一種虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及涉及一種虎杖毛狀根的誘導及利用生物反應器擴大培養的方法，具體為一種虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法。本發明以虎杖植株野生帶芽莖段為外植體，成功誘導出虎杖組培苗，并建立了虎杖組織培養體系，并成功誘導出虎杖毛狀根體系，且建立了虎杖毛狀根生產白藜蘆醇體系，成功通過氣升式生物反應器使虎杖毛狀根生產白藜蘆醇，并對白藜蘆醇進行了含量測定及提取分離。通過虎杖毛狀根生產白藜蘆醇，與現今生產方式相比，具備在無激素培養基上快速生長的特性。因此該方法操作簡單、成本較低、不受氣候、土地等自然條件的限制等優點，為今后進行工業化生產提供了可靠地來源和物質基礎。
【專利說明】一種虎杖毛狀根生產白黎蘆醇及擴大培養的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及涉及一種虎杖毛狀根的誘導及利用生物反應器擴 大培養的方法，具體為一種虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法。
【背景技術】
[0002] 白藜蘆醇（Resveratrol, 3,4 ' ，5-trihydroxy-trans-stilbene)即反式 3, 4'，5-三羥基芪，為二苯乙烯類化合物，以游離態和糖苷結合態兩種形式存在于虎杖、 葡萄、花生等多種植物中，其中以虎杖中含量最為豐富。是一種重要的植物抗毒素。白藜蘆 醇具有多種藥理活性，如抗菌、抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗艾滋病毒活性等，能修復非 典型肺炎方劑所致的細胞DNA損傷，尤其對人類健康的大敵一腫瘤和心臟病的治療和預防 有明顯的作用。
[0003] 虎杖為寥科虎杖屬多年生草本植物，是我國傳統中藥材，廣泛分布于華東、中南 及陜西、甘肅、四川等地，虎杖提取物具有抗炎、預防心血管疾病等多種藥理活性，主要活 性成分為白藜蘆醇和大黃素。據統計,虎杖再生量為9. 8*106kg/年，其可持續采挖量為 4. 95*106kg/年，市場需求量為6. 0*106kg/年。因此，虎杖的野生資源已面臨過度采挖的局 面。而據統計提取1噸白藜蘆醇需要消耗500噸虎杖原料，但白藜蘆醇在植物體內含量普 遍較低。
[0004] 為解決藥用植物的供需矛盾，人們多采用人工栽培的方法擴大藥源。但在人工栽 培的藥用植物中，一些藥用植物生產周期很長，若以常規方法育種或育苗，需要花費較長時 間。還有一些藥用植物因繁殖系數小、耗種量大，導致發展速度很慢且生產成本增加。另外 一些藥用植物，則因病毒危害導致退化，嚴重影響了產量和品質。為保證藥用植物資源的可 持續利用，利用生物工程的途徑對珍貴資源進行細胞或組織培養、有效成分的關鍵基因克 隆與轉化等技術，可能是解決中藥產業化的有效途徑。于是，積極研究藥用植物資源的再生 技術，使有限的資源為人類持續利用迫在眉睫。而毛狀根技術具有生長快速、不需外援植物 激素、合成次生代謝物能力強而穩定、不受季節和時間限制等優點。而Ri質粒轉化的毛狀 根生長快，易于培養，有效成分高，具有表達完整的代謝通路，為藥用植物代謝產物的工業 化生產提供了廣闊前景。
[0005] 目前據報道虎杖已成功誘導毛狀根，李卓璽等誘導虎杖毛狀根中白藜蘆醇的含量 為8. 21mg/kg ;于樹宏等探討影響虎杖毛狀根高頻誘導的因素，結果表明成熟葉片是轉化 率較高的外植體，感染IOd左右可形成毛狀根，平均誘導率為55. 66%，誘根密度為4. 30 ; 而苗曉燕等對虎杖毛狀根DNA提取方法進行了研究，結果表明改良CTAB法解決了虎杖富含 多酚、多糖等類物質難以提取高質量DNA的問題，提取的DNA質量較好，純度較高。而于樹 宏等為虎杖毛狀根制備虎杖苷進一步申請了專利，專利號為200510012809. 7,但目前只是 停留在實驗階段，還未有進一步進行產業化方面的研究。目前，利用虎杖毛狀根生產白藜蘆 醇已有報道，但利用生物反應器進行虎杖毛狀根生產白藜蘆醇產業化方面還未見報道。因 此，利用虎杖毛狀根生產白藜蘆醇，特別是通過生物反應器進行產業化，對解決藥用植物次 生代謝產物白藜蘆醇的工業化生產提供了的一條有效途徑，對解決虎杖資源現狀具有重要 意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，并通過 虎杖組織培養技術、毛狀根培養技術及生物反應器來大量生產白藜蘆醇，從而替代野生資 源，為白藜蘆醇的生產提供一條有效的新途徑。
[0007] 為了實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案：
[0008] -種虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，該方法包括以下步驟：
[0009] (1)外植體1的消毒
[0010] 取野外虎杖帶芽莖段自來水流水沖洗3h，在超凈工作臺中酒精浸泡60s，無菌水 沖洗3-5遍，0. 1 %升萊浸泡5-8min (根據材料老嫩程度而定），無菌水沖5-6遍，用滅菌過 的濾紙吸干水分，備用。
[0011] (2)虎杖組培苗的誘導與繼代培養
[0012] 將步驟（1)中所選用外植體1切成I. 5cm帶芽莖段接種于MS+6-BA2. 5mg/ L+NAAO. 5mg/L，帶長至 30d 后繼續繼代培養，選用 MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/ L+TDZO. 05mg/L，培養條件：溫度25±2 °C，采用日光燈，光照1500-20001ux，光照時間 14-16h。每25-30天繼代一次，繼代2- 3次后待長出健壯、發育良好的完整虎杖組培苗備 用。
[0013] ⑶虎杖毛狀根的誘導
[0014] 1)預培養
[0015] 將步驟⑵中獲得的組培苗葉片（帶葉柄，I. 0cm*l. Ocm)或莖（I. 5cm)，轉接至MS 空白培養基中暗培養2天，培養溫度25 ± 2°C。
[0016] 2)發根農桿菌的活化
[0017] 將發根農桿菌ATCC15834(由廣東省林業科學研究院生物技術研究所饋贈）在YEB 固體培養基中活化，挑取單個菌落接種于YEB液體培養基中，在28°C，120r ^mirT1和黑暗條 件下振蕩培養20h，使其達到生長對數期，以感染虎杖外植體2,測定其OD值為0. 2-0. 5。
[0018] 3)侵染與共培養
[0019] 將經過預培養的外植體2(葉片或莖）轉移至已活化好的農桿菌菌懸液中，浸染 lOmin。然后用無菌濾紙吸取外植體2表面多余的菌液，將其接種于MS空白培養基+乙酰 丁香酮（AS) 20-50mg/L，于25°C黑暗條件下共培養2d。
[0020] 4)除菌及優化培養
[0021] 將步驟3)中共培養2天的外植體2開始除菌，用無菌水沖洗3次，轉移至MS+頭 孢噻]3虧鈉（cefotaxime)500mg/L培養基中（即除菌培養基），25°C，14h · (Γ1散射光下進行 除菌培養。每5d轉接一次，反復繼代除菌，直到培養基無菌斑出現。將誘導出的虎杖毛狀 根繼續在1/2MS空白液體培養基中繼續繼代增值2-3次。
[0022] (4)虎杖毛狀根PCR檢測
[0023] 將步驟4)中獲得的虎杖毛狀根進行DNA提取，獲得含有RolB和tms基因反應體 系，獲得的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測。RolB的擴增條帶大小為422bp，tms的 大小為910bp。
[0024] (5)虎杖毛狀根的根系優選及生物反應器的擴大培養
[0025] 將經PCR檢測出的毛狀根，且挑選除菌徹底，分枝多，生長快的毛狀根剪成長 l-3cm，在IL氣升式生物反應器中加入1/2MS空白液體培養基加入3%蔗糖、酸水解酪蛋白 〇-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、L-苯丙氨酸0-50mg/L，接種量為濕重的30g毛狀根，要求全 部無菌，PH5. 8 - 6. 5,溫度：25±2°C，暗培養，通氣量為0. 05vvm，當毛狀根生長達到對數期 時,稱取濕重、干重。
[0026] (6)虎杖毛狀根中白藜蘆醇HPLC的含量測定
[0027] 將經HPLC含量檢測虎杖毛狀根中白藜蘆醇的含量表明，虎杖毛狀根中白藜蘆醇 的含量為210-280 μ g/g，白藜蘆醇苷為1500-2340 μ g/g。
[0028] (7)白藜蘆醇的提取分離純化
[0029] 將步驟（5)中虎杖毛狀根干燥，粉碎，加蒸餾水（pH = 10)攪拌、過濾，將濾渣再次 浸提，過濾，合并濾液，調PH為弱酸性。將粗品用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮后進行硅膠柱 層析。將含有白藜蘆醇的層析產物用適量乙醇反復結晶后，50°C真空干燥。密封于瓶中，避 光保存。
[0030] 本發明中所述培養基及專業術語：
[0031] (I)MS基本培養基為（單位為mg/L) :MS (Murashige and Skoog，1962)包括大量元 素（硝酸銨1650,硝酸鉀1900,二水氯化鈣440,七水硫酸鎂370,磷酸二氫170)可配成20 倍母液，取母液50ml/L ;微量元素（一水硫酸錳22. 3,七水硫酸鋅8. 6,六水氯化鈷0. 025， 無水硫酸銅0. 025,硼酸6. 2,二水鑰酸鈉0. 25,碘化鉀0. 83)配成母液200倍，取母液5ml/ L ;鐵鹽（七水硫酸亞鐵28. 7,乙二胺四乙酸二鈉37. 3)配成母液200倍，取母液5ml/L ;有 機（煙酸0.5,煙酸吡哆醇0.5,鹽酸硫胺素0. 1，甘氨酸2.0)配成母液200倍，取母液5ml/ L，另加肌醇0. lg，蔗糖30g，固體培養基加瓊脂粉6. 5g，本發明中1/2MS液體培養基是大量 元素減半，但硝酸銨含量不變，其余不變，PH5. 8-6. 5。
[0032] (2) YEB培養基配方（單位為g/L):牛肉浸膏5.0、酵母浸膏1.0、蛋白胨5.0、蔗糖 5. 0、七水硫酸鎂0. 5、固體培養基加瓊脂粉8g，PH7. 0。
[0033] (3)抗生素為頭孢噻廂鈉濃度（Cefotaxime),卡那霉素（kan)，羧節西林鈉 Cb (Carbenicillin)
[0034] (4)本發明中所述激素為6-BA (6-芐基氨基腺嘌呤），NAA (萘乙酸），TDZ (噻苯 隆）
[0035] (5)本發明中所述外植體1為野生虎杖帶芽莖段。
[0036] (6)本發明中所述外植體2為虎杖組培苗中剪切的葉片或莖。
[0037] (5)本發明中所述的干重是指虎杖毛狀根于干燥箱中70°C干燥至恒重。
[0038] (6)本發明中所述的濕重是指取毛狀根培養物，用濾紙吸取毛狀根表面多余水分 吸干，稱得濕重。
[0039] (7)本發明中所述3%蔗糖是指IL培養基中添加30g蔗糖。
[0040] (8)本發明中所述的毛狀根誘導率
[0041] 毛狀根誘導率=產生毛狀根外植體2數/總外植體2數X 100%。
[0042] (9)虎杖外植體1增殖倍數的測定方法
[0043] 增殖倍數=(收獲時的重量-接種量）/接種量
[0044] 增長率=(最終收獲干重-接種干重）/接種干重
[0045] (10)本發明中所述的白藜蘆醇產量測定方法
[0046] 白藜蘆醇產量=收獲干重*白藜蘆醇含量
[0047] 本發明中所述生物反應器為IL氣升式內環流發酵罐（南京天匯AIF-S-XX)，利用 通入反應器的無菌空氣形成的上升流進行供氧和攪拌，通過對各參數的控制，來達到穩定 高產，降低虎杖原材料消耗等，各參數包括：溫度、PH值、空氣流量、攪拌轉速、溶氧速度、泡 沫高度、壓強等。通過對這些實驗數據的設計，為后續放大培養虎杖毛狀根的生產提供了重 要參考依據。
[0048] 基本操作條件：將發酵罐連接好進行滅菌后，于超凈工作臺中進行逐層均勻接種， 反應器中培養液的體積為1L，接種量為濕重的30g，接種后發酵罐放入恒溫培養室中進行 暗培養，pH值為5. 8-6. 0,溫度為25±2°C，通氣量為0. 05vvm。在培養過程中，根據蒸發的 水量通過蠕動泵進行定時補水，保持總體積不變。
[0049] 本發明的積極效果體現在：
[0050] (1)在本發明中，通過生物反應器的大規模生產，使虎杖生產白藜蘆醇產業化提供 了一條有效途徑，具有極大的適用性。
[0051 ] (2)本發明是在實驗室條件下進行的，通過毛狀根大量生產白藜蘆醇，與野生和栽 培虎杖相比，可獲得穩定的質量和產量，不受自然條件和時間的限制，不占用耕地面積，這 樣節約了大量時間，人力。
[0052] (3)通過生物反應器中添加誘導子、前體物等，極大的提高了虎杖毛狀根次生代 謝產物生物量，提高了白藜蘆醇及其苷的含量。在本發明中，毛狀根的產量可達到干重 15. 32- 21. 65g/L/周期（30-40天），其中白藜蘆醇最高產量可達269. 48 μ g/g，白藜蘆醇 及其苷的產量可達210-280 μ g/g和1500-2340 μ g/g，其毛狀根增值率可達40-60倍。是 相同條件下普通毛狀根的3-4倍，自然根的10倍。
[0053] (4)通過人工調控優化培養條件，可提高毛狀根的生長和次生代謝產物的合成，極 大提高了白藜蘆醇的產量。
[0054] (5)本發明中培養毛狀根培養基不要添加任何激素，暗培養。因此可以大大降低生 產成本，提高了生產效率。
[0055] (6)虎杖毛狀根生產周期一般為30天到40天，比野外生長時間（虎杖一般生長周 期為3-5年）要短很多。這樣節約了時間，節約了虎杖野生資源，對環境保護也起到了一定 的作用。
[0056] (7)本發明工藝操作簡單，重復性好，規模化生產迅速方便。
【具體實施方式】
[0057] 下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發 明上述主題的范圍僅限于下述實施例，凡基于本
【發明內容】
所實現的技術均屬于本發明的范 圍。實施例中所用虎杖植株來自于四川省涼山州甘洛縣。
[0058] 實施例1 :
[0059] (1)外植體1消毒
[0060] 選取虎杖幼嫩莖段作為外植體1，進行消毒處理，步驟如下：帶芽莖段自來水流水 沖洗3h，在超凈工作臺中酒精浸泡60s，無菌水沖洗5遍，0. 1 %升汞浸泡5-8min，無菌水沖 6遍，用滅菌過的濾紙吸干水分，備用。
[0061] (2)芽的誘導及繼代增值
[0062] 將步驟（1)中已滅好菌的外植體1轉接至芽誘導培養基：MS固體基本培養基 +6-BA2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L中，7d后開始長出芽點，30d后長成完整植株。繼續 繼代培養，繼代培養基：MS固體基本培養基+6-BA2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+TDZ0. 05mg/L+蔗糖 30g/L，待長至發育良好的完整虎杖組培苗后，備用。生長條件：溫度25 ± 2°C，采用日光燈， 光照 1500-20001ux，光照時間 14-16h。
[0063] (3)虎杖毛狀根的誘導
[0064] 取步驟（2)所用虎杖組培苗葉片（帶葉柄部分），轉接至MS空白培養基中暗培養 2天，培養溫度25±2°C。
[0065] (4)菌種的活化
[0066] 挑取保存在4°C YEB固體平板培養基上的發根農桿菌ATCC15834,挑取單個菌落于 YEB液體培養基中，在28°C，120r ^mirT1和黑暗條件下振蕩培養20h，使其達到生長對數期， 以感染虎杖葉片。測定其OD值為0.4。
[0067] (5)侵染與共培養
[0068] 將步驟（3)中經過共培養的葉片用無菌解剖刀小心劃傷葉片表面 (1.0cm*1.0cm)，然后轉移至步驟（4)已活化好的菌種菌懸液中，侵染IOmin,然后用無菌濾 紙吸取外植體2表面多余的菌液，將其接種于MS空白培養基+AS20mg/L，于25°C黑暗條件 下共培養2d。
[0069] (6)除菌及優化培養
[0070] 將步驟（5)中經過共培養的虎杖葉片，用無菌水沖洗3次，轉移至除菌培養基MS 固體基本培養基+cef500mg/L中，25°C，14h · Cf1散射光下進行除菌培養。每5d轉接一次， 反復繼代除菌，直到培養基無菌斑出現。除菌5天后開始長出毛狀根，20d后開始長出大量 毛狀根。將誘導出的至除菌完全后虎杖毛狀根繼續在1/2MS空白液體培養基中繼續繼代增 值2-3次。毛狀根生長特點：根細長，多分支，無向地性，輻射狀。
[0071] (7)虎杖毛狀根的PCR檢測
[0072] 將步驟（6)中獲得的虎杖毛狀根和葉片（對照），0. 2g，加入液氮迅速研磨成粉末， 轉入到已加入800 μ 165°C預熱的CTAB提取液和10 μ 1巰基乙醇的4ml離心管中，用力混 勻。離心管在65°C水浴下溫浴lh，其間每隔10分鐘輕輕倒轉混勻，每次持續Imin左右。加 入等體積氯仿/異戊醇為24:1的混合液，輕輕顛倒混勻lOmin。在室溫下，lOOOOr/min離 心lOmin，移上清液到新管中。加入等體積的異丙醇，出現絮狀沉淀。顛倒搖勻，使絮狀沉淀 聚集，并5000rpm離心5min收集沉淀。沉淀加入200 μ 1的無水乙醇潤洗兩次，5000rpm離 心5min倒出無水乙醇，放置幾分鐘，待乙醇揮發盡后，加入TE溶液100 μ 1溶解DNA。
[0073] 毛狀根rolB基因的PeR檢測，Ri質粒rolB基因的PeR引物由上海生工合成，上游 引物：5' GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3' ；下游引物P25' -GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3'， 在25yllPCR反應液中，Golden Easy PCR system(天根生化）12·5μ1，上、下引物各 1 μ 1 (終濃度20pmol/L)，模板DNA2 μ 1，用超純水補足25 μ 1。94°C預變性5min，94°C變性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 2min，35 個循環。
[0074] 擴增產物在I. 7%瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測進行分析，結果表明：PCR反應可 以從虎杖毛狀根中擴增到預期的422bp和910bp左右的特異性片段，表明ATCC15834中 的rolB基因和tms基因的Ri TL-DNA和TR-DNA部分已整合到虎杖毛狀根中。而未經 ATCC15834浸染的葉片未檢測到特異性片段。
[0075] (8)虎杖毛狀根的根系優選及生物反應器的擴大培養
[0076] 將經過步驟（7)檢測過毛狀根，且挑選除菌徹底，分枝多，生長快的毛狀根剪成長 1- 3cm，在IL氣升式發酵罐中加入1/2MS空白液體培養基+3 %蔗糖+酸水解酪蛋白lg/L+黑 曲霉10mg/L+L-苯丙氨酸15mg/L+NH4N038 2 5mg/L，接種量為濕重的30g，整個過程在超凈工 作臺中進行，要求全部無菌，pH值為5. 8-6. 5,溫度為25±2°C，暗培養，通氣量為0. 05vvm。 在培養過程中，根據蒸發的水量通過蠕動泵進行定時補水，保持總體積不變。
[0077] 實施例2 :
[0078] (1)同實施例 1(1)
[0079] (2)芽的誘導及繼代增值
[0080] 將步驟⑴中已滅好菌的莖段轉接至芽誘導培養基：MS固體基本培養基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L中，7d后開始長出芽點，30d后長成完整植株。繼續 繼代培養，繼代培養基=MS固體基本培養基+6-BAO. 5mg/L+IAA0. 5mg/L+TDZ0. 05mg/L+蔗糖 30g/L，待長至發育良好的完整虎杖組培苗后，備用。生長條件：溫度25 ± 2°C，采用日光燈， 光照 1500-20001ux，光照時間 14-16h。
[0081] (3)虎杖毛狀根的誘導
[0082] 取步驟⑵所用虎杖組培苗莖，轉接至MS空白培養基中暗培養2天，培養溫度 25±2°C。
[0083] (4)同實施例 1(4)
[0084] (5)侵染與共培養
[0085] 將步驟（3)中經過共培養的莖用無菌解剖刀劃傷莖段（L 0cm*L Ocm)，然后轉移 至步驟（4)已活化好的菌種菌懸液中，侵染lOmin，然后用無菌濾紙吸取莖表面多余的菌 液，將其接種于MS空白培養基+AS20mg/L，于25°C黑暗條件下共培養2d。
[0086] (6)除菌及優化培養
[0087] 將步驟（5)中經過共培養的虎杖莖，用無菌水沖洗3次，轉移至除菌培養基MS固 體基本培養基+kan500mg/L中，25°C，14h · (Γ1散射光下進行除菌培養。每5d轉接一次，反 復繼代除菌，直到培養基無菌斑出現。除菌5天后開始長出毛狀根，20d后開始長出大量毛 狀根。將誘導出的至除菌完全后虎杖毛狀根繼續在1/2MS空白液體培養基中繼續繼代增值 2- 3次。毛狀根生長特點：根細長，多分支，無向地性，輻射狀。
[0088] (7)同實施例 1(7)
[0089] (8)虎杖毛狀根的根系優選及生物反應器的擴大培養
[0090] 將經過步驟（7)檢測過毛狀根，且挑選除菌徹底，分枝多，生長快的毛狀根剪成長 l-3cm，在IL氣升式發酵罐中加入1/2MS空白液體培養基+3%蔗糖+酸水解酪蛋白3g/L+ 黑曲霉30mg/L+NH4N038 2 5mg/L，接種量為30g (濕重），整個過程在超凈工作臺中進行，要求 全部無菌，pH值為5.8-6.，溫度為25±2°C，暗培養，通氣量為0.05vvm。在培養過程中，根 據蒸發的水量通過蠕動泵進行定時補水，保持總體積不變。
[0091] 實施例3:
[0092] (1)同實施例 1(1)
[0093] (2)芽的誘導及繼代增值
[0094] 將步驟⑴中已滅好菌的+轉接至芽誘導培養基：MS固體基本培養基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L中，7d后開始出現芽點，30d后長成完整植株。繼 續繼代培養，繼代培養基=MS固體基本培養基+6-BA2. Omg/L+NAAO. 5mg/L+蔗糖30g/L， 待長至發育良好的完整虎杖組培苗后，備用。生長條件：溫度25±2°C，采用日光燈，光照 1500-20001ux，光照時間 14-16h。
[0095] (3) (4) (5)同實施例 1 步驟（3) (4) (5)
[0096] (6)除菌及優化培養
[0097] 將步驟（5)中經過共培養的虎杖組培苗葉片，用無菌水沖洗3次，轉移至除菌培養 基MS固體基本培養基+cb300mg/L中，25°C，14h · Cf1散射光下進行除菌培養。每5d轉接 一次，反復繼代除菌，直到培養基無菌斑出現。除菌5天后開始長出毛狀根，20d后開始長出 大量毛狀根。將除菌完全的虎杖毛狀根繼續在1/2MS空白液體培養基中繼續繼代增值2-3 次。毛狀根生長特點：根細長，多分支，無向地性，輻射狀。
[0098] (7)同實施例1中的步驟（7)
[0099] (8)虎杖毛狀根的根系優選及生物反應器的擴大培養
[0100] 將經過步驟（7)檢測過毛狀根，且挑選除菌徹底，分枝多，生長快的毛狀根剪成長 l-3cm，在IL氣升式發酵罐中加入1/2MS空白液體培養基+3%蔗糖+酸水解酪蛋白lg/L+ 黑曲霉30mg/L-苯丙氨酸15mg/L+NH 4N03825mg/L，接種量為30g (濕重），整個過程在超凈工 作臺中進行，要求全部無菌，PH5. 8 - 6. 5,溫度：25±2°C，暗培養，通氣量為0. 05vvm。在培 養過程中，根據蒸發的水量通過蠕動泵進行定時補水，保持總體積不變。
[0101] 實施例4
[0102] 虎杖毛狀根中白藜蘆醇含量測定（HPLC測定）
[0103] (1)標準曲線的繪制
[0104] 分別稱取白藜蘆醇及其苷2. 5mg(對照品來自北京世紀奧科生物技術有限公司， 含量98%以上），置于25ml容量瓶中，甲醇溶液溶解，配制成含白藜蘆醇及其苷0. 10mg/ml 對照品溶液，分別精密吸取對照品溶液I. 〇、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0ml，置于IOml容量瓶中，甲醇 稀釋至刻度，制成不同溶度的對照品溶液。
[0105] (2)供試品溶液的制備
[0106] 取實施例1-3中任意一項實施例中得到的毛狀根，于電熱鼓風干燥箱中70°C烘 干，研成粉末，取毛狀根粉末〇. lg，精密稱定，精密加入稀乙醇25ml，稱定重量，加熱回流 30min，冷卻至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續濾 液，即得。
[0107] (3)色譜條件
[0108] 色譜柱：日本島津CLC-ODS柱（150mm*6mm，i. d. 5 μ m);流動相為乙腈：水= 41:59，流速：1.01111/1^11，柱溫 ：301：;進樣量：1(^1^，檢測波長：30311111。理論塔板數不低于 3000,分離度大于1. 5。分別以以上不同溶度的溶液，每次進樣量10 μ L，按照上述色譜條件 測定各峰面積。分別以峰面積和含量進行線性回歸。峰面積積分值Y為縱坐標，對照品進 樣量X為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸。
[0109] (4)測定法
[0110] 分別緊密吸取吸取對照品溶液和供試品溶液各1〇μ 1，注入HPLC中，測定，即 得。根據檢測結果獲得虎杖毛狀根中白藜蘆醇含量為210-280μ g/g，白藜蘆醇苷為 1500-2340 μ g/g〇
[0111] 實施例5
[0112] 白藜蘆醇的提取分離純化：
[0113] 將實施例1-3中任意一項實施例步驟（8)中虎杖毛狀根干燥，并粉碎至一定粒度， 并加入事先調節pH值=10的堿性水溶液，勻速攪拌并加熱煮沸lh，趁熱過濾；以相同的方 法再提取一次。并用lmol/LHCL將濾液調節PH = 3,靜置。待濾液PH無變化，則白藜蘆醇 沉淀完全，將沉淀離心分離，真空干燥。
[0114] 將上述粗品溶解后以乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮后，以一定目數的硅膠扮樣，上 柱，進行硅膠柱層析，以體積比為2:1的乙酸乙酯-石油醚等度洗脫，定量接收洗脫液，并用 紫外分光光度計于307nm監測其吸光值，以TLC跟蹤檢測（展開劑為氯仿：乙酸乙酯：甲酸 =5:4:1)，待洗脫完全，合并相同洗脫液，真空旋干，即得純度較高的白藜蘆醇產品。
[0115] 對比例1 :
[0116] 虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法步驟同實施例1中的步驟及培養條 件，僅改變外植體2,測定外植體2對虎杖毛狀根誘導的影響，影響結果見下表：
[0117]
【權利要求】
1. 一種虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在于該方法包括以下步 驟： (1) 植物材料的選取與處理 選取野生虎杖帶芽莖段切成2-4cm的小段為外植體1，并對其進行消毒處理； (2) 植物組培苗的誘導 將步驟（1)中外植體1接種于誘導培養基上，在溫度為25±2°C，光照強度 1500-20001ux，光照時間14-16h，在25天后，將其虎杖誘導芽進行繼代培養； (3) 組培苗繼代培養 將步驟（2)中獲得的誘導芽接種于繼代培養基中，繼續繼代培養，培養條件同步驟（2); 待葉片完全張開，長至成熟組培苗后用于虎杖毛狀根的培養； (4) 虎杖毛狀根的誘導及繼代培養 將步驟（3)中獲得的成熟組培苗葉片或莖作為外植體2用于虎杖毛狀根誘導；具體步 驟如下： a、 外植體2的預培養：將葉片或莖在MS空白培養基中暗培養兩天； b、 菌種活化：發根農桿菌在YEB培養基中活化； c、 共培養：將活化后的發根農桿菌與虎杖葉片、莖侵染10_30min后，放置MS空白培養 基中暗培養兩天； d、 除菌培養：將共培養后的葉片或莖在含有頭孢噻肟鈉或卡那霉素或羧芐西林鈉的 MS空白培養基中除菌培養，直到除菌完全； 培養條件：溫度為25±2°C，暗培養，每3-6天除菌一次，直到除菌完全； e、 繼代培養：將除菌完全長出毛狀根0. 1-0. 5g接種于1/2MS空白液體培養基中進行繼 代培養2-5次，每20天繼代培養一次，均在25 ±2°C的條件下培養； (5) 虎杖毛狀根PCR檢測 DNA提取：提取虎杖毛狀根DNA ; PCR體系：獲得含有rolB和tms引物的PCR體系； 采用瓊脂糖凝膠電泳獲得目標條帶； (6) 生物反應器大規模培養虎杖毛狀根 在1L氣升式內環流發酵罐中加入1/2MS空白液體培養基，另加入3%蔗糖、酸水解酪蛋 白0-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、L-苯丙氨酸0-50mg/L，接種量為濕重的30g毛狀根，要求 全部無菌，口11值為5.8-6.5，溫度：25±21：，暗培養，通氣量為0.05^111條件下進行培養， 在培養過程中，根據蒸發的水量通過蠕動泵進行定時補水，保持總體積不變； (7) 虎杖毛狀根的提取分離； (8) 采用HPLC測定虎杖毛狀根中白藜蘆醇的含量。
2. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：步驟（1)中所述外植體1為野生虎杖帶芽莖段，步驟（4)中所述外植體2為虎杖組培苗 中剪切的葉片或莖。
3. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：步驟（2)和步驟（3)中虎杖外植體1誘導芽培養基均為MS+6-BA2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L， 繼代培養基為 MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/L+TDZ0. 05mg/L，pH 值為 5. 8-6. 0。
4. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：步驟（4)要求外植體2葉片大小為1. Ocm*l. Ocm，莖長為1. 5cm。
5. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：所述的步驟（4)中發根農桿菌為ATCC15834。
6. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：所述的步驟（4)中頭孢噻肟鈉濃度為10-500mg/L，卡那霉素10-300mg/L，羧芐西林鈉 10-300mg/L〇
7. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：所述的步驟（4)中將侵染發根農桿菌的外植體2放入除菌培養基中，溫度為25±2°C，暗 培養，每3-6天除菌一次，直到除菌完全。
8. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：所述的步驟（4)中將進行除菌處理后的毛狀根繼代培養室在溫度為25±2°C，暗培養中 振蕩培養，所用培養基為1/2MS空白培養基，無任何激素，搖床轉速為120r/min。
9. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：所述的步驟（5)中虎杖毛狀根中整合了來自于Ri質粒的誘導毛狀根的基因rolB和 tms〇
10. 根據權利要求1中所述的虎杖毛狀根生產白藜蘆醇及擴大培養的方法，其特征在 于：步驟（6)中加入質量百分含量為3%蔗糖、酸水解酪蛋白0-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、 L_苯丙氨酸0-50mg/L，提高白藜蘆醇及其苷的生物量；步驟（6)中所述的生物反應器為1L 氣升式內環流發酵罐。
【文檔編號】C12P7/22GK104372034SQ201410443907
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】洪漢君, 熊小燦 申請人:成都市三禾田生物技術有限公司