序列。然后以該序列構建的基因預測模型，對所有序列進行基因預測， 設定開放閱讀框的長度為ll〇bp，其余參數為Glimmerf. 0的默認設置。
[0029] 4)序列驗證：根據全基因組測序結果，設計PCR引物如下：
[0030] NC - F:ATGCCCACGGACACCTCGACCAT
[0031] NC - R:TCATCGCTGTGCGCTTCCTTCCA
[0032] ND - F:ATGACCCTGGCACTCGAGACGAC
[0033] ND - R:TCACGCCGCCTTCACCTCGTACG
[0034] 以灰略紅鏈霉菌JSD - 1基因組DNA為模板，進行PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠電 泳檢測，結果表明片段約為2. 6kb及350bp，將PCR產物切膠回收，使用DNA A - Tailing Kit (TaKaRa)加 A后連接到T - Vector PMD?19 - T (TaKaRa)，并將連接產物轉入DH5 α大腸 桿菌，在氨芐（50 μ g/ml)抗性平板上挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。測序結果證實插 入片段與基因組測序結果完全吻合，即為本發明序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2。
[0035] 上述 PCR 反應使用的 DNA 聚合酶為 PrimeSTAR?GXL Polymerase (TaKaRa) ;NC 基 因擴增條件為98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延伸lmin ;30個循環后 68°C終延伸5min。ND基因擴增條件則為98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s， 68°C延伸15s ;30個循環后68°C終延伸3min。
[0036] 5)灰略紅鏈霉菌總RNA的提取：將鏈霉菌接種于以ΚΝ03為唯一碳源的無機鹽培養 基，32°C、150rpm條件下培養72h。每12h取樣，離心收集菌體沉淀，并按細菌總RNA提取試 劑盒要求（TIANGEN)提取高純度的鏈霉菌總RNA。
[0037] 上述無機鹽培養基組分為：葡萄糖 20g/L，ΚΗ2Ρ041· 0g/L，NaClO. 5g/L，MgS040. 25g/ L，CaCl2 · 2H200. lg/L，FeS04 · 7H200. Olg/L 及 KN03(10mM, 30mM, 50mM，lOOmM)。
[0038] 6)灰略紅鏈霉菌亞硝酸鹽還原酶表達水平測定
[0039] 根據亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列，通過DNAMAN6. 0軟件設計特異性PCR引物， 引物序列如下：
[0040] NC - F，：GCGTGGTCGTGCTGTGCGA
[0041] NC - R' ：CGCCAGGTCCGTCAGCGACA
[0042] 同樣的，根據16S rRNA的特異性序列設計引物，并作為內參基因，引物序列如下：
[0043] 16S rRNA - F' :CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0044] 16S rRNA - R' :GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0045] 以鏈霉菌總RNA模板進行反轉錄獲得cDNA文庫，并按照熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)要求進行相關操作。設置三個重復，待實驗完成收集處理數據，分析在不同濃度 ΚΝ03作用下，亞硝酸鹽還原酶的表達量（如圖1)。結果表明，隨著時間的延長和ΚΝ03濃度 的升高，該亞硝酸鹽還原酶的表達量顯著上調，證明該基因參與硝酸鹽的代謝過程。
[0046] 上述的熒光定量PCR反應條件為：95°C預變性30s ;95°C變性10s，60°C退火30s， 72°C延伸15s，共40個循環。
[0047] 7)亞硝酸鹽還原酶膜定位預測：采用SignalP4. 1分別對亞硝酸鹽還原酶大亞基 及小亞基序列進行信號肽模擬預測，如圖2所示。結果表明亞硝酸鹽還原酶大亞基及小亞 基均不存在明顯的信號肽序列，推測該酶為胞內酶。 實施例2
[0048] 亞硝酸鹽還原酶表達載體構建
[0049] 1)根據亞硝酸鹽還原酶序列，設計含有酶切位點的引物，序列如下：
[0050] NC - Nco I - F:ACCATGGTGCCCACGGACACCTCGACCATCGT
[0051] NC - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCGCTGTGCGCTTCCTT
[0052] ND - Nde I - F:GTACATATGACCCTGGCACTCGAGACGACCACC
[0053] ND - EcoR V - R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTTCACCTCGT
[0054] 2)以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含 有Nco I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得亞硝酸鹽還原酶大亞基基因序列，使 用 DNA A-Tailing Kit 加 A 后連接到 T-Vector PMD?19-T(TaKaRa)，并將連接產物轉 入DH5ci大腸桿菌內。挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。若無誤，Nco I和EcoR I進行 雙酶切（37°C)，回收亞硝酸鹽還原酶大亞基DNA片段NC。用相同內切酶酶切共表達載體 pETDuet - 1并回收載體DNA片段。將NC與載體片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連 接（16°C)，將連接產物轉入DH5a大腸桿菌感受態細胞內，通過抗性平板及菌落PCR篩選 含有質粒pETDuet-NC的陽性克隆。挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 μ g/ml)的 LB液體培養基中，180rpm、37°C培養16小時后提取質粒。
[0055] 以含有Nde I和EcoR V酶切位點引物進行PCR擴增獲得亞硝酸鹽還原酶小亞基基 因序列，加 A后連接到T - Vector PMD?19 - T，將連接產物轉入DH5 a大腸桿菌內。挑選陽 性克隆搖菌并回收質粒測序驗證。若無誤，用Nde I和EcoR V雙酶切該質粒，回收亞硝酸鹽 還原酶小亞基DNA片段ND。相同內切酶處理重組表達載體pETDuet -ND并回收載體DNA片 段。將ND與pETDuet-NC載體片段混合，T4DNA Ligase過夜連接，將連接產物轉入DH5a大 腸桿菌感受態細胞內，通過抗性平板和菌落PCR篩選含有重組共表達載體pETDuet -NC -ND 的陽性克隆。挑取陽性克隆，搖菌并提取其質粒即得亞硝酸鹽還原酶表達載體。
[0056] 上述PCR擴增條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸lmin ;30個循環 后68°C終延伸5min。
[0057] 3)亞硝酸鹽還原酶過表達轉基因菌株的構建
[0058] 將上述亞硝酸鹽還原酶表達載體pETDuet - NC - ND轉入Transetta(DE3)大腸桿 菌，并在含有氨芐青霉素（50 μ g/ml)和氯霉素（34 μ g/ml)的LB固體培養基上篩選，獲得 亞硝酸鹽還原酶過表達菌株。
[0059] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對應的tRNA，可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統中的表達水平。
【權利要求】
1. 一種亞硝酸鹽還原酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達亞硝酸鹽還原酶 的大腸桿菌； 所述的胞內亞硝酸鹽還原酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD -1亞硝酸鹽還原酶編碼基因，由亞硝酸鹽還原酶大亞基SG -NC和亞硝酸鹽還原酶小亞 基SG - ND構成，其核苷酸序列分別為2601bp和354bp，分別編碼866和117個氨基酸，其 中：亞硝酸鹽還原酶大亞基SG - NC的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；亞硝酸鹽還原酶小亞基SG-ND的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，氨基酸 序列如SEQ ID No. 4所示。
2. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據權利要求1或2中所述的工程菌的實現方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增依次得到編碼亞硝酸鹽還原酶大 亞基及亞硝酸鹽還原酶小亞基的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列依次連接到共表 達載體pETDuet -1，最終獲得重組共表達載體pETDuet - NC - ND ;之后將該亞硝酸鹽還原酶 表達載體轉化到大腸桿菌表達菌株內，獲得亞硝酸鹽還原酶過表達重組菌株。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點的引物包括： NC - Nco I - F:ACCATGGTGCCCACGGACACCTCGACCATCGT NC - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCGCTGTGCGCTTCCTT ND - Nde I - F:GTACATATGACCCTGGCACTCGAGACGACCACC ND - EcoR V - R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGCGCCGCCTTCACCTCGT。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性 311^11;981：變性1〇8,681：延伸1111丨11;30個循環后681：終延伸511^11。
6. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種根據上述任一權利要求所述的亞硝酸鹽還原酶的工程菌的應用，其特征在于， 將其用于亞硝酸鹽還原酶的體外高效表達，最終實現亞硝酸鹽還原酶的工業發酵生產。
【文檔編號】C12N9/06GK104152393SQ201410374669
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】周培, 馮海瑋, 支月娥, 唐冬, 孫玉靜, 毛亮, 羅艷青, 衛星 申請人:上海交通大學