分枝桿菌分型鑒定熒光pcr反應液及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種分枝桿菌分型鑒定熒光PCR反應液，其含有擴增引物和分子信標探針；其中所述分子信標探針包括兩端分別帶有熒光基團和淬滅基團的12條分枝桿菌的分子信標探針中的至少一種，各序列為SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.12。本發明還公開了一種具有所述PCR反應液的試劑盒。利用本發明，可以快速準確地檢測并鑒別包括結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌在內的12種分枝桿菌。
【專利說明】分枝桿菌分型鑒定熒光PCR反應液及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分枝桿菌分型鑒定熒光PCR反應液及試劑盒。
【背景技術】
[0002]分枝桿菌包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis, MTB)、非結核分枝桿菌(Nontuberculous Mycobacteria, NTM)及麻風分枝桿菌。NTM常存在于自然環境中，迄今為止已發現有150余種，其中約1/3與人類疾病有關。
[0003]我國歷次結核病流行病學資料顯示，NTM分離率從1990年的4.9%升至2000年的
11.1%，2010年為22.9%，這基本反映出我國NTM病呈明顯上升的態勢。
[0004]臨床研究發現，NTM對大多數抗分枝桿菌藥物均耐藥，因此，NTM病的用藥原則與結核病有著明顯的不同，而且不同型別NTM病的用藥種類和病程也可有所不同，所以NTM的分型鑒定就成了治療前的一個非常重要的工作。
[0005]然而，NTM病的病理所見與結核病很難鑒別，傳統臨床只能依靠分枝桿菌的生長特性、色素、生長速度、菌落形態及用生化試驗等參數作出鑒定，這種方法費時、費力，且沒有標準化試劑，缺乏敏感性和特異性，導致很多結果不易判斷。高效液相色譜測定分枝菌酸及氣相色譜測定脂肪酸均存在菌種鑒定的局限性，受菌株的生長環境、營養狀況的影響，并且需要特殊的儀器。
[0006]基因檢測方法可以檢出不同型的NTM，但其中PCR產物直接序列測定和限制性內切酶切圖譜操作復雜，且不適合檢測混合性感染。普通熒光定量PCR只能區分NTM和MTC(結核分枝桿菌)，而不能對NTM進行分型。基因芯片和反向點雜交法可以對NTM進行分型，但這兩種方法均操作較復雜，不適合臨床大規模推廣使用。
【發明內容】
[0007]本發明的主要目的在于提出一種檢測準確、快速、可靠的分枝桿菌分型鑒定熒光PCR反應液及試劑盒。
[0008]一種分枝桿菌分型鑒定熒光PCR反應液，其含有擴增引物和分子信標探針；
[0009]其中所述分子信標探針包括兩端分別帶有熒光基團和淬滅基團的12條分枝桿菌的分子信標探針中的至少一種，其序列為:
[0010]
【權利要求】
1.一種分枝桿菌分型鑒定熒光PCR反應液，其特征在于，其含有擴增引物和分子信標探針； 其中所述分子信標探針包括兩端分別帶有熒光基團和淬滅基團的如下12條分枝桿菌的分子信標探針中的至少一種，所述分子信標探針的序列為:_
其中上述各序列依次對應序列表中的SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.12號序列； 或者，所述分子信標探針的序列為對應于上述各序列的反向互補序列。
2.如權利要求1所述的熒光PCR反應液，其特征在于，所述擴增引物中的下游引物的用量大于上游引物的用量以使PCR產物大部分為負鏈產物，設計成正鏈探針的分子信標探針用于與負鏈產物進行雜交。
3.如權利要求1或2所述的熒光PCR反應液，其特征在于，所述分子信標探針的整體為頸環結構，兩端為與分枝桿菌無關的互補的頸結構，中間為與分枝桿菌特異雜交的環狀結構。
4.如權利要求1至3任一項所述的熒光PCR反應液，其特征在于，12個分子信標探針分成四種熒光標記，相同熒光標記探針的Tm設計成一定的梯度，差異在2°C以上，熔解溫度范圍在60°C~80°C左右。
5.如權利要求1至4任一項所述的熒光PCR反應液，其特征在于，所述熒光基團選自FAM、HEX、TAMRA和CY5，所述淬滅基團為Dabcyl。
6.如權利要求1至5任一項所述的熒光PCR反應液，其特征在于，所述擴增引物的序列為:
其中上述兩序列分別對應序列表中的SEQ ID N0.13~SEQ ID N0.14號序列。
7.—種分枝桿菌分型鑒定熒光PCR反應試劑盒，其特征在于，具有如權利要求1至6任一項所述的熒光PCR反應液。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131100SQ201410375163
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】廖生赟, 張濤, 呂純芳 申請人:深圳市億立方生物技術有限公司