藻酸鹽對胃蛋白酶的抑制的制作方法

專利名稱：藻酸鹽對胃蛋白酶的抑制的制作方法
技術領域：
本發明涉及藻酸鹽抑制酶的用途。具體地講，本發明涉及某些種類的藻酸鹽抑制蛋白分解酶的用途。
胃內容物反流入食管會損傷食管的鱗狀上皮，而且易使食管粘膜發生巴雷特(Barrett)食管和食管癌。胃反流物中的腐蝕物主要是胃蛋白酶和鹽酸。鹽酸可被碳酸氫鈉迅速中和，而胃蛋白酶可在pH值高達5的環境中仍具有活性，且只有在pH值高于7時才會受到不可逆的抑制。胃蛋白酶是一種蛋白分解酶，它能催化使某些氨基酸間的肽鍵斷裂。因而，胃蛋白酶會對食管造成持續性的損傷。
過去，解決反流性食管炎問題的一個方法是，服用一種與胃酸接觸時可產生充有二氧化碳的膠狀泡沫或泡筏的制劑，這些泡沫或泡筏漂浮在胃內容物表面。發生反流時，這些泡筏先于胃內容物進入食管，于是保護食管粘膜免受進一步刺激。已知的這類制劑包括含藻酸、碳酸氫鈉和抗酸劑的粉劑或片劑等固體制劑，或者以GAVISCON(TM Reckitt & Colman Products Ltd)為商品名銷售的含藻酸鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈣的液體制劑。在我們的英國專利No.1524740中描述了這類液體制劑。
除了防止食管受到物理損傷，還需抑制胃蛋白酶和/或胃液的活性，從而使食管受到的損傷減少到最小。
現在我們發現某些藻酸鹽比其他藻酸鹽能更好地抑制胃蛋白酶和/或胃液的活性。
為此，本發明提供了分子量低于400,000的藻酸鹽在制備能抑制哺乳動物胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的藥物組合物中的用途。
藻酸鹽是由D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸殘基組成的多糖醛酸混合物，而且可從已知的褐藻類(Phaeophycae)中獲得。藻酸鹽最有用的特性之一是它們能在低濃度下形成粘性溶液。
本文中的術語“藻酸鹽”包括藻酸、藻酸的鹽(藻酸鹽)、藻酸的衍生物如丙二醇等酯類，以及它們的混合物。
所提到的分子量是重均分子量。
優選一價的藻酸鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、或銨鹽，最優選鈉鹽。可以理解本發明所用的藻酸鈉可含有少量的其他藻酸鹽，例如達約10％重量的鈣鹽或鉀鹽。這些藻酸鹽可由FMC Biopolymers AS提供，例如，Protanal H120L和Protanal LF120。
下表1列出了由FMC Biopolymers AS提供的某些藻酸鈉的一般性質。
表1FMC Biopolymers AS提供的藻酸鈉的一般性質
優選分子量低于380,000的藻酸鹽，更優選分子量低于365,000的藻酸鹽，最優選分子量低于350,000的藻酸鹽。
藻酸鹽分子量優選大于30,000。優選分子量大于40,000的藻酸鹽，更優選分子量大于60,000的藻酸鹽，最優選分子量大于75,000的藻酸鹽。
應當注意，上述限定的任何藻酸鹽均可任意組合，本文在此明確公開了這些限定的所有組合。
在本發明的優選實施方式中，藻酸鹽選自Protanal SF120、ProtanalSF/LF、Protanal LF10L、Protanal LF120和Protanal SF60。
胃蛋白酶可以是任意胃蛋白酶，例如，豬胃蛋白酶、馬胃蛋白酶、鼠胃蛋白酶、綿羊胃蛋白酶、牛胃蛋白酶或人胃蛋白酶。優選人胃蛋白酶。
蛋白分解酶活性的定義是指將生物材料分解為較簡單的物質，如蛋白質分解為小分子的蛋白質和/或氨基酸。
胃液的定義是，含有水、鹽酸(HCl)、包括NaCl、KCl、CaCl2、Ca3(PO4)2、FePO4和Mg3(PO4)2的一種或多種鹽以及包括胃蛋白酶的多種酶的物質。胃液存在于任何哺乳動物包括人的胃和腸道中。
優選1％重量分數的藻酸鹽的水溶液，在20℃下用Brookfield RVT粘度計采用3號錠子在20r.p.m.下測得的該溶液的粘度小于600mPa.s。
更優選藻酸鹽的粘度小于550mPa.s，最優選小于500mPa.s。
本發明基于這樣一個出人意料的發現，即通過對藻酸鹽的選擇，其表現出對胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的突出的抑制作用。具體地說，用N-端基分析法檢測發現，分子量為40,000-350,000的藻酸鹽對胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性有突出的抑制作用，且該抑制作用增加了50％以上。
為此，本發明進一步提供了藻酸鹽在抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性方面的用途，其中，所述藻酸鹽的分子量小于400,000。
根據本發明的另一個實施方式，本發明還提供了藻酸鹽在制備保護食管不致發生由胃蛋白酶引起的疾病或損傷的藥物組合物中的用途。
根據本發明的另一個實施方式，本發明在制備保護食管不致發生由胃蛋白酶引起的疾病或損傷的藥物時，采用了源自昆布屬植物(Laminaria)或Lessonia屬植物的藻酸鈉，其中，源自昆布屬植物的藻酸鈉的古洛糖醛酸基鏈段長度大于14.0，源自Lessonia屬植物的藻酸鈉的古洛糖醛酸基鏈段長度至少為7.0，優選至少為6.9。
具體而言，使用上述藻酸鈉可治療或預防巴雷特食管、食管癌或由胃蛋白酶引起的胃內容物返流損傷。
本發明在這方面采用的來自昆布屬植物的藻酸鈉，其古洛糖醛酸基鏈段長度大于14.0。本發明優選來自昆布屬植物的由FMC Biopolymer A/S生產的LFR 5/60、SF 120、SF/LF和SF 200級別的藻酸鈉，最優選SF 200級別的藻酸鈉。表1列出了該級別藻酸鈉的例子的其他特性。
本發明中該用途的來自昆布屬植物的藻酸鈉其古洛糖醛酸基的分數優選地至少為0.64，更優選0.68以上。
本發明所用的來自Lessonia屬植物的藻酸鈉優選為SF 60、H120L和LF120L級別的。表1列出了該級別藻酸鈉的例子的其他特性。
優選的來自Lessonia的藻酸鈉的古洛糖醛酸基分數至少為0.44。
本發明的范圍還包括一種保護食管不致發生由胃蛋白酶引起的食管疾病或損傷的方法，該方法包括給患者施用口服有效劑量的藻酸鹽，該藻酸鹽的分子量為小于400,000。
本發明的范圍還包括一種保護食管不致發生由胃蛋白酶引起的食管疾病或損傷的方法，該方法包括給患者施用口服有效劑量的源自昆布屬植物或Lessonia屬植物的藻酸鈉，其中，源自昆布屬植物的藻酸鈉的古洛糖醛酸基鏈段長度大于14.0，源自Lessonia屬植物的藻酸鈉的古洛糖醛酸基鏈段長度至少為7.0，優選至少為6.9。
本發明所用的藻酸鈉可作為藥物組合物施用，可將該藥物組合物配制成可口的制劑，且該制劑可與胃酸反應而在胃內容物之上形成泡筏。
本發明所用的這種藥物組合物可以是與水混合的干粉劑。容易注意到，與該干粉混合的水量的選擇應當是，在混合后可得到可口的液體制劑。然而在本發明的一個優選實施方式中，該組合物為液體形式。
在液體形式的藥物組合物制劑中，藻酸鈉的含量優選為重量體積比從0.1到12.0％，優選4.0到11.0％。該液體配方可為散劑，或可以按單位劑量的形式包裝為小袋。
本發明所用的組合物還優選包括一種懸浮劑。適當的懸浮劑包括角叉膠、hypromellose、黃芪膠、果膠、土豆淀粉預凝膠、淀粉羥乙酸鈉、卡波姆(carbomer)、黃原膠或其混合物。卡波姆是丙烯酸與蔗糖的丙烯基酯或季戊四醇交聯而成的合成高聚物。可得到的適當級別的商品卡波姆包括Carbopol934P或Carbopol 974(BF Goodrich)。
對于在液體制品中的應用，必須在將卡波姆預分散于水中之后對其進行中和。優選的中和劑為氫氧化鈉。卡波姆的濃度指卡波姆占中和之前的物質總量的分數。
懸浮劑及其濃度的選擇依賴于組合物中所用的藻酸鈉的量及其級別，還依賴于所用的輔助難溶成分的含量及其種類。優選的懸浮劑為卡波姆。懸浮劑的濃度優選為0.1到1％w/v，最優選0.1到0.5％w/v。
本發明的組合物優選進一步含有二價或三價金屬離子源，以增加在胃里形成的泡筏的強度。優選當該組合物到達胃里時可產生這些金屬離子，但不能在到達胃之前產生，否則該組合物就會過早地形成凝膠。適當的金屬離子為鋁離子，優選為鈣離子。最優選該組合物含有鈣離子。
因此，本發明所用的組合物優選地進一步含有0.1到5％w/v的鈣離子，最優選0.5到3％w/v的碳酸鈣。
本發明的組合物可進一步含有防腐劑來防止被微生物污染及隨后的變質。適當的防腐劑的例子為對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯及其鹽，優選將例如對羥基苯甲酸甲酯和丙酯或對羥基苯甲酸乙酯和丁酯結合使用。
防腐劑的濃度優選為0.01到0.5％w/v。
本發明的組合物還可包括一種或多種下列成分，色素、甜味劑、香味劑或pH調節劑。
當本發明的組合物需要緩釋時，該組合物還含有適于在胃里持續給藥的活性成分。
當本發明的組合物用作定向釋放的組合物時，該組合物還含有適合于專門在胃里釋放的活性成分，如局部抗菌劑。
本發明的范圍還包括一種藥物組合物，該藥物組合物包括至少兩種，優選至少3種不同級別的藻酸鹽，至少其中一種的分子量小于400,000，優選從40,000到350,000，更優選100,000到300,000，最優選200,000到255,000。
優選至少一種藻酸鹽的甘露糖醛酸與古洛糖醛酸的MG之比不大于0.6∶1，例如Protanal SF120、Protanal SF/LF40和Protanal SF200。
替代地，或與上述藻酸鹽相結合，優選至少一種藻酸鹽的MG之比至少為1，例如Protanal LF120L、Protanal SF60L和Protanal H120L。
同樣地，根據本發明這一方面的組合物具有阻礙胃蛋白酶活性的特點，且當其中MG之比不大于0.6∶1時，能形成很有用的牢固的泡筏，和/或當其中MG之比至少為1時，具有突出的粘膜吸附性。
在這一方面，申請人參考了國際專利公開No.WO98/48814，本文引用了其中的內容作為參考。
本發明的組合物可用任何制備該類組合物的常規方法制備。
在本發明的優選實施方式中，所有提到的％重量均指％w/v(重量/體積)。
本文所述的任一發明或實施方式的任一方面的任一特點，均可與本文所述的其他發明或實施方式的任一方面的任一特點相結合。
本發明將參照下述實施例及

圖1到4進行進一步的說明圖1顯示了0.5mg不同分子量的藻酸鈉對2.0μg豬胃蛋白酶A的抑制率；圖2顯示了0.5mg不同分子量的藻酸鈉對4.0μg豬胃蛋白酶A的抑制率；圖3顯示了粘度(溶液的1％重量分數)mPa.s與不同分子量的藻酸鈉對2.0μg豬胃蛋白酶A的抑制率的關系；和圖4顯示了粘度(溶液的1％重量分數)mPa.s與不同分子量的藻酸鈉對4.0μg豬胃蛋白酶A的抑制率的關系。
蛋白分解活性的評估方法一種靈敏而準確的方法是，通過測定肽鍵水解時在肽鍵上形成的新的N-端基三硝基-苯醚化衍生物來評估蛋白分解活性。通過采用琥珀酰白蛋白作為蛋白基質提高了這種測定方法的靈敏性，所述的蛋白基質中白蛋白上的原本存在的氨基被封閉了。該方法可測定胃液中的胃蛋白酶的活性。溶液的制備琥珀酰白蛋白基質將20g牛血清蛋白(ICN，Cedarwood，Basingstroke)溶解在200ml pH7.5的磷酸鹽緩沖液中。然后緩慢加入2.8g琥珀酸酐，同時通過滴加2M的氫氧化鈉(NaOH)保持pH在7.5。4℃下用去離子水徹底透析所得溶液，凍干并在-18℃下貯藏。需要時，制成8.0mg/ml的溶于0.01M鹽酸(HCl)的溶液，并滴加1M HCl直到溶液澄清，然后用1M的NaOH調節pH到2.2。藻酸鹽的制備用去離子水制備新鮮的5mg/ml的所需藻酸鹽(FMC Biopolymer，Drammen，Norway)的溶液，并由該溶液制得2.5mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml和0.05mg/ml的稀釋液。豬胃蛋白酶A的制備每次分析前制備溶解于0.01M鹽酸(HCl)(BDH)中的濃度為0.04mg/ml的新鮮的豬胃蛋白酶A(SIGMA Chemicals，Poole，Dorset)溶液。TNBS的制備將1.5ml 5％也即1M的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)水溶液與20mg的活性炭(BDH)混合，在室溫下放置10分鐘，然后在5000rpm離心下10分鐘。用0.2μm的注射過濾器過濾上清液。該過程除去了TNBS的某些活性化合物和所有的活性炭顆粒，從而使吸光率的讀數更為準確。然后用去離子水將1.1ml所得溶液稀釋到1∶100。N-端基分析法采用N-端基分析法(Lin等，1969，Hutton等，1986和1990)定量分析胃蛋白酶的活性。采用琥珀酰白蛋白基質和豬胃蛋白酶A作為標準物，其對0.1μl的胃蛋白酶很靈敏。在該比色分析法中，N-端基被三苯基化，隨后得到了黃色的絡合物。采用0.01M HCl制備0-200μl的胃蛋白酶溶液，并由此得到標準曲線。采用0.01M HCl制備0、50和100μl的試樣胃蛋白酶溶液，向該測試溶液中加入所需濃度的100μl藻酸鹽。所得到的值每5個分為一組。向每一試管中加入500μl的琥珀酰白蛋白溶液，攪拌使混合并在37℃下孵育30分鐘。加入500μl 4％(w/v)新制備的碳酸氫鈉(NaHCO3)并攪拌該試管，胃蛋白酶的活性受到了抑制。加入500μl TNBS溶液，并在50℃下孵育10分鐘，新形成的N-端基發生了顏色變化。向每一試管加入500μl 10％(w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)(BDH)，以阻止蛋白質沉淀，隨后加入250μl 1.0M的HCl，以阻止顏色的進一步變化。將該試管在室溫下放置1小時使其沉淀。在340nm下測定相對于去離子水的吸光率，并通過與50μl(2.0μg)和100μl(4.0μg)胃蛋白酶的標準曲線對比得出胃蛋白酶活性的抑制率。
表2列出了分析結果。
表22.0μg豬胃蛋白酶A的抑制率
圖1對0.50mg的分析結果作了進一步圖解，該圖清楚地顯示出倒置的U形曲線，它說明了藻酸鹽抑制胃蛋白酶的能力隨其分子量的變化趨勢。
圖2用粘度代替上述分子量，所得曲線也表現為同樣的趨勢。
結果如下表3所示。
表34.0μg豬胃蛋白酶A的抑制率
圖3對0.50mg的分析結果作了進一步圖解，該圖清楚地顯示出倒置的U形曲線，它說明了藻酸鹽抑制胃蛋白酶的能力隨其分子量的變化趨勢。
圖4用粘度代替上述分子量，所得曲線也表現為同樣的趨勢。
分析結果如下表4所示。
表4藻酸鹽H120L、SF200和LF120L對兩種體積的胃液的抑制率
實施例4按下述步驟制備具有如下配方的組合物藻酸鈉LFR 5/60100g碳酸氫鈉 26g碳酸鈣32g磷酸二氫鉀0.6g磷酸氫二鉀5.4g對羥基苯甲酸乙酯 2g對羥基苯甲酸丁酯 0.2g糖精鈉1g香味劑0.7g去離子水 加至1升1.將917ml去離子水加入一攪拌容器并冷卻至約20℃。
2.加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀并攪拌直到溶解。
3.向該混合物中加入防腐劑、碳酸鹽和甜味劑并攪拌5分鐘。
4.在3分鐘內邊攪拌邊加入藻酸鹽。
5.攪拌該混合物30分鐘(10分鐘后加入香味劑)。6.制備過程中控制溫度在22℃(±5℃)。
實施例5 6 7 8 9藻酸鈉LF120 20g 75g20g75g25g藻酸鈉LFR5/6070g 25g70g25g70g藻酸鈉SF120 10g - 10g- 5g碳酸氫鈉 26g 26g26g16g20g碳酸鈣 32g 16g60g32g32g磷酸鉀 0.6g0.6g 0.6g 0.6g 0.6g磷酸氫二鉀 5.4g5.4g 5.4g 5.4g 5.4g對羥基苯甲酸乙酯 2.0g2.0g 2.0g 2.0g 2.0g對羥基苯甲酸丁酯 0.2g0.2g 0.2g 0.2g 0.2g糖精鈉 1.0g1.0g 1.0g 1.0g 1.0g香味劑 0.7g0.7g 0.7g 0.7g 0.7g去離子水 1升 1升1升1升1升
權利要求
1.藻酸鹽在抑制哺乳動物胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的藥物組合物制備中的應用，所述藻酸鹽的分子量低于400,000。
2.權利要求1的應用，其中的藻酸鹽為藻酸的一價鹽。
3.權利要求2的應用，其中的藻酸鹽為藻酸鈉。
4.權利要求1到3任一項的應用，其中的藻酸鹽的分子量低于380,000。
5.權利要求1到4任一項的應用，其中的藻酸鹽的分子量高于30,000。
6.權利要求1到5任一項的應用，其中的藻酸鹽的分子量為40,000到350,000。
7.權利要求1到6任一項的應用，其中的胃蛋白酶是豬胃蛋白酶、馬胃蛋白酶、鼠胃蛋白酶、綿羊胃蛋白酶、牛胃蛋白酶或人胃蛋白酶。
8.權利要求1到7任一項的應用，其中藻酸鹽的1％重量分數的水溶液在20℃用Brookfield RVT粘度計采用3號錠子在20r.p.m.下測定所得的粘度小于600mPa.s。
9.權利要求8的應用，其中藻酸鹽的粘度小于550mPa.s。
10.藻酸鹽抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的應用，其中藻酸鹽的分子量低于400,000。
11.藻酸鹽在制備藥物組合物中的應用，所述藥物組合物可保護食管不致發生由胃蛋白酶引起的疾病或損傷。
12.權利要求11的應用，該應用可治療或防止巴雷特食管或食管癌。
13.上述權利要求中任一項的應用，其中的藻酸鈉以液體形式的藥物制劑提供。
14.權利要求13的應用，其中的液體藥物制劑按單位劑量形式包裝為單獨的小袋。
15.一種保護食管不發生由胃蛋白酶引起的疾病或損傷的方法，所述方法包括給患者施用口服有效劑量的分子量低于400,000的藻酸鹽。
16.一種包括至少三種不同級別的藻酸鹽的藥物組合物，其中至少一種藻酸鹽的分子量小于400,000，優選從40,000到350,000，更優選100,000到300,000，最優選200,000到255,000，以及至少一種藻酸鹽的甘露糖醛酸與古洛糖醛酸的MG之比不大于0.6∶1，以及至少一種藻酸鹽的MG之比至少為1。
17.根據本發明的藻酸鹽在藥物組合物的制備中的應用，該應用基本上如說明書所述或所例舉的。
18.根據本發明的藻酸鹽在抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性中的應用，該應用基本上如說明書所述或所例舉的。
19.一種保護食管不發生由胃蛋白酶引起的疾病或損傷的方法，該方法基本上如說明書所述或所例舉的。
20.權利要求16的藥物組合物，該組合物基本上如說明書所述或所例舉的。
全文摘要
某些藻酸鹽表現出優異的抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的能力。具體地說，用N－端基分析測定發現，分子量為40,000到350,000的藻酸鹽表現出優異的抑制胃蛋白酶和/或胃液的蛋白分解活性的能力，該抑制能力增加了50％以上。
文檔編號A61P1/04GK1430517SQ01809779
公開日2003年7月16日 申請日期2001年5月17日 優先權日2000年5月19日
發明者彼得·威廉姆·德埃忒瑪, 弗蘭克·C·漢普森, 安德魯·邁克爾·森德蘭, 杰弗里·彼得·皮爾森 申請人:雷克特本克斯爾保健(英國)有限公司