轉基因玉米的多重pcr篩查檢測引物及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種轉基因玉米的多重PCR篩查檢測引物及檢測方法，所述引物具有較強的特異性，能夠用于多重PCR篩查檢測分析。所述檢測方法提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度高的轉基因玉米篩查檢測方法，實現了轉基因玉米的多靶標檢測。利用毛細管電泳對PCR擴增產物進行分析，其片段大小區分率可達數個堿基，分辨率高。本發明的引物和檢測方法為轉基因玉米多靶標檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的高通量檢測方法。本實驗建立的多重PCR反應體系不僅可以檢測進口轉基因玉米外源基因成分，而且還能擴增到其他轉基因作物篩查檢測。
【專利說明】轉基因玉米的多重PCR篩查檢測引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種可同時檢測兩種和六種外源基因的多重PCR 篩查檢測方法。
【背景技術】
[0002] 目前關于進口轉基因玉米及其產品的篩查檢測技術，主要集中在單一基因 PCR方 法，尚無關于檢測進口轉基因玉米及其產品的多重PCR篩查檢測策略研究及相關篩查檢測 技術。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的主要是提供一種準確、快速、簡便的多重PCR快速篩查多個目的基 因元件的檢測方法。
[0004] 本發明通過下述技術方案實現： 轉基因玉米的多重PCR篩查檢測引物，包括以下引物序列： 其中，二重PCR引物序列如下： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
[0005] 六重PCR引物序列如下： P-ractl-F :5，-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3，； P-ractl-R :5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3,。
[0006] 上述二重PCR檢測方法如下： (al)合成以下引物： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； (a2)制備待測玉米的DNA稀釋液； (a3)配制PCR反應體系； (a4)進行PCR反應； (a5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
[0007] 進一步地，步驟（a3)中所述的配制PCR反應體系總體積為25 μ L ;具體含以下 組分：PCR Master Mix (2Χ)、DNA稀釋液、步驟（al)中的各引物、ddH20;其中PCR Master Mix (2X)的加入量為12. 5 μ L，DNA稀釋液加入量為2.0 μ L，各引物加入后的終濃度均為 〇· 2 μ Μ，采用 CldH2O 補足 25 μ L。
[0008] 再進一步地，所述PCR反應條件為：94°C變性5min，然后進入35個循環；94°C 30s， 58°C 30s，72°C 30s ;循環結束后 72°C延伸 5min。
[0009] 上述六重PCR檢測方法如下： (bl)合成以下引物： P-ractl-F :5，-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3，； P-ractl-R ：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3'； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3，； (b2)制備待測玉米的DNA稀釋液； (b3)配制PCR反應體系； (b4)進行PCR反應； (b5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
[0010] 進一步地，步驟（b3)中所述的配制PCR反應體系總體積為25 μ L ;具體含以下組 分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀釋液、步驟（bl)中的各引物、ddH20;其中 PCR Master Mix (2X)的加入量為12. 5 μ L，DNA稀釋液加入量為2.0 μ L，P-ractl引物加入后的終濃度為 0.2 μ M，其他引物加入后的終濃度為0. 1 μ M，采用CldH2O補足25 μ L。
[0011] 再進一步地，所述PCR反應條件為：94°C變性5min，然后進入35個循環；94°C30s， 56°C 30s，72°C 30s ;循環結束后 72°C延伸 5min。
[0012] 本發明具有以下優點及有益效果： 本發明在每個轉基因玉米材料及產品至少檢測出一次的篩查檢測時，采用本發明設定 的T-NOS和P-CaMV 35S兩個基因，并通過對引物濃度和退火溫度優化建立了檢測轉基因玉 米的二重PCR技術體系。
[0013] 本發明在每個轉基因玉米材料及產品至少檢測出兩次的篩查檢測時，采用本發明 設定的P-ractl、T-NOS、P-CaMV 35S、bar、pat和PMI等6個基因，并通過對引物濃度和退 火溫度優化建立了檢測轉基因玉米的六重PCR技術體系。
[0014] 本發明僅一次PCR反應可快速、準確檢測出當前進口轉基因玉米至少一次，且成 本低、準確率高，假陽性率低，六重PCR技術體系也能有效控制假陰性的出現。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖 1 為本發明中 P-ractl (A)，T-N0S (B)，P-CaMV 35S (C)，bar/pat (D)，PMI (E) 單基因 PCR擴增結果。
[0016] 圖2為本發明中CaMV35s，T-NOS二重PCR引物梯度擴增結果（A)，溫度梯度擴增結 果（B)，已知樣品驗證擴增結果（C)。
[0017] 圖 3 為本發明中 p-ractl，T-NOS，P-CaMV 35S，bar，pat，PMI 六重 PCR 引物梯度擴 增結果（A)，溫度梯度擴增結果（B)，濃度梯度擴增結果（C)，已知樣品驗證擴增結果（D)。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式并不限于此。 實施例
[0019] 轉基因玉米的多重PCR篩查檢測方法，具體如下： 二重PCR篩查檢測方法如下： (al)合成以下引物： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； (a2)制備待測玉米的DNA稀釋液； (a3)配制PCR反應體系； (a4)進行PCR反應； (a5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
[0020] 其中，步驟（a3)中所述的配制PCR反應體系總體積為25 μ L ;具體含以下組分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀釋液、步驟（al)中的各引物、ddH20;其中 PCR Master Mix (2Χ)的 加入量為12. 5 μ L，DNA稀釋液加入量為2. 0 μ L，各引物加入后的終濃度均為0. 2 μ M，采用 CldH2O補足25 μ L。所述PCR反應條件為：94°C變性5min，然后進入35個循環；94°C 30s， 58°C 30s，72°C 30s ;循環結束后 72°C延伸 5min。
[0021] 六重PCR篩查檢測方法如下： (bl)合成以下引物： P-ractl-F :5，-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3，； P-ractl-R ：5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT -3'； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3，； (b2)制備待測玉米的DNA稀釋液； (b3)配制PCR反應體系； (b4)進行PCR反應； (b5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
[0022] 其中，步驟（b3)中所述的配制PCR反應體系總體積為25 μ L ;具體含以下組分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀釋液、步驟（bl)中的各引物、ddH20;其中 PCR Master Mix (2Χ)的 加入量為12. 5 μ L，DNA稀釋液加入量為2. 0 μ L，P-ractl引物加入后的終濃度為0. 2 μ M， 其他引物加入后的終濃度為〇. 1 μ Μ，采用CldH2O補足25 μ L。所述PCR反應條件為：94°C變 性5min，然后進入35個循環；94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ;循環結束后72°C延伸5min。
[0023] 為了驗證本發明的篩查檢測效果以及相應的參數選取的真實性，對各步驟進行具 體的驗證試驗，其具體情況如下： (1) 擴增檢測引物的合成： 表1引物序列信息表
【權利要求】
1. 轉基因玉米的多重PCR篩查檢測引物，其特征在于，包括以下引物序列： 二重PCR引物序列： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3'。
2. 轉基因玉米的多重PCR篩查檢測引物，其特征在于，包括以下引物序列： 六重PCR引物序列： P-ractl-F ：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'； P-ractl-R :5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F :5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3' ； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3,。
3. 轉基因玉米的多重PCR篩查檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：二重PCR檢測方 法： (al)合成以下引物： P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； (a2)制備待測玉米的DNA稀釋液； (a3)配制PCR反應體系； (a4)進行PCR反應； (a5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
4. 根據權利要求3所述轉基因玉米的多重PCR篩查檢測方法，其特征在于，步驟（a3) 中所述的配制PCR反應體系總體積為25 ii L ;具體含以下組分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀釋液、步驟（al)中的各引物、ddH20;其中PCR Master Mix (2X)的加入量為12.5 iiL，DNA 稀釋液加入量為2. 0 y L，各引物加入后的終濃度均為0. 2 y M，采用ddH20補足25 y L。
5. 根據權利要求4所述轉基因玉米的多重PCR篩查檢測方法，其特征在于，所述PCR反 應條件為：94°C變性5min，然后進入35個循環；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s ;循環結束后 72°C 延伸 5min。
6. 轉基因玉米的多重PCR篩查檢測方法，其特征在于，六重PCR檢測方法： (bl)合成以下引物： P-ractl-F ：5'-AGTCCAAAATAAAACAAAGGTAAGAT-3'； P-ractl-R :5'-TTCACTTTGGGCCACCTTT-3' ； T-NOS-F :5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3' ； T-NOS-R :5'-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3' ； P-CaMV 35S-F :5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3' ； P-CaMV 35S-R :5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3' ； bar-F :5'-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3' ； bar-R :5'-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3' ； pat-F :5'-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3' ； pat-R :5'-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3' ； PMI-F ：5'-TTCTGAAATCGGTTTTGCCAA-3,； PMI-R :5,-TCAGCAATAGCGGGGAGAA-3，； (b2)制備待測玉米的DNA稀釋液； (b3)配制PCR反應體系； (b4)進行PCR反應； (b5)取PCR反應產物進行毛細管電泳。
7. 根據權利要求6所述轉基因玉米的多重PCR篩查檢測方法，其特征在于，步驟（b3) 中所述的配制PCR反應體系總體積為25 ii L ;具體含以下組分：PCR Master Mix (2X)、DNA 稀釋液、步驟（bl)中的各引物、ddH20;其中PCR Master Mix (2X)的加入量為12. 5iiL，DNA 稀釋液加入量為2. 0 ii L，P-ractl引物加入后的終濃度為0. 2 ii M，其他引物加入后的終濃 度為〇? 1 U M，采用ddH20補足25 ii L。
8. 根據權利要求7所述的轉基因玉米的多重PCR篩查檢測方法，其特征在于，所述PCR 反應條件為：94°C變性5min，然后進入35個循環；94°C 30s，56°C 30s，72°C 30s ;循環結束 后72°C延伸5min。
【文檔編號】C12N15/11GK104404161SQ201410756727
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】尹全, 宋君, 劉勇, 雷紹榮, 郭靈安, 王東, 張富麗, 劉文娟, 常麗娟 申請人:四川省農業科學院分析測試中心