α-酮戊二酸作為飼料添加劑的用途及相應飼料的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于飼料添加劑領域，具體涉及一種α -酮戊二酸以飼料添加劑的形式添 加在仔豬日糧（仔豬日常飼料）中以用于抑制豬仔腸道病原菌的侵染、降低仔豬黃白痢發 病率。
【背景技術】
[0002] 仔豬黃白痢又稱新生豬腹瀉，是仔豬黃痢和仔豬白痢的合稱，是由致病性大腸桿 菌等引起的一種急性傳染病。目前已分離的仔豬黃痢、白痢的血清型眾多，各血清型疫苗之 間有效的交叉保護性差，給該病的防治造成了很大的難度。國內的仔豬黃白痢的發病率達 20% -60%，出現混合感染和繼發感染時，病死率可達60%以上，給養豬業造成了嚴重的危 害。隨著畜牧業集約化程度的提高和飼料工業的發展，全球范圍內，由于抗生素的亂用，耐 藥菌株增多，導致此病也日益惡化，多呈季節流行性和地方流行性。針對仔豬黃白痢、生長 受阻等應激，國內外做了大量研究，主要是抗生素、高鋅、益生素、寡糖、酶制劑、酸化劑等方 面的研究。
[0003] α -酮戊二酸又稱為 2_ 氧代-1，5 酮戊二酸（alpha-Ketoglutaric acid，AKG)，為 白色或類白色細結晶性粉末，易溶于水、醇、極難溶于醚，熱穩定性高，熔點在113-115Γ，分 子式C 5H6O5，分子量146. 10,其分子結構式如下：
[0005] 該α -酮戊二酸以生物合成或化工合成的原形物形式使用，是谷氨酰胺的前體物 質和三羧酸循環的重要中間產物，具有良好的穩定性，在體內可以氧化產生ΑΤΡ。另外，AKG 也是其它酮酸如α-酮異己酸的前體物質，α-酮異己酸可轉變為羥甲基丁酸，而羥甲基丁 酸被認為是蛋白質分解的保護物質。動物體內的轉氨酶多以AKG為特異的氨基受體，可將 大多數氨基酸的氨基轉移給AKG生成谷氨酸（Glu)。Glu參與構成谷胱甘肽（GSH)，而GSH 具有抗氧化和解毒作用；Glu和氨在谷氨酰胺合成酶的催化下合成谷氨酰胺（Gin) ;Glu還 可以與乙酰輔酶A產生N-乙酰谷氨酸，推動尿素循環。可見，AKG在機體內既是一種能量載 體，又能運載氮、貯存氮，改善機體的氮代謝。目前的研究表明，AKG可增強細胞代謝活性、 降低體外細胞培養體系及機體產生的活性氧含量，具有明顯的抗氧化作用；減輕急慢性氰 化物中毒誘導的大腦氧化應激；通過抗氧化作用機制減輕酒精誘導的肝細胞損傷；上調應 激相關蛋白表達，增加胰島素、生長激素及胰島素樣生長因子-1等血清水平；減輕實驗動 物內毒素血癥誘導的氧化應激及胃腸粘膜損傷，并改善胃腸粘膜完整性及營養吸收；有效 維持機體總氮平衡和促進蛋白質合成。
[0006] 目前，α -酮戊二酸已做為一種營養強化劑廣泛應用于人類保健品和醫療機構，但 作為仔豬飼料添加劑研究較少，將α-酮戊二酸添加在仔豬飼料中作為抑制病原菌侵染制 劑和降低仔豬黃白痢發病率的飼料尚未見報道。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是：針對現有技術中仔豬抗應激能力差，易感染病原 菌，黃白痢發病率和死亡率高的問題，提供一種α -酮戊二酸作為飼料添加劑的用途及相 應飼料，通過將α -酮戊二酸作為飼料添加劑添加在仔豬日常飼料中，以增強仔豬腸上皮 細胞緊密連接主要相關基因的表達，從而抑制病原菌對仔豬腸道組織的侵染，降低仔豬黃 白痢發病率，顯著促進仔豬生長。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：α-酮戊二酸在制備仔豬 用抑制腸道病原菌侵染制和仔豬用降低黃白痢發病率藥劑中的應用。
[0009] 本發明采用的另一種技術方案是：α -酮戊二酸在制備抑制腸道病原菌侵染和降 低黃白痢發病率的飼料中的應用。
[0010] 本發明同時提供一種仔豬用飼料，該飼料中添加有α -酮戊二酸，該α -酮戊二酸 的添加量為每1千克該飼料添加5-10克。
[0011] 上述提及的α -酮戊二酸為市購產品，可為市面上流通或貯藏的按不同工藝技術 生產的各種形態的α-酮戊二酸。使用時，可將α-酮戊二酸應用于被法規許可添加于仔 豬飼料或飼料添加劑中的載體或者基質。
[0012] 當α -酮戊二酸添加到仔豬日常飼料中時，可采用的添加方式包括將其以固體混 合的方式直接與日常飼料混合，攪勻，或是加水溶解后以噴霧形式均勻噴灑在日常飼料中， 或是現有技術中的其它添加方法。如果適當的話，α-酮戊二酸可以和通常的仔豬飼料添 加劑一起添加，如維生素、礦物質、微量元素等。
[0013] 本發明通過將α -酮戊二酸作為添加劑添加在仔豬日常飼料中，具有顯著增強仔 豬腸上皮細胞緊密連接主要相關基因表達，抑制病原菌對仔豬腸道組織的侵染，降低仔豬 黃白痢發病率，促進仔豬生長的優點。
【具體實施方式】
[0014] 以下結合實施例進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0015] 實施例1 α -酮戊二酸對仔豬生長性能的影響
[0016] 試驗飼料及分組：選取母豬胎次相同、產活仔數相同的8窩仔豬（調整為每窩12 頭，與母豬同籠），隨機分為兩個處理組，分別為對照組和α-酮戊二酸添加組（本發明飼料 組），每個處理4個重復，每個重復為一窩（或籠），分別飼喂基礎日糧和本發明飼料日糧。 仔豬的基礎日糧配制參照NRC(1998)豬的營養需要。本發明飼料日糧為每1千克基礎日糧 中添加有10克α-酮戊二酸替代基礎日糧中相應質量的玉米粉。配制試驗飼料時，每種飼 料原料采用錘片式粉碎機粉碎（篩片孔徑為1_)，按比例混合并攪拌均勻，制成直徑2_、 長度3mm的硬顆粒，在室溫下風干后4°C冰箱貯存備用。
[0017] 試驗方法：試驗在同一棟封閉豬舍內進行。本發明飼料組的仔豬從7日齡開始喂 飼本發明飼料日糧至35日齡，為期28天，自由采食、飲水，免疫消毒程序按豬場常規方法進 行。以重復籠為單位飼喂，每天觀察記錄試驗豬的采食、排糞等情況。
[0018] 試驗結果：從表1可知，本發明飼料組的仔豬喂飼添加有α -酮戊二酸的基礎日糧 后，平均日增重顯著提高，黃白痢發病率顯著降低。說明：α-酮戊二酸能顯著促進仔豬生 長，顯著降低仔豬黃白痢發病率。
[0019] 表1 α -酮戊二酸對仔豬生長性能的影響
[0021] 注：同行數據中標有不同字母者為差異顯著（Ρ<0.05)，下同。
[0022] 實施例2 α -酮戊二酸對沙門氏菌侵染IPEC-I (仔豬小腸上皮細胞）的影響
[0023] 沙門氏菌準備：將LB固體培養基上分離培養獲得的單個沙門氏菌菌落，接種到 5ml液體LB培養基中，37°C，225r/min震蕩培養過夜后，取10 μ 1含有沙門氏菌的液體LB 培養基接種到5ml液體LB培養基中，37°C過夜，使得沙門氏桿菌達到指數生長期。
[0024] 沙門氏桿菌侵染試驗，將IPEC-I細胞接種于24孔細胞培養板，每孔含5 X IO4個細 胞，每組設3個平行孔，待細胞貼壁后，分別每天更換原來的培養基（對照組）和含α -酮戊 二酸（購自Sigma公司，純度為99. 5% )的培養基（AKG的濃度為ImM)，培養2天。將之前 準備的沙門氏菌l〇〇〇r/min，離心10min，棄去上清，用5ml的DMEM/F12培養液（不含青/鏈 霉素）重新懸浮細菌。每孔接種100 μ 1含沙門氏菌的DMEM/F12培養基，并將培養板800r/ min，離心10min，從而將細菌沉淀至培養板底充分與IPEC-I細胞接觸。在37°C，5% 0)2細 胞培養箱中孵育60min。60min后移去培養基，用PBS洗滌2遍，每孔加入1ml含有100 μ g/ ml Gentamicin，在37°C，5% CO2細胞培養箱中孵育120min以除去未侵染進細胞內的沙門 氏菌。用PBS洗滌3遍后，每孔加入200ul l%Triton X-100,在37°C的孵箱中裂解5min， 再于每孔加入800 μ I PBS充分混勻。再將獲得的裂解液稀釋I X IO3后，取100 μ 1接種于 固體LB培養基，培養過夜后計數培養板上的菌落數。由表2可以得知α-酮戊二酸能夠顯 著減少沙門氏菌對IPEC-I細胞的侵染。
[0025] 表2 α -酮戊二酸對沙門氏菌侵染IPEC-I細胞的影響
[0027] 實施例3 : α -酮戊二酸對IPEC-I細胞（仔豬小腸上皮細胞）緊密連接主要相關 基因表達的影響
[0028] 將IPEC-I細胞接種于6孔細胞培養板，每孔含I X IO6個細胞，每處理設3個平行 孔，待細胞貼壁后，吸棄原培養基，分別每天更換原來的培養基（對照組）和含α-酮戊二 酸（購自Sigma公司，純度為99. 5 % )的培養基（AKG的濃度為ImM)，待細胞生長覆蓋培養 板底部大于90%后棄上清，用冰冷的PBS洗細胞2次，每孔加 Iml Trizol裂解細胞，然后按 常規方法提取RNA、cDNA反轉錄、實時熒光PCR，采用2 (λλμ計算各基因 mRNA的相對表達 量。由表3可以得知，α-酮戊二酸能顯著上調IPEC-I細胞緊密連接主要相關基因表達， 說明α-酮戊二酸有利于改善仔豬腸道上皮組織的屏障功能。
[0029] 表3 α -酮戊二酸對IPEC-I細胞緊密連接主要相關基因表達的影響
【主權項】
1. α-酮戊二酸在制備仔豬用抑制腸道病原菌侵染劑中的應用。2. α-酮戊二酸在制備仔豬用降低黃白痢發病率藥劑中的應用。3. α-酮戊二酸在制備抑制腸道病原菌侵染和降低黃白痢發病率的飼料中的應用。4. 一種仔豬用飼料，其特征在于，該飼料中添加有α-酮戊二酸，該α-酮戊二酸的添 加量為每1千克該飼料添加5-10克。5. 如權利要求4所述的仔豬用飼料，其特征在于，所述飼料是將α-酮戊二酸與仔豬曰 常飼料混合，攪勻，得到。6. 如權利要求4所述的仔豬用飼料，其特征在于：所述飼料是先將α-酮戊二酸溶于 水后，再把溶有α-酮戊二酸的水均勻噴灑在仔豬日常飼料中，得到。
【專利摘要】一種α-酮戊二酸作為飼料添加劑的用途，該α-酮戊二酸以飼料添加劑的形式添加在仔豬日常飼料中，能顯著提高仔豬的生長速度，抑制仔豬腸道病原菌的侵染，降低仔豬黃白痢發病率，增強腸上皮細胞緊密連接主要相關基因的表達；具有綠色、天然、無耐藥、無殘留，功能多、兼顧生長和抗疾病等特性；能較大地降低仔豬黃白痢發病率、降低仔豬養殖成本，適合產業化生產。
【IPC分類】A23K50/30, A23K20/00
【公開號】CN105325731
【申請號】CN201510888149
【發明人】趙玉蓉, 王紅權, 鄔靜, 田亞男, 柯穗
【申請人】湖南農業大學
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年12月7日