Nk細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時誘導擴增Vα24+iNKT細胞和CD3-CD56+NK細胞的方法，步驟如下：外周血分離PBMC，用含自體血漿的無血清培養基將PBMC濃度調整為2×106/ml，加入Anti-CD16抗體、-GalCer、IL-2、IL-18、IL-21后轉入培養瓶中培養，24小時后往細胞懸液加入Anti-CD3抗體，根據細胞的生長情況，每隔2天補充IL-2、IL-18、IL-21的無血清培養基，將細胞濃度控制在1.5×106/ml，持續培養14～21天后，即可同時獲得大量較高純度的Vα24+iNKT細胞和CD3-CD56+NK細胞，細胞數量能達到臨床用于腫瘤過繼性細胞免疫治療所需細胞數量的有效值。本發明簡便、有效。
【專利說明】同時誘導擴增V a 24+ i NKT細胞和CD3^56+NK細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫細胞體外培養領域，涉及一種由人外周血單個核細胞（PBMC)同 時誘導擴增V a M+iNKT細胞和CD3XD56+NK細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是嚴重威脅我國人民健康的重大疾病。治療惡性腫瘤的傳統手段包括手 術治療、放射治療（簡稱放療）和化學治療（簡稱化療）。H種療法各有局限性：手術治療 不能清除腫瘤的微轉移灶，難W取得根治性療效；放療具有劑量依賴性毒性、無法有效清除 潛在的轉移灶，另外，部分病人因為產生放射抵抗而對放療不敏感，化療易引起全身免疫抑 巧||，并且部分病人因化療藥物無法有效進入腫瘤組織或病人對化療藥物產生耐藥性而影響 療效。目前認為，惡性腫瘤治療失敗的H個主要原因是：局部治療不徹底，腫瘤出現遠處轉 移W及腫瘤病人免疫系統受到抑制因而無法有效識別和清除殘存的腫瘤細胞。由此可見， 臨床腫瘤治療迫切需要引入新型的治療方法。隨著對免疫學和腫瘤學研究的不斷深入，人 們深刻地認識到腫瘤的發生和發展與人體的免疫功能密切相關，從而在手術、放療、化療治 療惡性腫瘤之后提出了過繼性細胞免疫治療（Adoptive cellular immunotherapy，ACI)的 概念。
[0003] 過繼性細胞免疫治療是將患者自體或異體淋己細胞在體外用多種細胞因子培養 激活或進行基因改造并擴增后產生的一群具有抗腫瘤活性的免疫細胞，回輸到患者體內， 直接殺傷腫瘤細胞或增強患者自身免疫功能，從而發揮抗腫瘤作用的一種治療方法。該 療法的優勢在于清除手術、放療、化療后的殘留病灶；減低復發或播散的可能性W提高治 愈率；增強病人的免疫機能來提高治愈率；改善病人的生活質量。因其近乎為零的毒副作 用，被冠W "綠色療法"的美譽，現已成為繼"手術、放療、化療"H大傳統治療后的"第四大 療法"。目前用于過繼性細胞免疫治療的主要有：淋己因子激活的殺傷細胞QymPhokine activated killer, LAK)、腫瘤浸潤淋己細胞（tumor infiltrating Iympho巧tes, TIL)、細 胞因子誘導的殺傷細胞（c}ftokine induced killer cell,CIK)和自然殺傷細胞（natural killer cell,NK)、iNKT 細胞（invariant 化Uiral Killer T cells, iNKT)等，W其殺傷腫 瘤細胞活性高、殺傷譜廣等優點，在腫瘤的綜合治療中顯示出重要的臨床應用價值。
[0004] 自然殺傷細胞（natural killer cell, NK)和 iNKT 細胞（invariant 化1:腳31 Killer T cells, iNKT)是天然免疫系統的重要組成成員。其中NK細胞主要分布于外周血 中，約占外周血淋己細胞比例的5 % -10 %，參與機體抗感染、防止細胞惡變及調節免疫等 作化在抗腫瘤作用中其識別、殺傷祀細胞的方式不同于T淋己細胞，為"非MHC限制性"，無 需腫瘤特異性抗原預先識別即可直接殺傷腫瘤細胞，有效識別并清除帶有MHC-I類分子缺 陷的細胞或腫瘤細胞，抑制腫瘤免疫逃逸效應；在清除腫瘤細胞的過程中，NK細胞還會表 達多種可與MHC或非MHC配體結合的受體，通過傳遞抑制或活化信號而調節NK細胞活性， 同時產生大量與殺傷相關的細胞因子，從而發揮免疫調節作用。而iNKT細胞，是一群介于 NK細胞和T細胞間的細胞，細胞表面既表達T細胞受體TCR，也表達NK細胞受體。該種細 胞有嚴格的CDld限制性，且具有大量釋放IL-4和IFN-的能力，iNKT細胞不僅其本身具有 抗腫瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且還能刺激T、NK等免疫細胞的活性，增 強其細胞毒效應。臨床數據顯示誘導擴增出的NK細胞、iNKT細胞過繼免疫治療惡性腫瘤 具有良好的應用前景，對肺癌、肝癌、卵巢癌、食道癌、結腸癌、胃癌、宮頸癌、骨癌等均有一 定效果。
[0005] 在免疫細胞療法中主要W培養單一類型的細胞為主，對于同時培養多種類型的免 疫細胞，由于適用于每一類型細胞的培養條件相互間不相同，不得不分別對多種細胞類型 同時平行地實施培養步驟，從而造成采血量大，操作復雜，成本較高等問題。為了解決現有 技術中單一免疫細胞進行過繼性細胞免疫治療殺瘤活性低的問題，進一步提高免疫細胞治 療的效果，需要聯合應用2種或2種W上免疫細胞進行治療，本發明可W很好的實現該個目 的。
【發明內容】
[0006] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種新的兩種免疫細胞同時體外擴增的方法，該方法能夠在一個培養系統中，在 體外培養條件下，同時獲得大量應用安全、純度較高、活性強的V a M+iNKT細胞和CD3-CD56^NK 細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應用于臨床的質量。
[0007] 根據本發明的一個方面，本發明提供一種同時誘導擴增Va M+iNKT細胞和 CD3-CD56^NK細胞方法。根據本發明實施例，該方法的步驟為：
[0008] 第0天，取外周血，用淋己細胞分離液分離出PBMC，將分離得到的PBMC用第一培養 基調整PBMC濃度為2 X l〇6/ml，制成PBMC細胞息液，然后往PBMC細胞息液加入Anti-CQie 抗體、-GalCer、比-2、比-18和比-21，之后轉入培養瓶中于37°C、5% C〇2、100%濕度條件下 開始培養，所述第一培養基為含自體血漿的無血清培養基；
[0009] 第1天，細胞培養24小時后加入Anti-CD3抗體，在37°C、5% 0)2、100%濕度條件 下培養；
[0010] 第3天，往細胞息液中補加一半體積的第二培養基，所述第二培養基為含自體血 漿、比-2、比-18、比-21的無血清培養基；
[0011] 第5天，離也收集細胞，并用所述第二培養基將細胞重息并調整細胞濃度至 1. 5 XioVmU轉移至細胞培養裝置中。
[0012] 繼續培養和收獲；W后每隔2天取樣計數細胞，根據計數結果往所述細胞培養裝 置中補充所述第二培養基，調整細胞密度為1.5Xl〇Vml，37°C、5% C〇2、100%濕度條件下 連續培養14?21天后，離也收集獲得的V a M+iNKT細胞和CD3XD56^NK細胞。
[0013] 發明人驚奇地發現，利用本發明的方法僅利用一個培養系統，在體外培養條件下， 同時獲得大量應用安全、純度較高、活性強的V a 24+iNKT細胞和CD3-CD56+NK細胞，從而使得 該細胞達到能夠安全有效的應用于臨床的質量。此外，根據本發明的實施例，本發明的方法 簡單易操作，且成本較低，適于廣泛推廣應用。
[0014] 其中，需要說明的是，在本申請中所使用的術語"自體血漿"是指，與所述外周血來 源相同的供體的血漿。
[0015] 根據本發明的實施例，所述第一培養基和所述第二培養基中自體血漿的濃度均為 1% -20%體積。根據本發明的一具體示例，所述第一培養基和所述第二培養基中自體血漿 的濃度均為1體積％。由此，目的細胞擴增效果好。
[0016] 根據本發明的實施例，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述Anti-CDie抗 體的終濃度均為50ng?Img/ml。根據本發明的一具體示例，在所述第一培養基和所述第二 培養基中，所述Anti-CDie抗體的終濃度均為5(K)ng/ml。由此，目的細胞擴增效果好。
[0017] 根據本發明的實施例，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述-GalCer的 終濃度均為IOOng?Img/mL。根據本發明的一具體示例，在所述第一培養基和所述第二培 養基中，所述-GalCer的終濃度均為5(K)ng/ml。由此，目的細胞擴增效果好。
[0018] 根據本發明的實施例，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述IL-2的終濃 度均為1000?6000U/mL。根據本發明的一具體示例，在所述第一培養基和所述第二培養基 中，所述IL-2的終濃度均為lOOOU/mL。由此，目的細胞擴增效果好。
[0019] 根據本發明的實施例，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述IL-18的終 濃度均為Ing/ml?10化g/ml。根據本發明的一具體示例，在所述第一培養基和所述第二培 養基中，所述比-18的終濃度均為15ng/ml。由此，目的細胞擴增效果好。
[0020] 根據本發明的實施例，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述IL-21的終 濃度均為Ing/ml?10化g/ml。根據本發明的一具體示例，在所述第一培養基和所述第二培 養基中，所述比-21的終濃度均為20ng/ml。由此，目的細胞擴增效果好。
[0021] 根據本發明的實施例，第1天，細胞培養24小時后加入的所述Anti-CD3抗體的 終濃度為IOng?Img/ml。根據本發明的一具體示例，第1天，細胞培養24小時后加入的 Anti-CD 3抗體的終濃度為50ng/ml。由此，目的細胞擴增效果好。
[0022] 根據本發明的實施例，所述細胞培養裝置是G-REX I(K)L培養裝置。其中，需要說 明的是，所述細胞培養裝置在培養過程中呈封閉狀態。根據本發明的實施例，在所述繼續培 養和收獲的步驟中，細胞達到SxlO 9時，離也收集獲得的V a 24+iNKT細胞和CD3-CD56+NK細胞。 由此，能夠有效收集獲得目的細胞。
[0023] 根據本發明的一些實施例，所述無血清培養可W是AIM-V無血清培養基、日本寶 日醫的 GCT551 和 LONZA 的 X-VIV015, W色列 BI 公司的 BIOTARGET-IWithout kGlutamine 培養基的至少一種。
[0024] 此外，根據本發明的實施例，通過本發明的方法所培育得到的兩種細胞，最終可制 備為細胞治療產品，用于臨床腫瘤過繼性細胞免疫治療。
[0025] 根據本發明的一些具體示例，本發明設計一種簡便、有效、能在一個培養步驟中將 自體外周血單個核細胞同時誘導并擴增大量V a M+iNKT細胞和CD3-CD56^NK細胞的方法，包 括W下步驟：
[0026] 第0天，取外周血，用淋己細胞分離液分離出PBMC，將分離得到的PBMC用含5體 積％自體血漿的無血清培養基調整PBMC濃度為2X l〇7mU制成PBMC細胞息液，然后往 PBMC細胞息液加入Anti-CDie抗體、-GalCer ( a -半乳糖神經醜胺）、IL (白細胞介素）-2、 比-18和比-21，之后轉入T175培養瓶中于37°C、5% CAUOO%濕度下培養；
[0027] 第1天，細胞培養24小時后加入Anti-CD3抗體，在37°C、5% C〇2、100%濕度下培 養；
[002引第3天，往細胞息液中半量補加含5體積％自體血漿、IOOOU/血的比-2、15ng/mL 的比-18、2011肖/血的比-21的無血清培養基；
[002引第5天，離也收集細胞，用含5體積％自體血漿、IOOOU/血的比-2、15ng/血的 IL-18、20ng/mL的IL-21的無血清培養基將細胞重息并調整細胞濃度至1.5X106/mレ轉移 至一個封閉的細胞培養裝置中，
[0030] 繼續培養和收獲；W后每隔2天取樣計數細胞，根據計數結果往封閉的細胞培養 裝置中補充含自體血漿、IL-2、IL-18、IL-21的無血清培養基，調整細胞密度為1.5X107 ml, 37°C、5% CA、100%濕度條件下連續培養14?21天后，細胞達到SxlO9時，離也收集獲 得的V a M+iNKT細胞和CD3Xd56^nk細胞。
[003。 其中，需要說明的是，本發明所述的"第0天"，指的是采樣當天，第1天指的是采樣 后的第一天，第3天，第5天……W此類推。
[0032] 此外，本發明所述的V a M+iNKT細胞是指通過流式細胞儀檢測細胞表面分子標記 為V a M+的iNKT細胞，所指的CD3-CD56+NK細胞是指通過流式細胞儀檢測細胞表面分子標記 為CD 3XD56+的NK細胞（即自然殺傷細胞）。
[0033] 比-21即白細胞介素-21 (interleukin-21，比-21);比-21是比-2家族中的新成 員，由活化的CD4+T細胞分泌，結構上與IL-2、比-15相似，可調控T細胞、B細胞增殖，影響 NK細胞NK細胞增殖、分化和細胞毒活性。
[0034] 根據本發明的一些具體示例，本發明的方法能同時誘導高純度的Va 24+iNKT和 CD3-CD56+NK兩種細胞，同時該兩種細胞均誘導出V a 24+iNKT細胞和CD3-CD56+NK細胞的 激活受體NKG2D (NK細胞的活化型受體）高表達，且NKG2D的表達在擴增前后有顯著差別。 其中，本發明中所述的NKG2D是NK、T、CD 8+T細胞、iNKT細胞、巨瞻細胞等的活化性受體， NKG2D參與病毒感染細胞的識別及對腫瘤細胞的殺傷，在免疫監視和免疫殺傷中起著重要 的作用。
[00巧]本發明的方法誘導擴增的細胞增殖快，數量多，活性好，NKG2D活化受體表達高，效 應細胞純度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[003引圖1為流式細胞術分析供體1擴增前樣品表達CD3XD56+的CD3-CD 56+NK細胞百分數 圖；
[0037] 圖2為流式細胞術分析供體1擴增后樣品表達CD3XD56+的CD3-CD 56+NK細胞百分數 圖；
[003引圖3為流式細胞術分析供體2擴增前樣品表達CD3XD56+的CD3-CD 56+NK細胞百分數 圖；
[003引圖4為流式細胞術分析供體2擴增后樣品表達CD3XD56+的CD3-CD 56+NK細胞百分數 圖；
[0040] 圖5為流式細胞術分析供體3擴增前樣品表達CD3XD56+的CD 3-CD56+NK細胞百分數 圖；
[0041] 圖6為流式細胞術分析供體3擴增后樣品表達CD3XD56+的CD 3-CD56^NK細胞百分數 圖。
[004引圖7為流式細胞術分析供體1擴增前樣品表達Va24+的V a M+iNKT細胞百分數圖；
[004引圖8為流式細胞術分析供體I擴增后樣品表達Va24+的V a M+iNKT細胞百分數圖；
[0044] 圖9為流式細胞術分析供體2擴增前樣品表達Va24+的V a M+iNKT細胞百分數圖； [004引圖10為流式細胞術分析供體2擴增后樣品表達Va24+的V a M+iNKT細胞百分數圖； [004引圖11為流式細胞術分析供體3擴增前樣品表達Va24+的Va 24+iNKT細胞百分數圖；
[0047] 圖12為流式細胞術分析供體3擴增后樣品表達Va24+的V a M+iNKT細胞百分數圖。
【具體實施方式】
[0048] 下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例 中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明 書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可W通過市購獲得的常規產品。
[004引實施例1 ;同時誘導并擴增V a M+iNKT細胞和CD3-CD56^NK細胞方法 [0050] 1、誘導擴增
[005。 第0天，取H例健康人外周血（每例100血)，用淋己細胞分離液（商品名 Lymphopr巧TM, Axis-化ield公司，挪威）通過梯度離也法進行分離，收集離也管上層黃色 層作為自體血漿，中間層白膜層為PBMC細胞，將收集的PBMC細胞用磯酸鹽緩沖鹽水（PBS， GIBC0,美國）洗涂細胞兩次，用AIM-V無血清培養基（商品名AIM-V Medium CTS TM, GIBC0,美國）將細胞重息，取I(K)L細胞息液用臺盼藍拒染法檢測細胞活性并計數。根據計 數結果，分別將獲得PBMC細胞用AIM-V無血清培養基調整PBMC濃度為2 X l06/mU各例取 出1血細胞息液，離也收集細胞，用90體積％自體血漿和10體積％二甲基亞諷值imethyl SUl化Xide或DMS0,美國）配制成的凍存液Iml將細胞重息，轉移至一個2mL的凍存管 中，-80攝氏度冰箱凍存，用于流式分析術。各例剩余細胞息液按培養基體積添加終濃度為 500ng/mL 的 Anti-CDie 抗體，終濃度為 500ng/mL 的-GalCer,終濃度為 lOOOU/mL 的比-2， 終濃度為15ng/mL的比-18和終濃度為20ng/mL的比-21，混合均勻后轉入T175培養瓶中， 37°C、5% CAUOO%濕度條件下開始培養。
[005引第1天，細胞培養24小時后按培養基體積加入終濃度為50ng/血的Anti-CD3抗 體，37°C、5% C02U00%濕度條件下繼續培養；
[0053] 第3天，往細胞息液中半量補加含5體積％自體血漿、終濃度為lOOOU/mL的IL-2、 15ng/mL的比-18、20ng/mL的比-21的無血清培養基，37°C、5% C〇2、100%濕度條件下繼續 培養；
[0054] 第5天，離也收集細胞，用含5體積％自體血漿、終濃度為lOOOU/mL的IL-2、終濃 度為15ng/mL的比-18、終濃度為20ng/mL的比-21的無血清培養基將細胞重息并調整細胞 濃度至1.5Xl〇7mL后，轉移至一個封閉的細胞培養裝置G-rex I(K)L中（Wilson公司，美 國），37°C、5% CAUOO%濕度條件下繼續培養。
[0055] 第7-14天；每隔2天取樣計數細胞，根據計數結果往封閉的細胞培養裝置中補充 含自體血漿、比-2、IL-18、IL-21的無血清培養基，調整細胞密度為1. 5Xl〇VmL，37°C、5% C〇2、100 %濕度條件下連續培養。
[005引第15天，離也收集獲得的V a M+iNKT細胞和C曠CD56^NK細胞。
[0057] 2 ;擴增15天總細胞、V a M+iNKT細胞和CD3XD56^NK細胞的擴增倍數
[0058] 流式細胞術檢測方法；取樣本SxlO5細胞/管，PBS洗2次，加入流式檢測抗體，室 溫賠育20分鐘，PBS洗2次，細胞通過流式細胞儀進行分析。
[0059] 總細胞擴增倍數；將擴增15天獲得的細胞（即步驟1所得）用臺盼藍染色后再用 血細胞計數器進行計數，將當前的細胞總數除W培養前的單個核細胞總數，數值即為細胞 的擴增倍數，具體情況見表1。
[0060] CD3XD56^NK細胞擴增倍數；將擴增15天取得的細胞用臺盼藍染色后再用血細胞計 數器進行計數，將當前的細胞總數乘W 15天時通過流式細胞術檢測到細胞群中CD3-CD56+標 記CD3-CD 56^NK細胞的百分數再除W培養前的單個核細胞總數乘W復蘇的單個核細胞通過流 式細胞術檢測到細胞群中CD 3XD56+標記中CD3-CD56+NK細胞的百分數，數值即為NK細胞的擴 增倍數，具體情況見表1。
[0061] Va24^iNKT細胞擴增倍數；將擴增15天取得的細胞用臺盼藍染色后再用血細胞 計數器進行計數，將當前的細胞總數5天時通過流式細胞術檢測到細胞群中Va 24+標記的 Va^+iNKT細胞的百分數再除W培養前的單個核細胞總數乘W復蘇的單個核細胞通過流式 細胞術檢測到細胞群中Va 24+標記的Va24^iNKT細胞的百分數，數值即為Va24^iNKT細胞的擴 增倍數，具體情況見表1。
[0062] 表1不同供體培養15天后各細胞的增值倍數表
[0063]
【權利要求】
1. 一種同時誘導擴增Va 24+iNKT細胞和CD3_CD56+NK細胞的方法，其特征在于，步驟為： 第0天，取外周血，用淋巴細胞分離液分離出PBMC，將分離得到的PBMC用第一培養基調 整PBMC濃度為2X 106/mL，制成PBMC細胞懸液，然后往PBMC細胞懸液加入Anti-CD16抗 體、-GalCer、IL-2、IL-18和IL-21，之后轉入培養瓶中于37°C、5% C02、100%濕度條件下開 始培養，所述第一培養基為含自體血漿的無血清培養基； 第1天，細胞培養24小時后加入Anti-⑶3抗體，在37°C、5% C02、100%濕度條件下培 養； 第3天，在細胞培養液中補加一半體積的第二培養基，所述第二培養基為含自體血漿、 IL-2、IL-18、IL-21的無血清培養基； 第5天，離心收集細胞，并用所述第二培養基將細胞重懸并調整細胞濃度至1. 5 X 106/ mL，轉移至細胞培養裝置中， 繼續培養和收獲： 以后每隔2天取樣計數細胞，根據計數結果往所述細胞培養裝置中補充所述第二培養 基，調整細胞密度為1. 5X106/mL，37°C、5% C02、100%濕度條件下連續培養14?21天后， 離心收集獲得的V a 24+iNKT細胞和CD3XD56+NK細胞。
2. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特 征在于，所述第一培養基和所述第二培養基中自體血楽的濃度均為1 %?20%體積，優選5 體積％。
3. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特 征在于，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述Anti-CD16抗體的終濃度均為50ng? lmg/ml，優選 500ng/mL。
4. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特 征在于，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述-GalCer的終濃度均為100ng?lmg/ mL,優選 500ng/mL。
5. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特 征在于，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述IL-2的終濃度均為1000?6000U/ mL，優選 1000U/mL。
6. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特征 在于，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述IL-18的終濃度均為lng/ml?100ng/ mL,優選 15ng/mL。
7. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特征 在于，在所述第一培養基和所述第二培養基中，所述IL-21的終濃度均為lng/ml?100ng/ mL,優選 20ng/mL。
8. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特 征在于，第1天，細胞培養24小時后加入的所述Anti-⑶3抗體的終濃度為10ng?lmg/ml， 優選 50ng/mL。
9. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3TD56+NK細胞的方法，其特 征在于，所述細胞培養裝置是G-REX100L培養裝置。
10. 根據權利要求1所述同時誘導擴增V a 24+iNKT細胞和CD3XD56+NK細胞的方法，其特 征在于，在所述繼續培養和收獲的步驟中，細胞達到5xl09時，離心收集獲得的V a 24+iNKT細 胞和CD3XD56+NK細胞。
【文檔編號】C12N5/0783GK104357391SQ201410542883
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月15日 優先權日:2014年10月15日
【發明者】鄔冬云, 楊新娟, 廖嬈君 申請人:深圳源正細胞醫療技術有限公司