使用具有preptin功能的化合物的方法

專利名稱：使用具有preptin功能的化合物的方法
技術領域：
本發明涉及可用作間充質細胞來源細胞的增殖、增加和分化試劑的化合物，和及涉及含有這種化合物作為活性成分的組合物。更特別地，本發明涉及生物活性化合物，包括preptin，preptin類似物和preptin激動劑，以及它們的鹽和衍生物，這些化合物的新用途，含有這些化合物的藥物組合物，以及使用這些化合物的方法。化合物的新用途涉及它們的刺激細胞增殖和分化的能力，這些細胞包括成纖維細胞和胰腺β-細胞以及它們的細胞前體，并且包括這些化合物在各種疾病、紊亂和癥狀中的用途，包括用于治療患有糖尿病的人和用于內部和外部創傷愈合的應用。
背景技術：
胰島β-細胞在生理學中起重要作用，包括分泌胰島素，胰島素是一種肽激素，對中間代謝產生重要作用。糖尿病的特征在于高血糖癥和β-細胞功能被改變。1型糖尿病的特征在于由于胰島β-細胞的自體免疫被破壞，胰腺就早期缺乏內分泌功能，導致低胰島素癥和高血糖癥。2型糖尿病是一種由遺傳因子與環境影響之間相互作用產生的多基因的、異質性疾病。參見，例如，Kecha-Kamoun等(2001)Diabetes MetabRes Rev，17146-152。雖然2型糖尿病最初表現為高胰島素癥，但是由于缺乏β-細胞功能以及最終β-細胞衰竭，導致胰島素水平最終下降。從正常的葡萄糖耐受進展到葡萄糖耐受降低，到2型糖尿病，和到晚期2型糖尿病，都與β-細胞功能改變、β-細胞減少和最后胰島素分泌下降相關。參見，例如Dickson等(2001)J.Biol.Chem.，27621110-21120。
胰島β-細胞是糖尿病研究的核心。β-細胞是分泌胰島素來滿足其他組織的代謝需求的葡萄糖反應細胞。外周胰島素抵抗以及產生的高血糖癥表征了2型糖尿病。β-細胞通常以提高胰島素分泌能力和β-細胞質量來彌補胰島素抵抗。但是由于β-細胞不能維持足以克服逐漸升高的對胰島素的抵抗的胰島素生成水平，高血糖癥進一步惡化(Kaytor等(2001)J Biol Chem.1616)。最后，β-細胞的衰退主要是功能衰竭，但是最后發展為β-細胞減少，如在1型糖尿病中所見的那樣。
最顯著的功能性β-細胞缺陷之一是缺乏急性葡萄糖誘導的胰島素分泌(GIIS)。β-細胞最初適應逐漸升高的對胰島素需求，但是當2型糖尿病惡化時，發生代謝失調。一種假設是β-細胞能夠去分化，導致特化功能喪失，例如GIIS。β-細胞的去分化作用已經在部分胰腺切除的大鼠模型中被報道，該模型包括胰島素基因表達降低(Weir等(2001)Diabetes，50副刊1，S154-S159)。
完整的信號事件網絡按照控制β-細胞質量以適應對胰島素的需求來起作用。一些證據表明β-細胞生長增強部分地是在于循環生長因子。參見，例如，Flier等(2001)Proc.Natt.Acad.Sci.USA，987475-7480，其中報道將正常胰島植入胰島素抵抗小鼠的胰腺或腎囊中會引起β-細胞質量的顯著增加。
鑒定相關生長因子以及刺激內源生長路徑的用途將會被用于增加，例如β-細胞質量。已經報道在多個糖尿病的動物模型中進行增加β-細胞質量的嘗試。參見，例如，Efrat，S.(2001)Diabetes，50副刊1S189-S190；和Tourrel等(2002)Diabetes，511443-1452。
一般認為，在胎兒期中，胰島素樣生長因子2(IGF-II)在細胞生長和胰腺分化中起重要作用。IGF-II局限在哺乳動物胎兒和成體胰腺中，在胰島導管上皮、β-細胞前體中被表達(Ilieva等(1999)Pancreas，19297-303)。在成人胰腺中，僅在β-細胞和導管細胞中發現IGF-II的免疫反應性(Portela-Gomes等(2000)Journal of Endocrinology，165245-251)。Preptin是一種34個氨基酸的肽，被報道是與胰島素原樣生長因子II(pro-IGF-II)的Asp69-Leu102相對應，存在于胰島的β-細胞內，與胰島素一起發生由葡萄糖介導的共分泌。參見Cooper和Buchanan，“具有Preptin功能性的肽”，WO 00/78805(PCT/NZ00/00102)。已經報道Preptin能增強、但不是起始胰島素分泌。參見Buchanan等(2001)Biochem.J.360431-439。
發明概述本發明部分地基于發現preptin和其他肽具有能夠例如刺激成纖維細胞和胰島β-細胞增殖的能力。還基于這種化合物能夠促進其他細胞分化為成纖維細胞和胰島β-細胞，例如成纖維細胞和胰島β-細胞的祖細胞，確定這些化合物是有用的。
一個方面，本發明特征在于用于在個體中治療細胞量減少、細胞數量減少和/或細胞功能下降的癥狀的方法。該方法包括給個體施用有效量的preptin、preptin類似物、或preptin激動劑、其鹽以及其衍生物的一種或多種。如在此所用，β-細胞包括胰島β-細胞。
個體可能患有例如與部分β-細胞損失相關的疾病，例如β-細胞缺失少于約80％β-細胞損失。這種疾病的一個例子包括，但是不限于，2型糖尿病。該個體還患有例如與更實質的或完全的β-細胞損失相關的疾病，其特征在于例如小于約80％β-細胞損失。這種疾病的一個例子包括，但是不限于，1型糖尿病和晚期的2型糖尿病。
如在此所用，“preptin”是被分離的、純的或被純化的，或者實質上純的，長34個氨基酸的肽，其序列包括下面的公式(I)顯示的序列及其類似物1 510 15 20Asp Val Scr Thr R1R2R3Val Leu Pro Asp R4Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe R5R6Asp Thr Trp R7Gln Ser R8R9Arg Len Formula(I)公式(I)其中R1為Ser或Pro，或它們的保守取代變體；R2為Gin，或Pro或者它們的保守取代變體；R3為Ala或Thr，它們的保守取代變體；R4為Asp或Asn，或它們的保守取代變體；R5為Gln或Lys，或它們的保守取代變體；R6為Tyr或Phe，或它們的保守取代變體；R7為Arg或Lys，或它們的保守取代變體；R8為Ala或Thr，或它們的保守取代變體；和R9為Gly或Gln，或它們的保守取代變體。
Preptin包括人的preptin，大鼠preptin，以及小鼠preptin，以及它們每一種的等位和種屬變體。人、大鼠和小鼠的preptin的示例性序列被顯示在下面人preptin(SEQ ID NO1)15 10 15 20Asp Val Scr Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Glu Arg Leu大鼠preptin(SEQ ID NO2)1 5 10 15 20Asp Val Ser Thr Scr Gln Val Len Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg Len小鼠preptin(SEQ ID NO3)15 10 15 20Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Len Pro Asp Asp Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys25 30Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln Ser Ala Gly Arg LenPreptin的類似物包括preptin的功能性等價物，例如公式(I)的化合物的功能性等價物。至于preptin本身，功能性等價物包括與之發生免疫交叉反應并且具有一種或多種preptin功能的蛋白質，例如具有實質上與preptin相同的功能的那些蛋白(例如SEQ ID NO1-3的任何一種)。各種preptin類似物包括，例如包含preptin的C末端截斷，包括preptin 1-33、preptin 1-32、preptin 1-31、preptin 1-30、preptin 1-29、preptin 1-28以及preptin 1-27。其他preptin類似物包括，例如，各種preptin的N末端截斷，包括preptin2-34、preptin3-34、preptin4-34、preptin5-34、preptin6-34、preptin7-34以及preptin8-34。其他類似物包括各種具有N末端截斷和C末端截斷的片段，例如preptin 2-33和preptin 3-32。其他preptin類似物包括包含preptin活性位點的肽。還有屬于本發明的保護范圍內的其他化合物包括具有一個或多個氨基酸取代的preptin和preptin類似物，優選一個或多個保守性氨基酸取代。其他preptin類似物包括preptin或其類似物的添加和刪除的突變體，以及包含、基本上由或由preptin或其片段或突變體與其他氨基酸或肽組成的肽。
“preptin激動劑”是一種化合物，其(1)對preptin結合受體具有高的或其他期望的親合性，例如約10-7-10-9M的Ka，或者約10-8-約10-9M的Ka，或者更高(其可以例如通過受體結合分析來測定，該分析具有例如在Motulsky和Mahan(1984).Mol.Pharmacol.25∶1中所描述的方案)；和/或(2)如同preptin一樣刺激特定細胞增殖，例如成纖維細胞，例如NIH-3T3細胞，或者β-細胞，例如INS-1Eβ-細胞。
本發明的保護范圍內的激動劑包括包含、基本上由或者由(A)preptin或其功能性片段，優選在preptin的N末端直接或間接地連接，(B)對應于IGF-II的全部或部分氨基酸序列(即pro-IGF-II1-68)而組成的化合物。這些肽，即肽(A)和(B)可以間接地通過一個和多個其他氨基酸連接，例如精氨酸殘基。
還有其他激動劑包括包含、基本上由或者由(A)preptin或其功能性片段，優選在preptin的C末端直接或間接地連接，(C)對應于pro-IGF-II103-156的全部或部分氨基酸序列而組成的化合物。這些肽，即肽(A)和(C)可以間接地通過一個和多個其他氨基酸連接，例如精氨酸殘基。
還有其他的激動劑包括包含、基本上由或者由肽(A)和(B)和(C)以任何組合直接地或間接地組成的化合物。因此，這種肽包括，例如肽(B)被直接或間接地連接到肽(A)上，依次被直接或間接地連接到肽(C)上；肽(A)被直接或間接地連接到肽(B)上，依次被直接或間接地連接到肽(C)上；肽(B)被直接或間接地連接到肽(C)上，依次被直接或間接地連接到肽(A)上；等等。
還有其他的激動劑包括包含preptin的全部，即34個氨基酸的序列的pro-IGF-II的片段。
另外地，例如preptin激動劑可以是包含、基本上由或者由少于約87個氨基酸或者超過20個氨基酸組成，以及在連續序列中含有SEQ IDNO1、2或3部的任何部分或全部，優選全部的肽。在另一個例子中，preptin激動劑可以是包含、基本上由或者由少于約87個氨基酸或者超過35個氨基酸組成的，以及在連續序列中含有的SEQ ID NO1、2或3的任何部分或全部，優選全部的肽。
在一個實施方案中，本文描述的方法包括給個體施用有效量的preptin，該preptin包含、基本上由或者由公式(I)或者SEQ ID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列組成。
在一個實施方案中，本文描述的方法包括給個體施用有效量的preptin，該preptin是公式(I)的肽的任何之一或者SEQ ID NO1、2或3的等位的或種屬的變體。
在另一個實施方案中，本文描述的方法包括給個體施用有效量的preptin類似物，包括，例如，包含、基本上由或者由公式(I)或者SEQ ID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列組成的preptin的類似物。
在另一個實施方案中，該方法包括給個體施用有效量的preptin激動劑。該實施方案包括給個體施用有效量的含有與公式(I)或者SEQID NO1、2或3至少約60％相同的氨基酸序列的preptin激動劑(例如至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％到至少約98％，或者至少約99％)。
在還有另一個實施方案中，該方法包括給個體施用有效量的含有具有多達14個保守氨基酸取代的SEQ ID NO1、2或3的preptin激動劑。
在另一個方面，本發明特征在于用于增加或維持β-細胞質量的方法。該方法包括給需要此的個體施用有效量的在此描述的preptin，preptin類似物preptin激動劑。如在此所用，該個體可能具有實質上正常的β-細胞質量、被增加的β-細胞質量、降低的β-細胞質量或者該個體可能具有β-細胞減少或功能障礙的危險。在還有一個方面，本發明特征在于用于刺激β-細胞生長或者增加β-細胞數量的方法。不期望受到任何特定理論或作用機制的約束，這種刺激或增加可以是例如通過細胞分化或者再生。該方法包括給需要此的個體施用有效量的一種或多種preptin，preptin類似物或preptin激動劑，或者它們的任何一種的一種或多種鹽或衍生物。
在另一個方面，本發明涉及在個體中治療完全或部分地受β-細胞調節的任何疾病、紊亂或癥狀，完全或部分地涉及β-細胞的任何疾病、紊亂或癥狀，和特征在于完全或部分地由于β-細胞功能障礙的任何疾病、紊亂或癥狀，和從增強β-細胞功能獲益的任何疾病、紊亂或癥狀的方法，包括給個體施用有效量的preptin，preptin類似物，或preptin激動劑，或者它們的任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種。Preptin包括公式(I)或者SEQ ID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列。Preptin激動劑包括，例如，SEQID NO1、2或3的任何之一的氨基酸序列的片段或全部。
另一個方面是在個體中提高胰島素分泌的方法，包括給個體施用有效量的preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種。該個體例如是胰島素生成或功能下降的個體(例如胰島素抵抗或β-細胞質量減少，或β-細胞功能降低，或例如被診斷為糖尿病)。在一個方面，該方法包括提高由個體β-細胞分泌胰島素或者提高個體的β-細胞中的胰島素分泌，或者增加其β-細胞質量或者增加細胞數量。
在另一個方面，在此描述的方法包括確定個體需要調節(例如增加，維持等)β-細胞質量、β-細胞數量、β-細胞生長或β-細胞功能。通過對細胞量、細胞功能或細胞數量的直接或間接分析或者評價或預測，確定個體狀態可以是主觀的(例如個體或衛生保健醫生的觀點，或者基于觀察值或其他總體癥狀或參數)或者客觀的(例如可通過檢測或診斷標記測定)。
在另一個方面，本發明提供用有效量的preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種來治療β-細胞質量、數量或功能下降的方法。
在另一個方面，本發明提供用preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種來增加或維持β-細胞質量、數量或功能的方法。
本發明特征還在于一種加工產品，其包括含有preptin，preptin類似物，或preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種的容器，和使用這些內容物來治療包括，例如，β-細胞質量、數量或功能下降(相對于正常的β-細胞質量、數量或功能，或者指示低于正常的β-細胞質量、數量或功能的其他診斷結果)的疾病的說明書，包括，給個體施用有效量的preptin，preptin類似物，或preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種。
在本發明保護范圍內的還有一種加工產品，其包括包裝材料；和包裝材料內含有preptin，preptin類似物，或preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種。該包裝材料包括一個指示被用于在個體內治療癥狀的內容物的標簽，這些癥狀例如由β-細胞減少或功能紊亂介導的癥狀(例如1型或2型糖尿病)。在另一個方面，該標簽包括劑量信息。
在另一個方面，本發明涉及有效量的preptin，preptin類似物，或preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種，與或不與其他材料或原料(無論是，例如，其他活性成分、賦形劑、稀釋劑等，和/或無論是一個劑量單位的容器)在加工有效用于本發明的方法或者用于在此描述或提供的任何目的的劑量單位的用途。
在還有一個方面，本發明還提供preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種在治療各種損傷的任何一種中的用途，包括創傷。可以用preptin，preptin類似物，或preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的一種或多種治療的創傷種類的例子包括，但是不限于化學燒傷或熱燒傷；皮膚移植供體和移植部位；皮膚潰瘍，包括但是不限于褥瘡潰瘍、糖尿病潰瘍、血管阻塞潰瘍和漸進性壞死脂性(lipoidicum)潰瘍；手術創傷，創傷性開裂(wound dehiscence)，包括但是不限于腹部、大腿和胸部；角膜損傷與移植；拔牙和口腔手術；粘膜破壞，包括但是不限于胃腸道(例如潰瘍性大腸炎和Crohn病)和膀胱；以及大量其他創傷性破壞和皮膚或結締組織斷裂的任何一種，例如擦傷。
被設計用于局部施用的本發明的特定優選制劑，例如，包括藥膏、面霜和凝膠。用于本發明的優選局部制劑是藥膏。
在另一個方面，本發明提供用于治療在個體中或上的損傷或創傷的方法，其包括對所述損傷或創傷或者所述個體應用或施用包含有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的化合物的組合物。優選地，所述個體是人。其他個體可以是非人類，包括家養的和經濟動物。所述組合物包括，但是不限于，藥膏、面霜和凝膠。
可以按照本發明被治療的創傷的例子包括，但是不限于，(1)其中皮膚或其他外表面被撕裂、刺穿、切割或其他破裂的創傷；(2)其中肌肉被穿破而下面的骨骼或重要器官未被破壞或實質上未被破壞的創傷；(3)皮膚表面損傷。在另一個實施例中，創傷包括內出血。
在另一個方面，本發明提供一種用于增強創傷愈合的方法，其包括例如，將一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的化合物體表或體內應用于這種創傷。
在另一個方面，本發明提供用于在個體內治療癥狀的方法，通過應用或施用促進間充質細胞來源的細胞的增殖和/或細胞質量的化合物，其改進包括給所述個體施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的一種或多種鹽或衍生物的化合物。間充質細胞來源的細胞包括，但是不限于，成纖維細胞。
在另一個方面，本發明提供施用包含有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑的化合物的組合物，來治療和/或預防外周神經系統損傷、Alzheimer病、肌萎縮性(脊髓)側索硬化、帕金森病等、肌肉萎縮癥、糖尿病神經病和心肌病變(myocardiopathies)包括心肌炎和心肌梗塞、心臟病，和急性發作(acute attack)，以及由缺血引起的急性腎功能不全的一種或多種。
在另一個方面，本發明提供施用包含有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的鹽或衍生物的化合物的組合物，來減少運動神經元的細胞死亡、增加肌肉終板、促進受損的坐骨神經的功能恢復、防止化學治療中出現的外周運動麻痹，以及改善心肌功能。
在另一個方面，本發明提供通過應用或施用促進生長的化合物用于在個體內促進組織生長的方法，其包括給所述個體用于或施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的鹽或衍生物的化合物。優選組織的例子是結締組織和/或上皮組裝和/或胰腺組織。
在另一個方面，本發明提供通過應用或施用改善免疫功能的化合物來提高個體內的免疫功能的方法，其包括給所述個體應用或施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的鹽或衍生物的化合物。本發明的這個方面的一個例子包括改善淋巴細胞的增殖。
在另一個方面，本發明還提供多核苷酸或載體(包括克隆載體和表達載體)或者被轉化或被轉染的細胞，包括被分離的或被純化的或純的多核苷酸、載體和被分離的、被轉化和被轉染的細胞，編碼或包含上述或者本文描述的本發明的多肽或肽的任何一種的構建體，例如，包括類似物、片段、激動劑和融合蛋白。因此，在各種實施方案中，本發明提供包含被可操作地連接到啟動子的任何這種多核苷酸的重組克隆或表達構建體。
在其他實施方案中，提供用任何這種重組克隆或表達構建體轉化或轉染的，或者另外含有任何這種重組克隆或表達構建體的宿主細胞。宿主細胞包括進行了離體細胞治療的個體的細胞，包括，例如，用于β-細胞紊亂或燒傷或其他創傷的離體細胞治療。
在相關實施方案中，提供制備本發明的多肽或蛋白質或其他構建體的方法，例如包括preptin，preptin類似物和/preptin激動劑蛋白，包括步驟(a)在允許構建體例如preptin類似物或融合蛋白表達的條件下，培養在此描述或提供的宿主細胞；和(b)從宿主細胞和宿主細胞培養物中分離構建體，例如preptin，preptin類似物，和/preptin激動劑蛋白。
在另一個實施方案中，本發明提供一種藥物組合物，其包含例如，被分離的、被純化的或純的編碼本發明的多肽或蛋白質構建體的任何一種的多核苷酸，例如(包括，例如，preptin類似物，激動劑，和/或融合蛋白)，與生理上可接受的載體組合，或者例如與基因治療釋放媒介物(vehicle)或載體組合或結合在其中。
本發明的其他特征、目的和優點將顯而易見地從說明書和附圖以及從權利要求書中知曉。
附圖簡介附

圖1顯示preptin對NIH-3T3成纖維細胞增殖的劑量依賴作用(通過含氚胸苷攝取來測定)。
附圖2比較preptin、GLP-1和IGF-II對INS-1E β-細胞增殖的作用(通過含氚胸苷攝取來測定)。
發明詳述本發明涉及preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或它們任何一種的鹽或衍生物的一種或多種用于刺激間充質細胞來源細胞例如成纖維細胞的增殖或表達和/或細胞質量或功能，以及用于刺激β-細胞生長增殖或增加β-細胞質量和/或功能的用途。不期望受任何特定理論或作用機制的約束，這種刺激或增加可以是，例如，通過細胞分化或再生來實現。
Preptin可以按照Buchanan等(2001)Biochem.J.360431-439的方式從胰島β-細胞中分離。Preptin和preptin類似物和激動劑以及它們的鹽和衍生物也可以采用合成方法來制備。肽及其鹽和衍生物的合成，包括固相和液相肽合成，在本領域已經完整地建立。參見，例如Stewart等(1984)固相肽合成(第二版)；和Chan(2000)“Fmoc固相肽合成，實用方法”，牛津大學出版社。可以采用自動肽合成儀(例如PioneerTM肽合成儀，Applied Biosystems，Foster City，CA)來合成肽。例如，在甲基苯氫胺(methylbenzyhydrylamine)樹脂上制備肽，接著通過氟化氫去保護，并從樹脂上裂解。
用于本發明的蛋白質和肽還可以通過重組方法來制備。本發明提供能夠引導可用于本發明的蛋白質和肽的表達的重組表達構建體。存在于在此提及的各種氨基酸序列中的氨基酸根據其熟知的三字母或單字母縮寫被鑒定。存在于在此提及的各種DNA序列或其片段中的核苷酸用本領域常規使用的標準單字母命名來命名。特定的氨基酸序列還可以包含類似、但被改變的氨基酸序列，例如僅具有較少變化的那些，例如用于說明而不是限制，共價化學修飾、插入、刪除和取代，其可能還包括保守性取代或非天然氨基酸的取代。相互類似的氨基酸序列可能共有實質上的序列相同的區域。同樣地，核苷酸序列可能包含具有較小變化的實質上相似的核苷酸序列，例如用于說明而不是限制，共價化學修飾、插入、刪除和取代，其可能還包括由于遺傳密碼的簡并性產生的沉默突變。相互類似的核苷酸序列可能共有實質上的序列相同的區域。
如在此所用，“氨基酸”是具有中心碳原子(alpha(α)碳原子)被連接到氫原子、羧酸基團(其碳原子在此被稱作“羧基碳原子”)、氨基基團(其氮原子在此被稱作“氨基氮原子”)和側鏈基團R上的分子。當被結合到肽、多肽或蛋白質中時，在將氨基酸連接到另一個氨基酸上的脫水反應中，氨基酸失去其氨基和羧基基團的一個或多個原子。結果，當被結合到蛋白質時，氨基酸被稱作“氨基酸殘基”。在為天然蛋白質的情況下，氨基酸殘基的R基團將20種氨基酸與它們通常形成的蛋白質區別，雖然在被結合到蛋白質后，一個或多個氨基酸殘基在生物系統中被衍生化或修飾(例如通過糖基化和/或通過氧化兩個非鄰近的半胱氨酸氨基酸殘基的硫醇側鏈來形成胱氨酸，生成在穩定蛋白質的折疊構型中起重要作用的二硫化物共價鍵，等)。本領域技術人員可以預期，非天然氨基酸也可以被結合到蛋白質中，特別是那些通過合成方法，包括固相和其他自動合成方法制備的蛋白質。這種氨基酸的例子包括，不限于，α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、L-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、citralline、磺基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基精氨酸、苯基甘氨酸、環己基精氨酸、β--精氨酸、氟-氨基酸、designer氨基酸(例如，β--甲基氨基酸、α-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸)和氨基酸類似物。此外，當α-碳原子具有四種不同基團(情況是除了甘氨酸外，20種氨基酸被生物系統利用來合成蛋白質，甘氨酸具有被結合到α-碳原子上的兩個氫原子)時，各種氨基酸存在兩種不同異構形式，稱作D和L。在哺乳動物中，僅L氨基酸被結合到天然多肽中。本發明包括結合一種或多種D-和L-氨基酸的蛋白質，以及由僅D-或L-氨基酸殘基的蛋白質。
在此，如下的縮寫被用于如下氨基酸(及其殘基)丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；組氨酸(His，H)；異亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；賴氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；絲氨酸(Ser，S)；蘇氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和纈氨酸(Val，V)。非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、esparagine和谷氨酰胺。正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
“蛋白質”或“肽”是指通過肽鍵連接的兩種或多種單個氨基酸(無論是否是天然的)的任何聚合物，當被結合到氨基酸(氨基酸殘基)的α碳原子上的羧酸基團的羧基碳原子被共價結合到結合在鄰近氨基酸的α碳原子上的氨基基團的氨基氮原子上時發生連接。術語“蛋白質”在其含義中被理解為包括術語“多肽”和“肽”(有時，它們在此被交換使用)，反之亦然。此外，包含多個多肽亞基或其他組分的蛋白質也被解釋為被包括在在此所用的“蛋白質”的含義中。類似地，蛋白質、肽和多肽的片段也在本發明的保護范圍內，并且在此稱作“蛋白質”。
在生物系統中(可以是體內或體外系統，包括無細胞系統)，特定蛋白質的特定氨基酸序列(即按照從氨基末端到羧基末端來書寫的多肽的“一級結構”)通過mRNA的編碼部分的核苷酸序列來確定，核苷酸序列是通過遺傳信息通常為基因組DNA來劃分(用于本發明的目的，基因組DNA被理解為包括細胞器DNA，例如線粒體DNA和葉綠體DNA)。當然，組成特定生物體的基因組的任何類型的核酸(例如在大多數動物和植物中的雙鏈DNA，一些病毒中的單鏈或雙鏈RNA等)被理解為編碼特定生物體的基因產物。信使RNA在核糖體中被翻譯，核糖體催化游離氨基酸聚合，氨基酸的特定身份通過被翻譯為初始多肽的mRNA的特定密碼子來劃分(對于mRNA來說，是mRNA編碼區中的三個鄰近的A，G，C，或U核苷酸)。DNA重組技術使得可以大規模合成具有與在活生物體中天然生成相同的一級序列的蛋白質和多肽(例如人胰島素、人生長激素、促紅細胞生成素、粒細胞菌落刺激因子等)。此外，這種技術可以合成這些或其他蛋白質的類似物，這些類似物與天然蛋白質相比含有一個或多個氨基酸刪除、插入和/或取代。DNA重組技術還可以合成全新的蛋白質。
在非生物系統中(例如，采用固相合成的系統)，蛋白質的一級結構(還包括二硫化物(胱氨酸)鍵定位)可以由用戶確定。結果，獲得具有與生物制備的蛋白質相同的一級結構的多肽，還可以獲得這種蛋白質的類似物。此外，還可以合成全新的多肽，蛋白質中可以結合非天然的氨基酸。
術語“基因”是指涉及制備多肽鏈的DNA的區段；其可能還包括多肽編碼區域前后的區域，例如，“先導和尾部”以及在相關的各個編碼區段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
如在此所描述，本發明提供完全地或部分地通過具有preptin編碼序列的核酸編碼的肽，preptin編碼序列被融合或者另外地在讀框內被連接到其他天然的或工程化的序列上，來表達被融合或者另外地被連接到其他功能性多肽序列上的多肽序列，例如，用于說明而不是限制，使得可以刪除、功能性改變、分離和/或純化融合蛋白。
多肽修飾可以通過本領域技術人員知曉的任何方法來實現。在此優選方法依賴于修飾編碼例如preptin蛋白，類似物或激動劑的DNA，以及被修飾的DNA的表達。編碼本發明的肽構建物之一的DNA可以采用標準方法來改變或誘變，包括在下文描述的那些方法。
氨基酸的保守取代是熟知的，并且可以不改變生成的蛋白質分子的生物活性來進行。例如，這種取代通常可以通過極性殘基、帶電荷殘基、疏水殘基、小殘基等之間進行交換來進行。如果需要，這種取代可以通過在體外生物分析中僅僅檢測生成的被修飾蛋白質結合適當細胞表面受體，或者結合適當抗體或期望的目標分子的能力來經驗性地確定。
本發明還涉及雜交到本發明的構建體上的核酸，構建體包括例如，在此提供的編碼preptin，preptin類似物和/preptin激動劑的多核苷酸序列或者其互補物，如果這些序列之間具有至少約70％，或至少約80-85％，或至少約90％，或至少約95％，96％，97％，98％或99％的同一性，這對于熟悉本領域的人員來說是顯而易見的。
本發明特別涉及在嚴緊條件下雜交到，例如在此提及的preptin，preptin類似物和/preptin激動劑的編碼核酸上的核酸。如在此所用，特定嚴緊條件下的“雜交”被用于描述兩條單鏈核酸分子之間形成的雜合體的穩定性。雜交的嚴緊性通常表示為雜合物被退火和洗滌的離子強度和溫度的條件。術語“嚴緊條件”是指多核苷酸之間能夠雜交的條件。嚴緊條件可以用鹽濃度、有機溶劑(例如甲酰胺)濃度、溫度定義，并且其他條件在本領域是熟知的。特別地，可以通過降低鹽濃度，提高有機溶劑(例如甲酰胺)的濃度，或者提高雜交溫度來提高嚴緊性。例如，嚴緊性鹽濃度通常小于約750mM NaCl和75mM檸檬酸三鈉，優選小于約500mM NaCl和50mM檸檬酸三鈉，和最優選小于約250mM NaCl和25mM檬酸三鈉。低嚴緊性雜交可以在缺乏有機溶劑，例如甲酰胺下實現，而高嚴緊性雜交可以在存在有機溶劑(例如，至少約35％甲酰胺，最優選至少約50％甲酰胺)下實現。嚴緊的溫度條件通常包括至少約30℃的溫度，更加優選至少約37℃，和最優選至少約42℃。各種其他參數，例如，雜交時間、去垢劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度，和包含或去除載體DNA，對于本領域技術人員來說是熟知的。根據需要通過組合這些各種條件來達到不同程度的嚴緊性，這是本領域的常規技術。其他典型的“高度”、“中度”和“低度”嚴緊性包括如下條件或者等同的條件高度嚴緊性0.1 x SSPE或SSC，0.1％SDS，65℃；中度嚴緊性0.2 x SSPE或SSC，0.1％SDS，50℃；和低度嚴緊性1.0 x SSPE或SSC，0.1％SDS，50℃。如本領域技術人員所知曉，可以通過改變時間，溫度，用于預雜交、雜交的溶液的濃度和洗滌步驟，來達到改變雜交條件的嚴緊性，而且合適的條件可能還部分地取決于所用探針的和被印跡的先驗者(proband)的核酸樣本的特定核酸序列。因此，可以預期，可以容易地選擇合適的嚴緊條件，而無需過度的試驗，其中可以根據探針雜交一種或多種特定先驗者序列而不雜交到特定的其他先驗者序列的能力來確定該探針的期望選擇性。
如在此所用，優選的“嚴緊條件”通常是指僅當序列之間具有至少約90-95％，或至少約97％同一性時發生的雜交。在優選實施方案中，雜交到例如在此提及的preptin，preptin類似物，和/或preptin激動劑的編碼核酸的核酸構建體，編碼實質上保留與例如由cDNA編碼的preptin，preptin類似物，和/或preptin激動劑相同生物學功能或活性的多肽。
本發明的核酸，在此也被稱作多核苷酸，可以是RNA形式，例如mRNA，或DNA形式，該DNA包括cDNA(也稱作“互補DNA”，是與特定信使RNA互補的DNA分子)、基因組DNA和合成的DNA。DNA可以是雙鏈的或者單鏈的，如果為單鏈DNA，則可以是編碼鏈或者非編碼(反義)鏈。編碼用于本發明的preptin的編碼序列，例如，可以含有與本領域已知的或者在此描述其中部分的編碼序列相同的部分，或者可以是不同的編碼序列，其由于遺傳密碼的冗余(redundancy)和簡并性，編碼相同的構建體或其部分，包括preptin，preptin類似物，和/或preptin激動劑蛋白質的全部或部分。
編碼按照本發明使用的用于本發明的構建體的核酸包括，但是不限于只有編碼preptin的序列。術語編碼preptin的“核酸”或者“多核苷酸”，例如，包括僅包括例如preptin多肽的編碼序列的核酸，以及包括其他編碼和/或非編碼序列的核酸。
如在此描述使用的核酸和寡核苷酸可以通過本領域技術人員知曉的任何方法來合成(參見，例如WO 93/01286，美國專利申請07/723,454；美國專利5,218,088；美國專利5,175,269；美國專利5,109,124)。各種寡核苷酸和核酸序列的鑒定還涉及本領域知曉的方法。例如，可用于克隆的寡核苷酸的期望特性、長度和其他特征是熟知的。在某些實施方案中，合成的寡核苷酸和核酸序列可以被設計成含有如下連接來抵抗內源性的宿主細胞核酸酶的降解硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸鹽、羰基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯和被證明可以用于反義應用中的其他連接。參見，例如Agrwal等，Tetrehedron Lett.283539-3542(1987)；Miller等，J.An.Chem.Soc.936657-6665(1971)；Stec等，Tetrehedron Lett.262191-2194(1985)；Moody等，Nucl.Acids Res.124769-4782(1989)；Uznanski等，Nucl.Acids Res.(1989)；Letsinger等，Tetrahedron40137-143(1984)；Eckstein，Anml.Rev.Biochem.54367-402(1985)；Eckstein，Trends Biol.Sci.1497-100(1989)；Stein寡核苷酸.基因表達的反義抑制劑，Cohen編輯，MacmillanPress，倫敦，97-117(1989)；Jager等，Biochemistry 277237-7246(1988)。
在此所用，“缺失”具有如熟悉本領域的人員所理解的通常含義，并且例如為在此提供的截斷分子的情況下，可以指相對于相應的全長分子缺少來自末端或者非末端區域的序列的一個或多個部分。截斷分子為線性的生物聚合物，例如核酸分子或者多肽，可能在分子的任意異端具有一個或多個缺失和/或在分子的非末端區域具有一個或多個缺失。
本發明還涉及在此提及的核酸的變體，這些核酸編碼本發明的構建體的片段、類似物和/或衍生物，例如preptin多肽。編碼本發明的構建體的核酸的變體可以是其中包括的核酸序列的一個或多個部分的天然等位變體，或者這種序列或部分的非天然變體，包括采用例如本領域已知的用于改變序列的方法通過分子工程化改變的序列。如本領域所知曉，等位變體是核酸序列的可替代形式，其具有至少一個或多個核苷酸的取代、刪除或添加的一種，任何一種變化不會實質上或不期望地改變被編碼的pretin、preptin類似物和/或preptin激動劑的功能。
本發明的構建體的變體和衍生物，例如preptin蛋白質，可以通過突變編碼例如pretin、preptin類似物和/或preptin激動劑多肽或其任何部分的核苷酸來獲得。改變天然氨基酸序列可以通過大量常規方法的任何一種來實現。可以在特定基因座上導入突變，例如通過合成含有突變序列的寡核苷酸，突變序列與確保連接到天然序列片段上的限制性位點側面連接。連接后，生成的重組序列編碼具有期望氨基酸插入、取代或刪除的類似物。
可選擇地，可以使用例如寡核苷酸定點特異性誘變方法產生被改變的基因，其中預先確定的密碼子可以通過取代、刪除或插入來改變。進行這種改變的示例性方法被公開在Walder等，1986 Gene 42133；Bauer等，1985 Gene 3773；Craik，1985年1月BioTechniques12-19；Smith等，1985年1月遺傳工程原理和方法BioTechniques12-19；Costa GL，等，“利用快速PCR方法的定點誘變”1996 MethodsMol Biol.57239-48；Rashtchian A.，“采用聚合酶鏈式反應的克隆和遺傳加工基因的新方法，”1995 Curr Opin Biotechnol.6(1)30-6；Sharon J，等，“抗體結合位點的寡核苷酸引導誘變，”1993 Int RevImmunol.10(2-3)113-27；Kunkel，1985 Proc.Natl.Acad Sci.USA82488；Dunkel等，1987 Methods in Enzymol.154367；和美國專利4,518,584和4,737,462。
作為例子，可以通過定點誘變編碼蛋白質的DNA結合使用DNA擴增方法來進行DNA修飾，DNA擴增方法采用引物在DNA模板中導入和擴增改變，例如通過重疊延伸的PCR剪切(SOE)。定點誘變通常使用具有單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體來實現，例如M13噬菌體載體，其是熟知的并且可以購買得到。也可以使用含有單鏈噬菌體復制起點的其他合適載體。參見例如Veira等，1987 Meth.Enzymol.153。一般地，定點誘變是通過制備編碼目標蛋白(例如特定結合preptin，preptin類似物，和/preptin激動劑蛋白質的全部或組成部分)的單鏈載體來進行。在與單鏈載體中的DNA同源的區域中含有期望突變的寡核苷酸引物被退火到載體上，接著結合上DNA聚合酶，例如E.coliDNA聚合酶I(Klenow片段)，該酶利用雙鏈區域作為引物來生成異源雙鏈核酸分子，其中一條鏈編碼被改變的序列，另一條為原始序列。異源雙鏈核酸分子被導入適當的細菌細胞中，選擇包括期望突變的克隆。獲得的改變的DNA分子可以在合適的宿主細胞中重組表達以產生修飾的蛋白質。
本發明還包括包含編碼添加或取代氨基酸殘基或序列，或者刪除生物活性所不需或不期望有的末端或中間殘基或序列的的等價DNA構建體。
“宿主細胞”或“重組宿主細胞”是含有載體例如表達載體的細胞，或者通過重組技術被另外地加工來表達目標蛋白的細胞。宿主生物體包括那些其中可能進行重組生產本發明的構建體，例如由本發明的重組構建體編碼preptins，preptin類似物和/preptin激動劑的生物體，例如細菌(例如E.coli)、酵母(如釀酒酵母和畢氏酵母(Pichiapastoris))、昆蟲細胞，和哺乳動物細胞，包括體外和體內表達。因此，宿主生物體可能包括在制備本文提供的組合物中用于構建、繁殖、表達或其他步驟的生物體。宿主包括發生如在此所描述的免疫反應的個體。當前，用于制備本發明的用于生產糖基化蛋白質的構建體的優選宿主生物體是哺乳動物細胞或者可以進行糖基化蛋白質表達和回收的其他細胞系統。其他細胞系包括近交鼠品系和鼠細胞系，人細胞和細胞系。
將編碼被用于本發明的期望構建物的DNA構建體導入載體中，例如質粒，用于在適當的宿主細胞中表達。在優選實施方案中，宿主是哺乳動物宿主，例如哺乳動物細胞系。序列優選被密碼子優化來在特定宿主中表達。因此，例如，如果構建物是人preptin或preptin類似物或衍生物或激動劑，并且在細菌中被表達，密碼子被優化為細菌利用。對于小編碼區，基因可以作為單個寡核苷酸被合成。對于大的蛋白質，可以采用多重寡核苷酸剪切、誘變或者本領域技術人員知曉的其他技術。質粒或其他載體中的核苷酸序列是調控區，例如啟動子和操縱子，被可操作地相互連接用于轉錄。編碼期望蛋白質的核苷酸的序列還可以包括編碼分泌信號的DNA，其中生成的肽是前體蛋白。從周質間隙或者發酵液中回收生成的被加工的蛋白質。
在優選實施方案中，DNA質粒可能還包括轉錄終止序列。如在此所用，“轉錄終止區”是發出信號使轉錄終止的序列。完整的轉錄終止子可以從蛋白質編碼基因中獲得，編碼基因可能與插入基因或者啟動子來源相同或不同。轉錄終止子是在此的表達系統的可選擇組分，但是在優選實施方案中被使用。
在此使用的質粒或者其他載體包括與編碼目標蛋白質或者多肽的DNA可操作連接的啟動子，被設計來在上述的合適宿主(例如，細菌、鼠或人)中表達蛋白質，取決于質粒的預期用途(例如，基因治療)。在此用于表達蛋白質和多肽的合適啟動子是可以廣泛獲得的，并且在本領域是已知的。被連接到調控區的誘導型啟動子或者組成型啟動子是優選的。這種啟動子包括，例如，但是不限于，T7噬菌體啟動子和其他的T7樣噬菌體啟動子，例如T3，T5和SP6啟動子，來自E.coli的trp，lpp，和lac啟動子，例如lacUV5；桿狀表達/昆蟲表達系統的P10或多角體蛋白基因啟動子(參見，例如，美國專利5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784)和來自其他真核表達系統的誘導型啟動子。為了表達蛋白質，啟動子被插入到質粒中，可操作地連接控制區，例如lac操作子。
優選的啟動子區域是那些在哺乳動物細胞中是可誘導和具有功能的。細菌表達的合適誘導型啟動子和啟動子區的例子包括，但是不限于對異丙基β--D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；參見Nakamura等，1979 Cell 181109-1117)響應的E.coli lac啟動子；對重金屬(例如鋅)誘導響應的金屬硫蛋白啟動子金屬調控元件(參見，例如，美國專利4,870,009)；對IPTG響應的噬菌體T7 lac啟動子(參見，例如，美國專利4,952,496；和Studier等，1990 Meth.Enzymol.18560-89)和TAC啟動子。根據所用的表達宿主系統，質粒可選擇地包括一種可選擇的標記基因或在宿主中具有功能的基因。因此，例如，可選擇基因包括賦予細菌表型的任何基因，使得被轉化的細菌細胞可以被鑒定并在未被轉化細胞的大群體中可選擇地生長。細菌宿主的合適可選擇標記基因，例如，包括氨卡青霉素抗性基因(Ampr)、四環素抗性基因(Tcr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。目前卡那霉素抗性基因優選被用于細菌表達。
在各種表達系統中，質粒或其他載體還可以包括編碼分泌被可操作地連接的蛋白質的信號的DNA。適合使用的分泌信號可以廣泛地獲得，并且在本領域是已知的。可以采用在E.coli中起作用的原核和真核的分泌信號。根據表達系統，目前優選的分泌信號可以包括，但是不限于，由如下的E.coli基因編碼的那些信號ompA、ompT、ompF、ompC、β-內酰胺酶和堿性磷酸酶等(von Heijne，J.Mol.Biol.18499-105，1985)。此外，可以采用細菌的pelB基因分泌信號(Lei等，J Bacteriol.1694379，1987)、phoA分泌信號和在昆蟲細胞中起作用的cek2。用于某些表達系統的最優選的分泌信號是E.coli ompA分泌信號。還可以采用本領域技術人員知曉的其他原核和真核分泌信號(參見，例如，von Heijne，J.Mol.Viol.18499-105，1985)。采用在此描述的方法，本領域技術人員能夠替換為在酵母、昆蟲或哺乳動物細胞中起作用的分泌信號，以從這些細胞分泌蛋白。
用于E.coli細胞轉化的優選質粒包括pET表達載體(例如pET-11a、pET-12a-c、pET-15b；參見美國專利4,952,496；可購自Novagen，Madison，WI.)。其他優選質粒包括pKK質粒，特別是含有tac啟動子的pKK 223-3(Brosius等，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.816929；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology；美國專利5,122,463、5,173,403、5,187,153、5,204,254、5,212,058、5,212,286、5,215,907、5,220,013、5,223,483和5,229,279)。已經通過用卡那霉素抗性基因替換氨卡青霉素抗性基因來改進質粒pKK。(購自Pharmacia；從pUC4K獲得，參見，例如，Vieira等(1982)Gene 19259-268；和美國專利4,719,179)。桿狀細菌載體，例如pBlueBac(又稱作pJVETL及其衍生物)，尤其是pBlueBacIII(參見，例如，美國專利5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784；購自Invitrogen，San Diego)，可被用在昆蟲細胞中表達多肽。其他質粒包括pIN-IIIompA質粒(參見美國專利4,575,013；還參見Duffaud等，Meth.Enz.153492-507，1987)，例如pIN-IIIompA2。
在其他實施方案中，如果在細菌細胞中一個或多個DNA被復制，一個宿主的例子是E.coli。優選的DNA分子是還包括細菌復制起點的系統，以確保細菌的DNA分子代代相傳。這樣，通過在細菌中復制，生成了大量DNA分子。在該表達系統中，優選的細菌復制起點包括，但是不限于，fl-ori和col E1復制起點。用于這種系統的優選宿主含有編碼T7 RNA聚合酶的DNA的染色體拷貝，被可操作地連接到誘導型啟動子上，例如lacUV啟動子(參見美國專利4,952,496)。這種宿主包括，但是不限于，溶原性細菌E.coli菌株HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)和BL21(DE3)。菌株BL21(DE3)是優選的。PLys菌株生成低含量的T7溶菌酶，T7溶菌酶是T7 RNA聚合酶的天然抑制劑。
所提供的DNA分子還可包括編碼阻抑蛋白的基因。阻抑蛋白能夠抑制含有阻抑蛋白結合的核苷酸序列的啟動子的轉錄。通過改變細胞的生理條件，啟動子可以被去抑制。例如，通過往生長培養液中加入抑制與操作子或調節蛋白或者DNA的其他區域相互作用的能力的分子，或者通過改變生長培養液的溫度來實現這種改變。優選的阻抑蛋白包括，但不限于對IPTG誘導響應的E.coli lac I阻抑蛋白、對溫度敏感的λcI857阻抑蛋白等。E.coli lacI阻抑蛋白是優選的。
總之，主題發明的重組構建體將還含有轉錄和翻譯所需的元件。特別地，當含有編碼preptin，preptin類似物和/或preptin激動劑蛋白核酸序列的重組表達載體用于在宿主細胞或生物體中表達時，該元件是優選的。在本發明的某些實施方案中，通過將基因置于啟動子的調控下來實現細胞類型優選或者細胞類型特異的表達。啟動子的選擇將取決于被轉化的細胞和期望的控制程度或類型。啟動子可以是組成型的或具有活性的，還可以是細胞類型特異的、組織特異的、個別細胞特異的、事件特異的、時序(temporally)特異的或者誘導型的。組成型的或非特異的啟動子的例子包括SV40早期啟動子(美國專利5,118,627)、SV40晚期啟動子(美國專利5,118,627)、CMV早期基因啟動子(美國專利5,168,062和腺病毒啟動子。除了病毒啟動子外，細胞啟動子也在本發明的范圍內。特別地，所謂看家基因的細胞啟動子也是有用的。病毒啟動子一般比細胞啟動子更強大，是優選的。在許多真核細胞基因中，包括高等真核細胞，啟動子區已經被確定，因而本領域技術人員能夠很容易地選擇用于特定宿主的合適啟動子。
還可以使用誘導型啟動子。這些啟動子包括MMTV LTR(PCT WO91/13160)，被地塞米松誘導；可被重金屬誘導的金屬硫蛋白啟動子和具有cAMP響應元件的被cAMP誘導的啟動子。使用誘導型啟動子，編碼preptin，preptin類似物和/preptin激動劑蛋白質的核酸序列可以通過主題發明的表達構建體被釋放到細胞中，并且將保持靜止，直到加入誘導劑。這使得可以對基因產物的生成時機進行控制。
事件類型特異的啟動子僅在發生某一事件，例如腫瘤發生或病毒感染時，具有活性的或者被上調。HIV LTR是已知的事件特異啟動子的例子。除非存在tat基因產物，否則啟動子是無活性的，tat基因產物在病毒感染時出現。一些事件特異的啟動子也是組織特異性的。
此外，可以采用由特定的細胞基因同時調控的啟動子。例如，當期望本發明的特定構建體，例如preptin，preptin類似物和/或preptin激動劑的編碼基因的表達，與一種或多種其他內源的或外源導入的基因的表達相呼應時，使用被同時的基因的啟動子。當已知與免疫系統的特定組織中的免疫反應的誘導相關的特定基因表達模式時，這種類型的啟動子特別有用，使得該組織中的特定免疫活性細胞可以被激活或者募集來參與免疫反應。
除了啟動子，可以插入阻抑序列、負調控物或者組織特異性沉默子來降低preptin，preptin類似物和/preptin激動劑的編碼基因在某些情形下的非特異性表達，例如作為治療方案的一部分，宿主為瞬時無免疫應答的情形。可以將多個抑制元件插入到啟動子區域。轉錄抑制不依賴于抑制元件的方向或者與啟動子的距離。一種類型的抑制序列是絕緣體序列(insulator sequence)。這種序列抑制轉錄(Dunaway等，1997 Mol Cell Biol 17182-9；Gdula等，1996 Proc Natl AcadSci USA 939378-83，Chan等，1996 J Virol 705312-28；Scott和Geyer，1995 EMBO J 146258-67；Kalos和Fournier，1995 MolCell Biol 15198-207；Chung等，1993 Cell 74505-14)，并且將會抑制不期望的背景轉錄。
在II型(軟骨)膠原蛋白、膽堿乙酰轉移酶、白蛋白(Hu等，1992J.Cell Growtla Differ.3(9)577-588)、磷酸甘油酸激酶(PGK-2)(Misuno等，1992 Gene 119(2)293-297)基因的啟動子區域中以及在6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-雙磷酸酶基因(Lemaigre等，Mol.Cell Biol.11(2)1099-1106)中也確定了抑制元件。此外，已經在大量肝特異性基因中確定了負調控元件Tse-1，并且已經證明，在肝細胞中Tse-1阻斷cAMP響應元件(CRE)介導的誘導基因活化。(Boshart等，1990 Cell 61(5)905-916)。
在優選實施方案中，提高期望產物的表達的元件可以被插入到構建體中。這種元件包括內部核糖體結合位點(IRES；Wang和Siddiqui，1995 Curr.Top.Microbiol.Immunol 20399；Ehrenfeld和Semler，1995 Curr.Top.Microbiol.Immunol.20365；Rees等，1996Biotechniques 20102；Sugimoto等，1994 Biotechnology 12694)。IRES提高翻譯效率。此外，其他序列可能增強表達。對于某些基因，特別是在5’斷的序列抑制轉錄和/或翻譯。這些序列通常是能夠形成發夾結構的回文序列。將被釋放的核酸中的任何這種序列通常被刪除掉。分析轉錄或翻譯產物的表達水平來確認或確定哪些序列影響表達。通過任何已知方法來分析轉錄水平，包括Northern印跡雜交、Rnase探針保護等。蛋白質水平可以通常任何已知方法來分析，包括ELISA、western印跡、免疫細胞化學或者其他已知技術。
其他元件可以被插入到本發明的構建體中，例如插入到本發明的preptin或preptin類似物或激動劑蛋白編碼構建體中。在優選實施方案中，構建體包括轉錄終止子序列，包括多聚腺苷酸序列、剪切供體受體位點和增強子。還可以插入用于哺乳動物細胞或者其他真核細胞中表達和維持構建體的其他元件(例如復制起點)。由于在細菌細胞中制備構建體比較便利，細菌繁殖所需或者增強細菌繁殖的元件被插入。這種元件包括復制起點、選擇性標記等。
如在此指出，用于本發明的構建體的制備或表達的宿主細胞，例如，可以是高等真核細胞，例如哺乳動物細胞或者低等真核細胞，例如酵母細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞，例如細菌細胞。按照本發明，恰當的宿主細胞的代表性例子包括，但是不必限于，細菌細胞，例如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，例如酵母細胞；昆蟲細胞，例如果蠅S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9；動物細胞，例如CHO、COS或293細胞；腺病毒；植物細胞或者任何已經適合于體外繁殖或者由此重新建立的合適細胞。一般認為，根據本文的教導，本領域技術人員能夠選擇適當的宿主細胞。各種哺乳動物細胞培養系統也可以被用于表達重組蛋白。哺乳動物表達系統的例子包括Gluzman，1981 Cell23175描述的猴腎臟成纖維細胞的COS-7細胞系，和其他能夠表達相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體將包含復制起點、合適的啟動子和增強子，以及任何必需的核糖體結合位點、多聚腺苷酸位點、剪切供體受體位點、轉錄終止序列，和5’側翼非轉錄序列。來源于SV40剪切的DNA序列和多聚腺苷酸位點可以被用于提供所需的非轉錄遺傳元件。可以通過本領域技術人員熟悉的各種方法將構建體導入宿主細胞中，包括但是不現有，例如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或者電穿孔(Davis等，1986Basic Methods in Molecular Biology)。
本發明還涉及載體，涉及從包括本發明的核酸的已知載體制備的構建體，并且特別涉及“重組表達構建體”，其包括各種已知構建體的任何一種，包括用于基因治療的釋放構建體，其包括任何編碼例如在此提供的按照本發明的preptins、preptin類似物和preptin激動劑的核酸；涉及通過重組方法，用本發明的載體和/或其他構建體細胞遺傳工程化的宿主細胞，和施用包含編碼按照本發明的preptins、preptin類似物和preptin激動劑或其片段或衍生物的核酸序列表達或其他構建體的方法。
本發明的各種構建體實際上可以在任何宿主細胞中被表達，包括在用于基因治療的情況下的體內宿主細胞，在適當的啟動子的控制下，取決于構建體的性質(例如啟動子類型，如上所述)和期望宿主細胞的性質(例如，無論是否有絲分裂后期末期分化或者活性分裂；例如，無論表達構建體是否作為附加體存在于宿主細胞中或者被整合到宿主細胞基因組中)。用于原核和真核宿主的適當克隆和表達載體被描述在例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，第二版，冷泉巷，紐約(1989)；如在此指出，在本發明的特別優選實施方案中，在用主題發明的重組表達構建體轉染或轉化的哺乳動物細胞中進行重組表達。還參見，例如Machida，CA.，“用于基因治療的病毒載體方法和操作”(″Viral Vectors for GeneTherapyMethods and Protocols″)；Wolff，JA，“基因治療定向基因轉移的方法和應用”(″Gene TherapeuticsMethods andApplications of Direct Gene Transfer″)(Birkhauser 1994)；Stein，U和Walther，W(eds.P，“癌癥的基因治療方法與操作”(″GeneTherapy of CancerMethods and Protocols″)(Humana Press 2000)；Robbins，PD(編輯)，“基因治療操作”(″Gene Therapy Protocols″)(Humana Press 1997)；Morgan，JR(編輯)，“基因治療操作”(″GeneTherapy Protocols″)(Humana Press 2002)；Meager，A(編輯)，“基因治療技術、應用與原理從實驗室到臨床”(″Gene TherapyTechnologies，Applications and RegulationsFrom Laboratory toClinic″)(John Wiley & Sons Inc.1999)；MacHida，CA和Constant，JG，“用于基因治療的病毒載體方法和操作”(″ViralVectors for Gene TherapyMethods and Protocols″)(Humana Press2002)；“作為遺傳代謝疾病NIH指南的基因治療新方法”(”NewMethods of Gene Therapy For Geneic Metabolic Diseases NIHGuide”)22(35)，1993年10月1日。還參見與基因治療相關，包括疫苗的最新美國專利，包括美國專利6,384,210(“用于生物多聚物合成的溶劑、溶劑微粒化及其所用方法”(”Solvent by biopolymersynthesis，solvent microdroplets and methods of use”)；6,384,202(“受細胞周期調節的細胞特異性活性化合物”(”Cell-specific active compounds regulated by the cellcycle”))；6,384,018(“多核苷酸肺結核疫苗”(“Polynucleotidetuberculosis vaccine”))；6,383,814(“用于治療性分子的細胞內釋放的陽離子兩性分子”(“Catinonic amphiphiles forintracellular delivery of therapeutic molecules”))；6,383,811(“用于將聚離子釋放到細胞內的多聚兩性電解質”(“Polyampholutes by delivering polyions to cell”))；6,383,794(“制備高滴度重組腺伴隨病毒的方法”(“Methods ofproducing high titer recombinant adeno-associated virus”))；6,383,785(“自增強的藥學上可控制的表達系統”(”Self-enhancing，pharmacologically controllable expressionsystem”))；6,383,753(“細胞增殖的酵母哺乳動物調控蛋白(“Yeast mammalian regulators of cell proliferation”))；6,383,746(CCR5的功能性啟動子”(“Functional promoter forCCR5”))；6,383,743(“順序分析基因表達的方法”(“Method forserial analysis of gene expression”))；6,383,738(“單純皰疹病毒ORF P是病毒蛋白合成的抑制蛋白”(“Herpes simples virus ORFP is a repressor of virus protein synthesis”))；6,383,737(“人乙二酰輔酶A脫羧酶”(“Human oxalyl-CoA Decarboxylase”))；6,383,733(“篩選用于治療腫瘤疾病的藥學活性化合物的方法”(“Methods of screening for pharmacologically active compoundsfor the treatment of tumour diseases”))；6,383,522(“含有抗腫瘤轉移劑和鯊魚軟骨提取物的毒性降低的組合物”(“Toxicityreduced composition containing an anti-neoplastic agent and ashark carti lage extract”))；6,383,512(“囊泡復合物及其制備和使用方法”(″Vesicular complexes and methods of making and usingthe same″))；6,383,481(“造血干細胞移植的方法”(″Method fortransplantation of hemopoietic stem cells″))；6,383,478(“促進血管生成的聚合物包囊系統”(″Polymeric encapsulation systempromoting angiogenesis″))；6,383,138(“分析物的腦內取樣方法”(″Method for transdermal sampling of analytes″))；6,380,382(“編碼具有診斷、預防、治療等用途的蛋白質的基因”(″Gene encoding aprotein having diagnostic，preventive，therapeutic，and otheruses″))；6,380,3719(“內多糖一種具有選擇蛋白配基和趨化因子釋放活性的新蛋白”(″Endoglycana novel protein havingselectin ligand and chemokine presentation activity″))；6,380,369(“人DNA錯配修復蛋白”(″Human DNA mi smatch repairproteins″))；6,380,362(“多核苷酸，多核苷酸編碼的多肽以及使用它們的方法”(″Polynucleotides，polypeptides expressed by thepolynucleotides and methods for their use″))；6,380,170(“細胞周期調控結構基因表達的核酸構建體”(″Nucleic acid constructfor the cell cycle regulated expression of structural genes″))；6,380,169(“含有寡核苷酸裂解化合物的金屬復合物以及治療方法”(″Metal complex containing oligonucleoside cleavage compounds和therapies″))；6,379,967(“作為病毒載體的皰疹病毒”(″Herpesvirus saimiri as viral vector″))；6,379,966(“血管內釋放非病毒核酸蛋白酶蛋白及其用途(″Intravascular delivery ofnon-viral nucleic acid protease proteins，and uses thereof″))。
典型地，例如，表達構建體來源于質粒載體。一種優選構建體是改良的pNASS載體(Clontech，Palo Alto，CA)，其具有編碼氨卡青霉素抗性基因的核酸序列、多聚腺苷酸信號和T7啟動子位點。其他合適的哺乳動物表達載體是已知的(參見，例如，Ausubel等，1995；Sambrook等，同上文；還可以參見，例如，Invitrogen，San Diego，CA；Novagen，Madison，WI；Pharmacia，Piscataway，NJ和其他公司的產品目錄)。目前，優選構建體被制備來包括在合適的調節控制下的二氫葉酸還原酶(DHFR)的編碼序列，來促進preptins、preptin類似物和preptin激動劑生成水平的升高，其水平在使用適當選擇劑(例如methetrexate)后由基因擴增產生。
一般地，如上所述，重組表達載體將包括復制起點和允許宿主細胞轉化的可選擇標記，來源于高度被表達基因來引導下游結構基因轉錄的啟動子。異源結構序列在適當階段與翻譯起始和終止序列一起被組裝。因此，例如，按照在此提供的編碼核酸的preptin，preptin類似物和preptin激動劑可以被包括在各種作為在宿主細胞中表達preptin，preptin類似物和preptin激動劑多肽的重組表達構建體的表達載體構建體的任何一種之中。在某些優選實施方案中，構建體被包括在用于體內施用的制劑中。這種載體和構建體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；酵母質粒；由質粒和噬菌體DNA組合得到載體，病毒DNA，例如痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和偽狂犬病病毒或者下文描述的復制缺陷逆轉錄病毒。但是任何其他載體可以被用于制備重組表達構建體，在優選實施方案中，這種載體在宿主中是可復制的和可存活的。
例如通過各種操作，可以將適當的DNA序列插入到載體中。總之，通過本領域知曉的操作將DNA序列插入到適當的限制性核酸內切酶位點上。用于克隆，DNA分離，擴增和純化，包含DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性核酸內切酶等的酶促反應的標準技術，以及各種分離技術是本領域技術人員知曉和通常使用的。大量標準方法被描述在，例如，Ausubel等，(1993 Current Protocols in Molecular Biology，GreenePubl.Assoc.Inc.& John Wiley & Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook等，(1989分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉巷實驗室，Plainview，紐約)；Maniatis等(1982分子克隆(Molecular Cloning)，冷泉巷實驗室，Plainview，紐約)；Glover(編輯)(1985 DNA Cloning第I和II卷，IRL Press，Oxford，UK)；Hames和Higgins(編輯)，(1985Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK)；和別處。
表達載體中的DNA序列被可操作地連接到至少一種適當的表達控制序列上(例如組成型啟動子或被調控的啟動子)，來引導mRNA合成。這種表達控制序列的代表性例子包括上文描述的真核細胞或者其他病毒的啟動子。啟動子區可以采用CAT(氯霉素轉移酶)載體或者具有選擇標記其他載體從任何期望基因中選擇。真核啟動子包括CMV立早啟動子、HSV胸苷激酶和晚期SV40、逆轉錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-1。選擇適當的載體和啟動子完全在本領域普通技術人員的能力范圍內，在此描述了某些特別優選的重組表達構建體的制備，該構建體包含至少一個被可操作地連接到編碼preptin，preptin類似物和preptin激動劑多肽的核酸上的啟動子或被調節的啟動子。
可以在載體中插入增強子序列來增強通過高等真核細胞轉錄本發明包括的編碼蛋白質和多肽的DNA。增強子是DNA的順式作用元件，通常約在10-300bp，其作用于啟動子來提高其轉錄水平。例子包括位于復制起始后的100-270bp位置上的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制起始后的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。
基因治療是用遺傳物質來治療疾病，其包括替換有缺陷的基因或往細胞和/或組織中增加新基因的策略，正被開發來應用于治療癌癥、修正代謝紊亂和用于免疫治療領域。本發明的基因治療包括使用各種本發明的構建體，與或不與單獨的載體或釋放載體或構建物一起，用于治療在此指出的疾病、紊亂和/或癥狀。體內基因治療包括將遺傳物質直接注射到患者或者人類患者的動物模型中。對于組織特異性的體內治療，例如那些旨在治療糖尿病的治療，定位基因釋放和/或表達/靶向系統是優選的。各種基因治療載體已經被設計來靶向特定組織，各種操作也被開發來從物理上靶向特定組織，例如采用導管技術，所有這些方法被包括在本文中。基因治療的離體方法被包括在本文中，包括取出、遺傳修飾、擴增和重新施用患者自身的細胞。例子包括用于糖尿病治療的B細胞移植或者祖細胞的遺傳修飾。有用的基因治療載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、單純皰疹病毒(Hsv)載體和逆轉錄病毒載體。基因治療還可以采用“裸DNA”、脂質體釋放、脂質釋放(包括DNA附著到正電荷的脂質上)和電穿孔來實施。如在此所提供，在某些實施方案中，包括但是不限于基因治療方案，載體可以是病毒載體，例如，逆轉錄病毒載體。Miller等，1989BioTechniques 7980；Coffin和Varmus，1996 Retroviruses，冷泉巷實驗室出版社，紐約。例如，產生逆轉錄質粒載體的逆轉錄病毒可以來源于包括，但是不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾壞死病毒，逆轉錄病毒例如勞氏肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺癌病毒。用于病毒載體中的合適啟動子通常包括，但是不限于，逆轉錄LTR；SV40啟動子和Miller等，1989 Biotechniques 7980-990中描述的人巨細胞病毒(CMV)啟動子，或者任何其他啟動子(例如，細胞啟動子如真核細胞啟動子，包括，但不限于組蛋白、polIII和β-肌動蛋白啟動子)。其他可以被使用的病毒啟動子包括，但不限于，腺病毒啟動子，胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。根據本文含有的教導，選擇合適的啟動子對于本領域技術人員來說是顯而易見的，并且可以從上面描述的被調控啟動子或啟動子中選擇。
本發明的包含一種或多種在此描述的編碼構建體的多核苷酸的構建體或組合物(例如，其中在一定條件下被體內或體外施用一段時間，以足以在宿主細胞中表達preptin，preptin類似物和/preptin激動劑蛋白，來用于基因治療)，可以被配制成用于按照熟知方法施用的藥物組合物。藥物組合物通常包括一種或多種重組表達構建體，和/或這種構建體的表達產物，結合了藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。在所用的劑量和濃度下，該載體對于受體來說是無毒性的。對于核酸制劑，或者包含本主題發明的重組構建體的表達產物的制劑來說，將以約0.01μg/kg到約100mg/kg體重被施用，例如，典型地通過皮內、皮下、肌肉內或靜脈內的路徑或者通過其他路徑被施用。優選劑量為，例如約1μg/kg到約1mg/kg，而約5μg/kg到約200μg/kg是特別優選的。施用的次數和頻率將取決于宿主的反應，這對本領域技術人員來說是顯然的。用于治療用途的“藥學上可接受的載體”在藥學領域是熟知的，被描述在例如雷明頓藥物科學(RenaingtoyasPharmaceutical Science)，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編輯1985)中。例如，生理pH下的無菌生理鹽水和磷酸緩沖生理鹽水可以被使用。防腐劑、穩定劑、染料以及甚至調味劑可以被添加到藥物組合物中。例如，苯甲酸鈉、山梨酸和p-羥基苯甲酸酯可以被加入作為防腐劑。Id.at 1449。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。Id.
合成肽可以通過方法例如親合柱層析或者高壓液相層析的方法進一步純化。標準的理化表征方法在本領域是已知的，包括NMR(13C，1H，19F，或31P)和IR，其給合成產物的鑒定和純度提供確定的證據。氨基酸分析可以被用于確定肽的氨基酸組成。質譜分析可以被用于確定合成產物的分子量。
可以通過例如脂肪酸衍生化、糖基化或偶聯到單甲氧基聚乙二醇(PEG)和/或磷脂(包括PEG-脂質偶聯物)上來制備衍生物。示例性PEG的分子量為2,000和5,000，雖然也可以使用其他的PEG，包括但是不限于范圍在如600-12,000的PEG。衍生物的脂質部分，舉例來說，可以包括飽和或不飽和PEG、膽固醇、具有短鏈(C8)、中等長度鏈(C14)和長鏈(C20)脂肪胺等的神經酰胺。
Preptins以及preptin類似物和激動劑，及其鹽和衍生物還可以作為二聚體或更大的聚集體來被制備，以提高其功能和/或延長半衰期。
可以在體外檢測Preptin激動劑刺激NIH-3T3細胞或者其他類似細胞或者β-細胞包括INS-IE β-細胞增殖的能力。參見下文的特定實施例。可以通過本領域的操作來進行體內篩選。參見，例如，Burks和White(2001)Diabetes 50副刊1S140-5；Flier等，(2001)ProcNatl Acad Sci USA 98(13)7475-80；Guiot等，(2001)Diabetes50副刊1S188；Kjems等，(2001)Diabetes 50(9)2001-2012；Moore等，(2001)Diabetes 50(10)2231-6。
采用本發明提供的序列信息，使用各種方法獲得任何物種的preptin的變體，這種方法包括但是不限于，例如，篩選cDNA文庫、RT-PCR、篩選基因組文庫和計算機輔助檢索EST、cDNA和基因組數據庫。這些方法對于本領域技術人員來說是熟知的(參見，例如，www.MolecularCloning.com；Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Inc)。例如，通常采用寡核苷酸探針和/或引物在基因組文庫或cDNA文庫中進行篩選。基于來源于在此描述的種類的任何之一的preptin的序列的寡核苷酸探針和/或引物可以被合成并被用于通過雜交或PCR技術在來自其他生物體的cDNA或基因組DNA文庫鑒定陽性克隆。陽性克隆是與preptin的序列具有足以在期望嚴緊性的雜交條件下與寡核苷酸探針或引物雜交的相似性的克隆。探針和/或引物的長度至少約10個、優選至少約15個和最優選至少約20個核苷酸。適合使用這種寡核苷酸探針和/或引物的雜交和PCR技術在本領域是熟知的。可以通過限制性酶消化、DNA測序等來分析陽性克隆。被確定或懷疑包含preptin編碼核酸序列的克隆可以采用本領域熟知的技術來表達。來自任何物種的preptin可以通過使用本領域知曉的技術在合適宿主細胞中表達核酸編碼序列來獲得。合適的宿主細胞包括原核或真核生物體或者細胞系，例如，酵母、E.coli、昆蟲細胞和COS1細胞。優選地，利用真核系統來表達preptin。本發明的重組表達載體可以被用在宿主細胞中表達preptin，來分離preptin蛋白。被純化的本發明的preptin蛋白可以通過本領域熟知的方法來制備，通常包括往宿主細胞中導入編碼preptin的重組核酸，允許在宿主細胞中表達蛋白質，并分離和純化該蛋白。優選地，重組核酸是重組表達載體。可以從表達蛋白的宿主細胞中分離蛋白質，并按照本領域的標準方法來純化，包括硫酸胺沉淀、柱層析(例如離子交換、凝膠過濾、親合層析等)電泳和最后結晶(一般參見“酶純化及相關技術”(″Enzyme Purification and Related Techniques″)，(1971)Methods in Enzymology，22233-577，在此引入作為參考)。
術語“β-細胞生長”被定義為β-細胞數量的增加和/或β-細胞質量的提高。
術語“β-細胞質量”是指β-細胞的質量和/或重量。
術語“β-細胞增殖”是指β-細胞數量的增加。
β-細胞或β-細胞質量被降低或被危及的癥狀包括完全或部分地在于β-細胞和/或β-細胞質量對于正常或期望的機體功能來說是低常的或不足的。
如在此所用，術語“個體”是指但是不限于哺乳動物，包括人、家養動物(或其他可能被獸醫治療的動物)，以及經濟動物，包括但是不限于馬、牛、豬、綿羊、家禽等。
術語“治療”被定義為給個體應用或施用包括有效量或者其他期望量的一種或多種preptin，preptin類似物、preptin激動劑、和它們的任何一種的鹽和/或衍生物的組合物。
所述個體可能已經或者被確定為，例如，β-細胞質量、數量或功能下降，具有β-細胞質量、數量或功能下降的癥狀，具有β-細胞質量、數量或功能損失繼發的疾病或紊亂，或者β-細胞質量、數量或功能下降的傾向，目的在于治愈、減輕、緩解、補救或改善β-細胞質量、數量或功能下降，β-細胞質量、數量或功能下降的癥狀，具有β-細胞質量、數量或功能下降繼發的疾病或紊亂，或者β-細胞質量、數量或功能下降傾向。
“有效量”是指給被治療的個體賦予治療的或其他期望作用的preptin，preptin類似物preptin激動劑的含量，例如對β-細胞質量、數量或功能產生作用。治療的或其他的期望作用可以是客觀的(即可以通過一些檢測或標記測定)或是主觀的(即個體產生一種跡象或者感覺到作用)。上述preptin類似物preptin激動劑或者它們的任何一種的鹽或衍生物的有效量，范圍在從約10-約40μg/Kg體重到約200-約500μg/Kg體重到約600-約1000μg/Kg體重。根據施用路線以及與其他試劑共同施用的可能性，有效劑量是變化的，其他試劑例如那些可用于，僅作為例子，刺激β-細胞增殖或提高β-細胞質量的那些試劑，通過例如使用化合物如胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、生長激素(GH)、葡萄糖依賴的促胰島多肽(GIP)、肝細胞生長因子(HGF)、PTH相關蛋白(PTHrP)、β-動物纖維素、胎盤催乳素(PL)和胰島再生相關蛋白(INGAP)。
兩條氨基酸序列的“百分同一性”可以使用Karlin和Altschul(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268的算法來確定，該算法在Karlin和Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中被改進。這種算法被結合到Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序中(2.0版本)。可以用XBLAST程序，分值＝50，字長(wordlength)＝3來進行BLAST蛋白質檢索，以獲得與在此描述的肽分子同源的氨基酸序列。當兩條序列之間存在缺口時，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中所描述采用缺口BLAST。當使用BLAST和缺口BLAST程序時，可以采用各個程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。
“保守性氨基酸取代”是氨基酸殘基被具有化學相似或衍生化的側鏈的另一個殘基替換。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族已經在本領域被定義。這些家族包括，例如，具有堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、死氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。本發明還包括氨基酸類似物(例如，磷酸化的氨基酸)，以及用非天然的氨基酸取代的肽，包括但是不限于D-氨基酸、β-氨基酸和？氨基酸。
如在此所用“被分離的”是指，在為天然物質的情況下，該物質被或已經從其天然或原始環境中取出，或者不再與該環境發生聯系。例如，存在于活動物中的天然的蛋白質或者多肽未被分離，但是從天然系統中的一些或所有共同存在的物質中分開的相同核酸或多肽是被分離的。這種蛋白質或者多肽可以是組合物的一部分，在該組合物中還可以被分離的不是該蛋白質或多肽的天然環境中的一部分。在為天然物質的情況下，例如本發明的重組制備的蛋白質或多肽，術語“被分離的”包括實質上或者基本上不含在加工過程中通常伴隨的組分的物質，例如，蛋白質和多肽被純化到期望程度，優選，例如使得它們用本領域知曉的技術測定為至少約80％純度，更加優選至少約90％，和更加優選至少約95％。
術語“實質上被純化的”是指至少約60％不含、優選至少約75％不含，和最優選至少約90％或更高不含天然的或者在加工過程中與之結合的其他組分的肽。
如在此所用“純化的”不要求絕對純度；相反，是作為相對術語，其中目標蛋白或者其他底物比其在天然環境下、在細胞中或其他環境下更純，例如加工環境下。實際上，該物質通常，例如被分餾來去除各種其他組分，而且得到的物質實質上保留其期望的生物學活性。
術語“糖尿病”是指包括β-細胞或β-細胞功能損失的任何疾病或綜合癥，并且包括在此描述的疾病或癥狀的任何之一。
β-細胞介導的疾病是任何其中在疾病病理學中完全或在任何部分中涉及β-細胞的疾病。β-細胞介導的疾病包括，例如，1型或2型糖尿病。
如在此所用，“preptin”、“preptin類似物”和“preptin激動劑”被定義為包括藥學上可接受的鹽或衍生物，并且不排除合適的preptin，preptin類似物或preptin激動劑的混合物。
藥學上可接受的鹽包括那些來源于藥學上可接受的無機和有機酸和堿的鹽。合適的酸性鹽的例子包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯基硫酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦胺酸鹽、樟腦硫酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷硫酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚酸鹽、甘油磷酸鹽、乙醇酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷硫酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲烷硫酸鹽、2-萘硫酸鹽、煙酸鹽(nicotinate)、硝酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、persulfate、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、枯味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酰酸鹽和十一烷酸鹽。其他酸，例如草酸，雖然其本身不是藥學上可接受的，但是可以用在可作為獲得本發明的組合物及其藥學上可接受的加酸鹽的中間體的鹽的制備中。來源于適當的堿的鹽包括堿金屬(例如鈉)、堿土金屬(例如鎂)、銨和N-(烷基)4+鹽、本發明還包括在此公開的化合物的堿性含氮基團的季銨化。可以通過這種季銨化作用來獲得可溶于水或油的或者分散的產物。鹽酸鹽和乙酸鹽是優選的。
本發明的保護范圍內還包括含有有效量的preptin，preptin類似物或preptin激動劑或它們中任何一種的鹽和/或衍生物的一種或多種，以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。
術語“藥學上可接受的載體”是指與有效量的preptin，preptin類似物或preptin激動劑，或者它們的任何一種的鹽和/或衍生物的一種或多種一起被施用給個體的載體(佐劑或媒介物)，并且當以足夠釋放所述preptin，preptin類似物和/或preptin激動劑的劑量被施用時，不會破壞它們的藥學活性，而且是無毒的。
可被用于上述藥物組合物中的藥學上可接受的載體包括，但是不限于，離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，自乳化藥物釋放系統(SEDDS)，例如d-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸鹽，以藥劑形式使用的表面活性劑，例如Tweens或者其他類似聚合體釋放基質，血清蛋白，例如人血清白蛋白，緩沖物質，例如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸、水、鹽或電介質的部分甘油酯混合物，例如硫酸鉀，磷酸氫二鈉，磷酸氫二鉀，氯化鈉，鋅鹽，硅膠，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質，聚乙二醇，羥甲基纖維素鈉，聚丙烯酸鹽，石蠟，聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。環式糊精例如α-、β--和γ-環式糊精，或者化學修飾的衍生物，例如羥基烷基環式糊精，包括2-和3-羥基丙基-β--環式糊精，或者其他被溶解的衍生物也可以被有利地使用來增強在此描述的公式的化合物的釋放。油脂溶液或懸浮液還可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，或者羥甲基纖維素或類似的分散劑，其通常以藥學上可接受的制劑形式的配方被使用，例如乳化劑和/或懸浮劑。
為了實施治療損傷包括內部和外部創傷的方法，或者用于治療β-細胞損失或功能損失的方法，或者用于提高或維持β-細胞質、數量或功能的方法，一種或多種preptins、preptin類似物和/preptin激動劑或者它們的任何一種的鹽或衍生物可以被施用給個體。Preptin，preptin類似物preptin激動劑，鹽或衍生物，可以例如在藥學上可接受的載體例如生理鹽水中，結合其他藥物和/或與適當的賦形劑一起被施用。其可以例如通過注射(例如靜脈內、動脈內、皮內、腹膜內、肌肉內或者皮下)、口服、口腔、鼻內、經粘膜、體表、作為眼科制藥、通過吸入、通過顱內注射或者灌注技術來施用。本文的方法包括施用有效量的化合物或者化合物的組合物來達到期望或特定的效果。低于或高于上述那些劑量的劑量是期望或必需的。在本領域，一般認為，用于任何特定個體的特定劑量和治療方案將取決于各種因素，包括所用的特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、排泄頻率、藥物組合、疾病的嚴重性和進展、癥狀或綜合癥、個體對疾病、癥狀或綜合癥的傾向等，以及主治醫生的判斷。
被口服施用的藥物組合物可以是任何口服可接受的劑量形式，包括，但是不限于，膠囊、片劑、乳劑和液體懸浮液、分散劑和溶液。在為用于口服使用的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還加入潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對于以膠囊形式的口服施用，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥玉米淀粉。當口服施用水溶液懸浮劑和/或乳劑時，活性成分被懸浮或溶解在油相中，與乳化劑和/或懸浮劑組合。如果需要，可以加入某些甜味劑和/或甜味劑和/或著色劑。
胃腸外施用的藥物組合物可以是任何可接受的劑量形式，例如可以通過如下施用路徑之一被施用，不限于皮下、動脈內、肌肉內、皮內、intrastemal注射或者灌注技術。例如，可注射的無菌組合物(例如水溶液的或油質的懸浮液或者其他制劑)可以按照本領域己知的技術來配制，使用合適的分散劑或濕潤劑(例如Tween 80)和懸浮劑。
當預期的治療涉及容易通過局部應用來達到的區域或器官時，藥物組合物的局部施用是有用的。對于局部應用于皮膚，藥物組合物應當與合適的含有懸浮或者溶解在載體中的活性組分的藥膏一起配制。用于局部施用本發明的化合物的載體包括，但是不限于，礦物油、液體石油(liquid petroleum)、白石油(white petroleum)、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化臘和水。可選擇地，藥物組合物可以與合適的含有用合適的乳化劑懸浮或溶解在載體中的活性化合物的洗劑或面霜一起配制。合適的載體包括，但是不限于，礦物油、山梨聚糖單硬脂酸鹽、聚山梨醇酯60、十六烷基酯臘、十六碳烯醇(cetearylalcohol)、2-辛基十二烷醇、苯甲基醇和水。本發明的藥物組合物還可以通過直腸栓劑或者以合適的灌腸劑被局部應用于腸道后端。本發明還包括局部經皮應用的或者其他的膜片(patch)。
藥物組合物可以通過鼻內氣霧劑或吸入劑被施用。這種組合物按照藥物配制領域熟知方法來制備，可以制備成溶解在生理鹽水中的溶液，使用苯甲醇或其他合適防腐劑、增強生物利用度的稀釋促進劑、碳氟化合物和/或其他本領域已知的溶解劑或分散劑。
制備面霜可以采用，例如，(1)油質性基底，例如由不揮發性油或者烴組成的基底，例如白石油或礦物油，或者(2)可吸收基底，例如由無水物質或吸水物質組成的基底，包括例如無水羊毛脂。通常，在基底形成后，無論是油質的或可吸收的，活性成分如一種或多種preptins、preptin類似物和/或preptin激動劑以產生期望濃度的含量被添加。
霜劑可以是，例如，油/水乳劑。可以包含，例如油相(分散相)，通常例如不揮發性油、烴等，例如石蠟、石油凍、礦物油等，和包含水和任何水溶性物質的水相(連續相)，例如加入的鹽。這兩種相可以使用乳化劑來穩定，例如表面活性劑，如十二烷醇硫酸鈉；吸水性膠體，例如阿拉伯樹膠膠質粘土、veegum等。在乳劑形成后，活性成分(一種或多種preptins、preptin類似物和/或preptin激動劑)通常以產生期望濃度的含量被添加。
凝膠可包含選自如在此描述的油質基底、水或乳化-懸浮基底的基底。凝膠化劑被加入基底中，在基底中形成基質，增加其粘性。凝膠化劑的例子包括，例如，羥基丙基纖維素、丙烯酸聚合物等。通常，活性成分(一種或多種preptins、preptin類似物和/preptin激動劑)在某一時間點以產生期望濃度的含量被添加，例如在加入凝膠化劑之前。
本發明將在如下實施例中被進一步描述。應當理解，這些實施例僅用于說明目的，不被解釋為以任何方式限制本發明。
實施例1刺激NIH-3T3細胞增殖NIH-3T3細胞被用于各種目的，包括關于促有絲分裂的研究。參見，例如Buergisser等(1990).BiochemBiophys Res Comm 169(3)832-839；Burgisser等(1991).J Biol Chem 266(2)1029-33；Yang等(1996).Endocrinol 137(7)2766-2773；Geddes等(2001).ProtEngin 14(1)61-65。NIH-3T3細胞以3×104細胞/孔的密度被植入24孔平板。在37℃下，細胞在高濃度葡萄糖的DMEM(添加30mM碳酸氫鈉、2mM L-谷氨酸、105IU/l青霉素、0.01％鏈霉素硫酸鹽)和10％胎牛血清中生長24h，隨后在高濃度DMEM和0.2％BSA中血清饑餓24h。往孔中加入preptin，達到10、50、100和500nM preptin/孔的最終濃度，在往各個孔中加入1μCi3H-胸苷之前，再培養細胞15h。在培養1h后，吸掉培養液，細胞用冰冷PBS洗滌兩次，用5％TCA洗滌兩次和用100％乙醇洗滌兩次。然后在用200μl的0.2M NaOH溶解細胞之前，空氣干燥平板30min。然后用200μl 0.2M HCl中和這種堿性細胞溶解液，接著將300μl等分試樣與2ml Starscint閃爍液混合，在閃爍計數器上進行計數。
一種測定細胞增殖的方法是通過將被標記的核苷酸(例如[3H]-胸苷)結合到在細胞分化過程中新合成的DNA上。例如，最熟悉和被廣泛使用的用于量化細胞增殖的方法之一是測定含氚胸苷([3H]-胸苷)的結合。細胞將被標記的DNA前體結合到新合成的DNA上，使得由液體閃爍計數測定的結合量是細胞增殖的相對測定值。類似地，在該實施例中，閃爍計數器中的每分鐘的數量(cpm)增加表示3H-胸苷攝取的增加，因而細胞增殖增加。細胞增殖結果被顯示在附圖1中。
實施例2刺激INS-1E β--細胞增殖INS-LE細胞以2×105細胞/孔的密度被植入24孔平板。在37℃下，細胞在改進的RPMI-1640(GIBCO R-1383 Lot108H83032；添加了23.8mM碳酸氫鈉、2mM L-谷氨酸、10mM HEPES、50μM β--巰基乙醇、1mM丙酮酸鈉、105IU/l青霉素、0.01％鏈霉素硫酸鹽)和10％胎牛血清中生長24h，隨后在改進的RPMI-1640中血清饑餓24h。然后將無血清培養液替換為500μl含有如下物質的RPMI-16400％胎牛血清(陰性對照)，10％胎牛血清(陽性對照)，10nM大鼠preptin(rPreptin 10nM)，10nM人GLP-1(hGLP-1 10nM)，10nM人IGF-II(hIGF-II 10nM)，在各個孔中加入5μCi3H-胸苷之前，再培養細胞18h。在培養細胞6h后，吸掉培養液，細胞用冰冷PBS洗滌兩次，用5％TCA洗滌兩次和用冰冷的100％乙醇洗滌兩次。然后在用400μl的0.5M NaOH溶解細胞之前，空氣干燥平板30min。然后用400μl 0.5MHCl中和這種堿性細胞溶解液，接著將500μl等分試樣與2mlStarscint閃爍液混合，在閃爍計數器上進行計數。閃爍計數器中的每分鐘的數量(cpm)的增加表示3H-胸苷攝取的增加，因而細胞增殖增加。細胞增殖結果被顯示在附圖2中。
在此參考或提及的所有專利、出版物、科技文獻、網站、以及其他文件和材料指示了本發明所屬領域的技術人員的技術水平，并且每份這些被參考的文件和材料在此引入作為參考，如同分別地以其全部被引入作為參考或者在此以其全部被列舉。申請人保留將來自任何這些專利、出版物、科技文獻、網站、電子信息和其他被參考的材料或文件的材料和信息機械結合到本說明書的權力。
所撰寫的本專利的描述部分包括所有權利要求。此外，所有權利要求，包括所有原始權利要求以及所有來自任何和全部優先權文件的權利要求在此都全部被引入所撰寫的說明書的描述部分作為參考，申請人保留將任何和所有這些權利要求機械結合到所撰寫的本申請的描述或任何其他部分中的權力。因此，例如，在任何情況下，本專利都不被解釋為根據其描述沒有給權利要求提供書面說明，斷言權利要求的準確措詞沒有明確地(in haec verba)在本專利的書面描述部分中被闡明。
權利要求將按照法律來解釋。但是，無論聲稱或認識到解釋任何權利要求或其部分的難易，在任何情況下，在本申請的審查過程中，導致該專利被解釋為已經喪失其任何和所有等同物的任何權利的對權利要求或其任何部分的任何調整或修改，不構成現有技術的一部分。
本說明書所公開的所用特征可以以任何組合被結合。因此，除非另外明確地指出，每一個公開的特征僅僅是一類等價的或類似的特征的一個例子。
應當理解，雖然本發明與其詳細說明一起被描述，前面的說明是用于闡明，而不是限制本發明的保護范圍，保護范圍由附隨的權利要求書來定義。因此，從前述內容可以預期，雖然本發明的特定實施方案在此被描述用于闡明目的，在不偏離本發明的精神和范圍的前提下，可以進行各種改進。其他方面、優點和改進屬于如下權利要求的范圍內，除非被附隨的權利要求限定，本發明是不被限制的。
在此描述的特定方法和組合物是優選實施方案的代表，是示例性的，不被理解為對本發明的保護范圍的限制。在考慮本說明書的情況下，其他目標、方面和實施方案對本領域技術人員來說是可行的，包含在由權利要求的保護范圍定義的本發明的精神內。對于本領域技術人員來說，在不背離本發明的保護范圍和精神的前題下，對在此公開的發明變化替代和改進是顯然的。在此被說明性地描述的本發明在缺乏任何在此未作為重要部分被特別地公開的元件或限制時可以被實施。因此，例如，在本文的各種情況下，在本發明的實施方案或實施例中，術語“包含”、“包括”、“含有”等被開放式地解釋，不被限制。在此被說明性地描述的方法和處理合適地以不同步驟順序被實施，不必被限制于在此或在權利要求中指出的步驟順序。
所用的術語和表述被用作說明的術語，不是限制，目的不在于使用這些術語和表述來排除被顯示和描述的特征或其部分的任何等價物，但是，一般認為，各種改進可能在要求保護的本發明的保護范圍之內。因此，應當理解，雖然本發明通過各種實施方案和/或優選實施方案和可選擇的特征被特別地公開，本領域技術人員可能進行的對在此公開的內容的任何以及所有改進和變化，屬于由附隨的權利要求定義的本發明的保護范圍內。
在此寬泛和一般性地描述了本發明。落入一般公開的較窄的種類和亞組的每一個也構成本發明的部分。包括用限制性或否定性限制從類別中排除任何主題的本發明的類別描述，無論被排除的物質是否在此被特別地引用。
還應當理解，術語“包含”還指術語“包括”。還應當理解，如在此和在附隨權利要求中所用的，單數形式“a”，“an”和“the”包括復數形式，除非上下文中另外清楚地指出，術語“X和/或Y”是指“X”或“Y”或者“X”和“Y”，名詞后的字母“s”表示該名詞的復數和單數形式。此外，當本發明的特征或方面以馬庫氏群體被描述時，本領域技術人員將會認識到本發明還以馬庫式群體中的任何單個成員或成員亞組被描述。
其他實施方案在如下權利要求內。在任何情況下，該專利都不被解釋為限定于在此特別地和/或清楚地公開的特定實施例或實施方案或者方法。在任何情況下，該專利都不被解釋為受審查員或者其他官員或專利商標局的職員作出的陳述限定，除非該陳述被申請人以相應的書面形式特別地和毫無限制或保留地清楚的接受。
權利要求
1.用于治療特征在于或涉及，或在任何測定中通過改善個體中降低的β-細胞質量和/或減少的β-細胞數量來緩解癥狀的方法，包括給所述個體施用有效量一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述preptin選自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro ArgTyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln SerThr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro ArgTyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg Gln SerAla Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe Pro ArgTyr ProVal Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg Gln SerAla Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
3.根據權利要求1所述的方法，其中preptin激動劑包含SEQ ID NO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的片段包含SEQ ID NO1，2或3的殘基17-34。
5.根據權利要求1所述的方法，其中preptin激動劑包含與SEQ IDNO1，2或3至少約60％相同的氨基酸序列。
6.根據權利要求5所述的方法，其中preptin激動劑包含與SEQ IDNO1，2或3至少約80％相同的氨基酸序列。
7.根據權利要求5所述的方法，其中preptin激動劑包含與SEQ IDNO1，2或3至少約90％相同的氨基酸序列。
8.根據權利要求5所述的方法，其中preptin激動劑包含與SEQ IDNO1，2或3至少約95％相同的氨基酸序列。
9.根據權利要求1所述的方法，其中preptin激動劑包含具有多達約14個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
10.根據權利要求9所述的方法，其中preptin激動劑包含具有多達約10-13個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
11.根據權利要求9所述的方法，其中preptin激動劑包含具有多達約6-9個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
12.根據權利要求9所述的方法，其中preptin激動劑包含具有多達約2-5個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
13.用于增加或維持β-細胞質量和/或β-細胞數量所述的方法，包括給需要此的個體施用有效量一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述preptin選自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
15.根據權利要求13所述的方法，其中preptin激動劑包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述的片段包含SEQ IDNO1，2或3的殘基17-34。
17.根據權利要求13所述的方法，其中preptin激動劑包含一條肽，該肽選自(1)與SEQ ID NO1，2或3至少約60％相同的氨基酸序列，(2)與SEQ ID NO1，2或3至少約80％相同的氨基酸序列，(3)與SEQ ID NO1，2或3至少約90％相同的氨基酸序列，(4)與SEQ ID NO1，2或3至少約95％相同的氨基酸序列。
18.根據權利要求13所述的方法，其中preptin激動劑選自一條肽，該肽包含(1)具有多達約14個保守性或其他氨酸取代的SEQ IDNO1，2或3，(2)具有多達約10-13個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(3)具有多達約6-9個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(4)具有多達約2-5個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
19.一種用于刺激β-細胞增殖的生長和/或β-細胞質量增加所述的方法，包括給需要此的個體施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述preptin選自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
21.根據權利要求19所述的方法，其中preptin激動劑包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述的片段包含SEQ IDNO1，2或3的殘基17-34。
23.根據權利要求19所述的方法，其中preptin激動劑包含一條肽，該肽選自(1)與SEQ ID NO1，2或3至少約60％相同的氨基酸序列，(2)與SEQ ID NO1，2或3至少約80％相同的氨基酸序列，(3)與SEQ ID NO1，2或3至少約90％相同的氨基酸序列，(4)與SEQ ID NO1，2或3至少約95％相同的氨基酸序列。
24.根據權利要求19所述的方法，其中preptin激動劑選自一條肽，該肽包含(1)具有多達約14個保守性或其他氨酸取代的SEQ IDNOI，2或3，(2)具有多達約10-13個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(3)具有多達約6-9個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(4)具有多達約2-5個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
25.在個體中治療完全或部分地由β-細胞或β-細胞功能障礙介導的調節性疾病、紊亂或癥狀所述的方法，包括給個體施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述preptin選自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin、包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preptin。
27.根據權利要求25所述的方法，其中preptin激動劑包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
28.根據權利要求25所述的方法，其中所述的疾病是1型糖尿病或2型糖尿病。
29.一種提高個體中的胰島素分泌所述的方法，包括給個體施用有效量的preptin，preptin類似物和/preptin激動劑
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述preptin選自包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys GlnSer Thr Gln Arg Leu(SEQ ID NO1)的人preptin，包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Lys Phe Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO2)的大鼠preptin和包含氨基酸序列Asp Val Ser Thr Ser Gln Ala Val Leu Pro Asp Asp Phe ProArg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Arg GlnSer Ala Gly Arg Leu(SEQ ID NO3)的小鼠preption。
31.根據權利要求29所述的方法，其中preptin激動劑包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
32.一種加工產品，包括以足以治療或改善疾病、癥狀或紊亂或其更多一種綜合癥的含量含有一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物的容器；和用于使用容器中的內容物來治療或改善涉及損傷、創傷、β-細胞質量降低、β-細胞數量減少、β-細胞功能下降的疾病、癥狀或紊亂，或其更多一種綜合癥的說明書，包括給藥給個體。
33.一種加工產品，包括包裝材料；和在包裝材料中，以足以治療或改善疾病、癥狀或紊亂或其更多一種綜合癥的含量，含有的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物；其中所述的包裝材料描述或指示使用一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物治療個體內的完全或部分地由β-細胞損失或β-細胞功能下降介導的損傷、創傷或癥狀。
34.一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物在制備用于治療具有如下的任何一種或多種的個體的藥劑中的用途i)內部損傷；ii)外部損傷；iii)內部創傷；iv)外部創傷；v)完全或部分以β-細胞質量降低為特征的癥狀，vi)完全或部分以β-細胞數量降低為特征的癥狀，vii)提高或維持β-細胞質量；viii)升高或維持β-細胞數量，ix)通過細胞分化或再生刺激β-細胞增殖，x)通過細胞分化或再生提高β-細胞質量，xi)β-細胞介導的疾病；xii)完全或部分以不期望的低胰島素分泌為特征的癥狀；和xiii)完全或部分以胰島素抗性為特征的癥狀；xiv)完全或部分以高血糖癥為特征的癥狀；和，xv)完全或部分以餐后高血糖癥為特征的癥狀。
35.根據權利要求34所述的用途，其中所述preptin是人的、大鼠的或小鼠的preptin。
36.根據權利要求34所述的用途，其中preptin激動劑包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸序列的片段或全部。
37.根據權利要求36所述的用途，其中所述的片段包含SEQ IDNO1，2或3的氨基酸殘基17-34。
38.根據權利要求34所述的用途，其中preptin激動劑包含一條肽，該肽選自(1)與SEQ ID NO1，2或3至少約60％相同的氨基酸序列，(2)與SEQ ID NO1，2或3至少約80％相同的氨基酸序列，(3)與SEQ ID NO1，2或3至少約90％相同的氨基酸序列，(4)與SEQ ID NO1，2或3至少約95％相同的氨基酸序列。
39.根據權利要求34所述的用途，其中preptin激動劑選自一條肽，該肽包含(1)具有多達約14個保守性或其他氨酸取代的SEQ IDNO1，2或3，(2)具有多達約10-13個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(3)具有多達約6-9個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3，(4)具有多達約2-5個保守性或其他氨酸取代的SEQ ID NO1，2或3。
40.根據權利要求34所述的用途，其中β-細介導的疾病是1型糖尿病或2型糖尿病。
41.可用于或適合用于根據權利要求1-40的任何一項的方法的劑量單位，包含一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物，與藥學上可接受的封裝或基質、藥學上可接受的載體、藥學上可接受的合適輔助激活劑(co-active)、藥學上可接受的緩沖液、藥學上可接受的鹽、藥學上可接受的張力劑和/或藥學上可接受的稀釋劑的任何一種或多種配制來被施用或自體施用。
42.根據權利要求41的劑量單位，其中所述一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物的含量范圍為10-40μg/Kg個體體重到約200-500μg/Kg個體體重到約600-1000μg/Kg個體體重。
43.一種用于治療個體內或上的損傷或創傷所述的方法，其包括將包含有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽以及其衍生物的化合物的組合物應用于所述損傷或創傷。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述個體是人。
45.根據權利要求43所述的方法，其中所述個體不是人。
46.根據權利要求43、44或45的任何一項所述的方法，其中所述創傷是皮膚或其他外部表面被撕裂、被刺穿、被切割或另外的破壞的一種。
47.根據權利要求43、44或45的任何一項所述的方法，其中所述創傷是其中肌肉被穿破而下面的骨骼或重要器官實質上未受損的創傷。
48.根據權利要求43、44或45的任何一項所述的方法，其中所述創傷是皮膚表面損傷。
49.根據權利要求43、44或45的任何一項所述的方法，其中所述創傷是內出血。
50.根據權利要求43、44或45的任何一項所述的方法，其中所述組合物是藥膏、面霜或凝膠。
51.根據權利要求43、44或45的任何一項所述的方法，其中所述創傷選自化學燒傷、熱燒傷、皮膚移植物供體部位、皮膚移植物移植部位、皮膚潰瘍、手術創傷、創傷性開裂、角膜損傷、角膜移植部位、拔牙部位、口腔手術部位、粘膜破壞、皮膚破壞和或結締組織破壞。
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述皮膚潰瘍選自褥瘡潰瘍、糖尿病潰瘍、血管阻塞潰瘍和脂性漸進性壞死性潰瘍。
53.根據權利要求51所述的方法，其中所述粘膜破壞選自胃腸道內的粘膜破壞和膀胱內的粘膜破壞。
54.根據權利要求53所述的方法，其中所述胃腸道內的粘膜破壞包括潰瘍性大腸炎。
55.根據權利要求53所述的方法，其中所述胃腸道內的粘膜破壞包括Crohn病。
56.根據權利要求51所述的方法，其中所述皮膚破壞包括擦傷。
57.根據權利要求51所述的方法，其中所述結締組織的破壞包括擦傷。
58.一種用于增加創傷愈合所述的方法，其包括將有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽，或其衍生物的化合物局部應用于該創傷上。
59.一種通過應用或施用促進間充質細胞來源的細胞增殖和/或細胞量的化合物在個體內治療癥狀所述的方法，其改進包括給該個體施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽，或其衍生物的化合物。
60.根據權利要求59所述的方法，其中間充質細胞包含成纖維細胞。
61.施用包含有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑、其鹽和其衍生物的化合物的組合物，來治療和/或預防外周神經系統損傷，減少運動神經元死亡、增加肌肉終板、促進受損的坐骨神經的功能恢復、防止化學治療中出現的外周運動麻痹，治療和/或預防Alzheimer病，治療和/或預防中風，治療和/或預防肌萎縮性(脊髓)側索硬化，治療和/或預防帕金森病，治療和/或預防肌肉萎縮癥，治療和/或預防糖尿病神經病，改善心肌功能，治療和/或預防心肌病變(myocardiopathies)，包括心肌炎和心肌梗塞，治療和/或預防心臟病和急性發作(acute attack)，以及治療和/或預防由缺血引起的急性腎功能不全。
62.一種用于在個體內通過應用或施用促進生長的化合物來促進組織生長的方法，其包括給所述個體應用于或施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，或其鹽，或其衍生物的化合物。
63.根據權利要求62所述的方法，其中組織選自結締組織和上皮組織。
64.用于通過應用或施用化合物來提高免疫功能來在個體內改善免疫功能所述的方法，其包括給所述個體應用或施用有效量的一種或多種選自preptin，preptin類似物，preptin激動劑，其鹽，或其衍生物的化合物。
65.根據權利要求64所述的方法，其中所述免疫功能的提高包括淋巴細胞增殖的提高。
全文摘要
本發明的特征在于用于治療個體包括人和非人類動物中的各種疾病、紊亂和/或癥狀的方法，包括損傷和創傷，以及疾病、紊亂和/或癥狀，例如完全地或部分地涉及或特征在于細胞質量降低、細胞數量減少和/或細胞功能下降。該方法包括給個體施用有效量的一種或多種化合物，包括preptin，preptin類似物、preptin激動劑、其鹽以及其衍生物。
文檔編號A61P5/50GK1684705SQ03823520
公開日2005年10月19日 申請日期2003年8月1日 優先權日2002年8月1日
發明者G·J·S·庫珀, C·M·比沙南, G·C·詹姆斯 申請人:普羅特米克斯公司