專利名稱：一組具有抗神經細胞凋亡功效的化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組具有抗神經細胞凋亡功效的化合物，具體地說是從遠志植物中提取、分離的酚酮及皂苷類化合物。
背景技術：
遠志為常見中藥材，始載于《神農本草經》，列為上品，被視為養命之要藥。《中國藥典》(2000版)收載了2種基源植物遠志Polygala tenuifolia和卵葉遠志P.sibirica，其藥用部位為根。本品味苦、辛、溫，歸心、腎、脾經，具有安神益智、祛痰、消腫等功效(國家藥典委員會編，中華人民共和國藥典一部，2000123)。
據報道，遠志中主要含有酮類、糖酯類、皂苷類及生物堿等成分(姜勇等.中草藥，32(8)759，2001；Phytochemistry，2002，60(8)813；中草藥，2002，33(10)874)。但是關于其活性成分的研究報道卻很少。
發明內容
本發明的目的在于通過多種提取、分離手段，進一步從遠志植物中提取、分離出新的具有益智和抗老年癡呆作用的活性單體化合物。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的利用多種提取、分離手段，包括溶劑提取法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、正反硅膠柱層析、sephadex LH-20柱層析和制備HPLC等方法，系統研究了遠志的化學成分。從中分離得到了50多個化合物，其中新化合物19個，具有活性的單體5個，分別為遠志酚酮類化合物C，具有結構式I所示結構 結構式(I)
遠志酚酮類化合物D，具有結構式II所示結構 結構式(II)遠志皂苷類化合物L，具有結構式III所示結構 結構式(III)其中，R1＝ 或
遠志皂苷類化合物J，具有結構式IV所示結構 結構式(IV)其中，R2＝ 或
遠志皂苷類化合物K，具有結構式V所示結構 結構式(V)其中，R3＝ 或 上述5種化合物是由如下的方法制備的將遠志根皮粉碎后用95％ EtOH回流提取，減壓回收溶劑，得到固體浸膏。將此固體浸膏懸浮于水中，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取。
將氯仿萃取物經硅膠柱層析，使用CHCl3-MeOH作為洗脫液，收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展開，Rf位于0.2左右，且斑點在UV燈下呈現桔紅色的流份，將此流份濃縮后依次經羥丙基葡聚糖凝膠(sephadex LH-20)純化(用甲醇洗脫)和硅膠柱層析(用石油醚-丙酮洗脫)，收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展開，Rf位于0.23的流份，經丙酮重結晶得到化合物遠志酚酮D(tenuiphenone D)；收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展開，Rf位于0.21的流份，經丙酮重結晶得到化合物遠志酚酮C(tenuiphenoneC)。
將正丁醇萃取物溶解于水中，上大孔樹脂D101，分別用H2O、20％ EtOH、50％ EtOH及70％ EtOH進行洗脫，得到的各洗脫液分別濃縮、凍干。取50％ EtOH洗脫物，經硅膠柱層析，CHCl3-MeOH-H2O洗脫，收集對硫酸顯紫紅色的皂苷斑點的流份；然后經ODS柱(C18烷基反相硅膠)分離，使用MeOH-H2O洗脫，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上層)中展開，Rf在0.30-0.58之間的流份；然后再經減壓硅膠柱層析分離，使用n-BuOH-EtOAc-H2O(4∶1∶2)的上層為洗脫液進行洗脫，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上層中展開，Rf在0.30，0.37和0.55的流份；最后各流份經HPLC純化，MeOH∶H2O(61∶39，H2O中含0.05％ TFA)為流動相，流速3ml/min，分別收集保留時間為30min，48min及60min的流份，得到的各流份經減壓回收溶劑，冷凍干燥即得各個化合物，經IR、NMR及MS測定為遠志皂苷類化合物L(onjisaponin L)，遠志皂苷類化合物J(onjisaponin J)和遠志皂苷類化合物K(onjisaponin K)。
本發明提供的5個化合物，經活性測定實驗表明，具有抗神經細胞凋亡的功效，可以用于制備益智和抗老年癡呆作用的藥物。
具體實施例方式
實施例1、化合物的制備將遠志根皮11kg粉碎后用95％ EtOH 70L回流提取3h，共提取3次。減壓回收溶劑，得到固體浸膏4.91kg。取2kg浸膏懸浮于水中，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取。
將氯仿萃取物經硅膠柱層析，使用CHCl3-MeOH(體積比為500∶1到60∶40)作為洗脫液梯度淋洗，其中CHCl3-MeOH體積比90∶10時洗脫的流份在石油醚-丙酮(7∶1)中展開，Rf位于0.2左右，且斑點在UV燈下呈現桔紅色，收集此流份，將此流份濃縮后依次經羥丙基葡聚糖凝膠(sephadex LH-20)純化(用甲醇洗脫)和硅膠柱層析(用石油醚-丙酮洗脫)，收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展開，Rf位于0.23的流份，得到遠志酚酮類化合物D(tenuiphenone D)24.1mg；收集在石油醚-丙酮(7∶1)中展開，Rf位于0.21的流份，得到遠志酚酮類化合物C(tenuiphenone C)15.3mg。
遠志酚酮C，類白色固體(丙酮)，mp 197-200℃。HR SI-MS(positive)m/z559.4724(C36H63O4[M+H]+，requires 559.4721，581.4540[M+Na]+。IR νmaxKBrcm-13281(-OH)，2918，2850(-CH2，-CH3)，1657(共軛-C＝O)，1602，1525，1469(芳環)，720(-(CH2)n，n≥4)。EI-MS(m/e)43[C3H7]+，57[C4H9]+，71[C5H11]+，97[C5H11-CH＝CH-]+，111[C5H11-CH＝CH-CH2]+...，153[C7H5O4]+，168[C8H7O4+H]+，181[C9H9O4]+...。1HNMR(丙酮)δ11.81(2，6-OH)，9.14(4-OH)，5.90(2H，s，H-3，5)，5.33(2H，t，J＝4.8Hz，H-24)，3.05(2H，t，J＝7.5Hz，-COCH2-)，2.04(m，-CH2CH＝)，1.65(2H，m，-COCH2CH2-)，1.27(brs，-CH2-)，0.87(3H，t，J＝6.9Hz，CH3)。13C NMR(丙酮)δ206.33(-CO-，overlapped)，164.27，165.40(C-2’，5’，4’，信號之間可以互換)，95.69(C-3’，5’)，130.44(C-24，25)，44.39(-CH2CO)，32.53，30.57-29.03，27.69，25.44，23.23(-CH2-)，14.31(-CH3)。
遠志酚酮D，類白色固體(丙酮)，mp 197-200℃。HR SI-MS(positive)m/z587.5057(C38H67O4[M+H]+，requires 587.5034)，609.4823[M+Na]+。IR νmaxKBrcm-13285(-OH)，2918，2850(-CH2，-CH3)，1659(共軛-C＝O)，1603，1525，1472(芳環)，720(-(CH2)n，n≥4)。EI-MS(m/e)43[C3H7]+，57[C4H9]+，71[C5H11]+，97[C5H11-CH＝CH-]+，111[C5H11-CH＝CH-CH2]+...，153[C7H5O4]+，168[C8H7O4+H]+，181[C9H9O4]+...。1HNMR(丙酮)δ11.70(2，6-OH)，9.14(4-OH)，5.91(2H，s，H-3，5)，5.35(2H，t，J＝4.8Hz，H-26)，3.05(2H，t，J＝7.5Hz，-COCH2-)，2.04(m，-CH2CH＝)，1.65(2H，m，-COCH2CH2-)，1.29(brs，-CH2-)，0.87(3H，t，J＝6.9Hz，CH3)。13C NMR(丙酮)δ206.33(-CO-，overlapped)，164.96，164.92(C-2’，5’，4’，信號之間可以互換)，95.60(C-3’，5’)，130.44(C-26，27)，44.36(-CH2CO)，32.53，30.78-29.00，27.67，25.49，23.28(-CH2-)，14.32(-CH3)。
將正丁醇萃取物溶解于水中，上大孔樹脂D101，分別用H2O、20％ EtOH、50％ EtOH及70％ EtOH進行洗脫，得到的各洗脫液分別濃縮、凍干。取50％ EtOH洗脫物，經硅膠柱層析，CHCl3-MeOH-H2O洗脫，收集對硫酸顯紫紅色的皂苷斑點的流份；然后經ODS柱(C18烷基反相硅膠)分離，使用MeOH-H2O洗脫，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上層)中展開，Rf在0.30-0.58之間的流份；然后再經減壓硅膠柱層析分離，使用n-BuOH-EtOAc-H2O(4∶1∶2)的上層為洗脫液進行洗脫，收集在n-BuOH∶HCOOH∶H2O(60∶3∶37上層中展開，Rf在0.30，0.37和0.55的流份；最后各流份經HPLC純化，MeOH∶H2O(61∶39，H2O中含0.05％ TFA)為流動相，流速3ml/min，分別收集保留時間為30min，48min及60min的流份，得到的各流份經減壓回收溶劑，冷凍干燥即得各個化合物，經IR、NMR及MS測定為遠志皂苷類化合物L(onjisaponin L)，J(onjisaponin J)和K(onjisaponin K)。
遠志皂苷L，白色無定型粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應陽性。TOF-MS(m/e)1866[M+NH4]+。1H NMR(C5D5N)δ7.91(1H，d，J＝16.0Hz，H-β ofE-cinnamoyl)，6.50(1H，d，J＝15.5Hz，H-αof E-cinnamoyl)/6.87(1H，d，J＝12.5Hz，H-β ofZ-cinnamoyl)，5.95(1H，d，J＝13.0Hz，H-αof Z-cinnamoyl)；7.36(1H，d，J＝8.5Hz，H-2，6of E-cinnamoyl)，6.95(1H，d，J＝8.5Hz，H-3，5 of E-cinnamoyl)/7.97(1H，d，J＝9.0Hz，H-2，6 of Z-cinnamoyl)，7.01(1H，d，J＝8.5Hz，H-3，5 of Z-cinnamoyl)，3.65(3H，s，OCH3ofE-cinnamoyl)/3.60(3H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，4.90(1H，d，J＝8.0Hz，Gal-1)，5.01(1H，d，J＝8.0Hz，Glc-1)，5.18(1H，d，J＝8.0Hz，Xyl-1)，5.52(1H，brs，Rha-1′)，5.79(1H，brs，Rha-1)，6.08(1H，overlapped，Api-1)，6.07(1H，overlapped，Fuc-1)。13C NMR數據見表1。
遠志皂苷J，白色無定型粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應陽性。TOF-MS(m/e)1836[M+NH4]+。1H NMR(C5D5N)δ7.93(1H，d，J＝15.9Hz，H-β ofE-cinnamoyl)，6.50(1H，d，J＝15.9Hz，H-αof E-cinnamoyl)/6.90(1H，d，J＝12.9Hz，H-β ofZ-cinnamoyl)，6.00(1H，d，J＝12.9Hz，H-α of Z-cinnamoyl)；7.38(1H，d，J＝8.4Hz，H-2，6of E-cinnamoyl)，6.97(1H，d，J＝8.7Hz，H-3，5 of E-cinnamoyl)/8.00(1H，d，J＝8.4Hz，H-2，6 of Z-cinnamoyl)，7.03(1H，d，J＝9.0Hz，H-3，5 of Z-cinnamoyl)，3.66(3H，s，OCH3ofE-cinnamoyl)/3.62(3H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，5.03(1H，d，J＝7.6Hz，Glc-1)，5.16(1H，d，J＝6.9Hz，Ara-1)，5.25(1H，d，J＝7.5Hz，Xyl-1)，5.54(1H，brs，Rha-1′)，5.78(1H，brs，Rha-1)，6.04(1H，overlapped，Api-1)，6.07(1H，d，J＝7.7Hz，Fuc-1)。13C NMR數據見表1。
遠志皂苷K，白色無定型粉末，Liebermann-Burchard和Molish反應陽性。TOF-MS(m/e)1623.6[M+Na]+。1H NMR(C5D5N)δ7.93(1H，d，J＝16.0Hz，H-β ofE-cinnamoyl)，6.58(1H，d，J＝15.5Hz，H-α of E-cinnamoyl)/6.85(1H，d，J＝13.0Hz，H-βof Z-cinnamoyl)，5.99(1H，d，J＝12.5Hz，H-α of Z-cinnamoyl)，6.81(2H，s，H-2，6 ofE-cinnamoyl)/7.37(2H，s，H-2，6 of Z-cinnamoyl)，3.85(3H，s，OCH3of E-cinnamoyl)/3.83(3H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，3.78(6H，s，OCH3of E-cinnamoyl)/3.75(6H，s，OCH3of Z-cinnamoyl)，5.04(1H，d，J＝7.5Hz，Glc-1)，5.31(1H，d，J＝7.5Hz，Xyl-1)，6.03(1H，d，J＝4.0Hz，Api-1)，6.13(1H，d，J＝8.5Hz，Fuc-1)，6.25(1H，brs，Rha-1)。13C NMR數據見表1。
表1 遠志皂苷L的13C NMR數據(溶劑為C5D5N)L J K L J K1 44.0 44.144.0 C-3sugar2 69.9 70.270.6 Glc-1105.1 105.2 105.03 85.7 85.985.7 275.0 75.1 75.04 52.6 52.852.7 378.1 78.2 78.15 52.3 52.452.4 471.2 71.5 71.56 21.0 21.221.0 578.1 78.2 78.17 33.7 33.833.5 662.4 62.6 62.48 41.0 41.241.8 C-28sugar9 49.1 49.249.0 Fuc-194.8 94.8 94.210 36.8 37.036.8 276.4 76.8 75.811 23.3 23.523.9 380.1 79.7 74.312 127.5 127.7 127.6 473.2 73.2 74.713 138.8 138.9 138.7 570.7 70.9 70.614 46.8 46.946.7 616.9 16.8 16.415 24.3 24.524.2 Rha-1(F-2) 101.9 102.1 102.0/102.116 23.9 24.123.9 271.5 71.7 71.517 47.7 47.947.6 382.3 82.2 81.918 41.9 42.141.8 478.1 78.0 78.319 45.3 45.545.1 568.7 68.7 68.320 30.6 30.830.6 618.6 18.6 18.621 33.7 33.833.5 Rha-1(F-3) 104.8 104.722 32.0 32.232.1 272.1 72.123 180.8 180.9 180.9 373.2 72.724 14.0 14.114.1 472.4 73.625 17.4 17.617.2 570.8 70.726 18.9 19.118.9 618.7 18.627 64.3 64.464.4 Xyl-l104.7 104.7 105.128 176.4 176.4 176.6 275.0 74.2 75.429 32.9 33.132.8 376.3 86.2 78.330 23.9 24.123.9 478.0 69.3 71.3Cinn.564.6 66.4 67.01 127.2/127.5127.4/127.6 130.5 Api-1111.3 111.5 111.2/130.22 130.3/133.1130.4/133.2 106.1 277.3 78.0 77.6/108.93 114.6/113.9114.8/114.1 140.8 378.1 78.4 78.1/139.94 161.8/160.9162.0/161.1 153.9 474.3 74.4 74.7/153.15 114.6/113.9114.8/114.1 140.8 566.4 66.6 66.6/139.96 130.3/133.1130.4/133.2 106.1 Gal-1104.3/108.97 145.5/144.6145.6/144.7 145.8 271.7/144.28 115.5/116.2115.7/116.3 117.5 374.9/118.59 167.0/166.2167.1/166.3 167.4 470.0/166.4OMe55.2/55.0 55.4/55.1 56.1 577.3/55.9 662.256.1
/55.960.5/60.3HMG-1171.5 171.5 171.4 Ara-1105.4246.2 46.3 46.1 272.4369.9 70.0 69.9 374.5446.3 46.9 46.1 469.25174.7 174.9 174.4 567.0OMe 28.2 28.2 28.0實施例2、活性測定一、實驗方法取大鼠小腦顆粒細胞，以1×106個細胞/cm3接種于預先用10mg/L的多聚賴氨酸覆蓋的96孔板中，200μL/孔，置于37℃含5％(體積分數)CO2的培養箱中培養。24h后更換為含10μmol/L阿糖胞苷的培養液，以抑制非神經細胞的增殖。實驗分為空白對照組、模型組和藥物高、低兩個劑量組，每組設6個孔。于培養第四天，藥物組分別加入終濃度為40μg/L、20μg/L的藥物；加藥24h后，模型組和藥物組分別加入終濃度為100μmol/L的MPP+，空白對照組加入等體積的培養基；37℃含5％CO2的培養箱中繼續培養24h后，取出96孔板，向每孔中加入20μL 5mg/mL的MTT(終濃度為0.5mg/mL)，反應4h后，吸去培養液，向每孔中加入200μl的DMSO，輕輕吹打，使藍色顆粒溶解，用全自動酶標儀在波長570nm處測其光密度值(OD值)。實驗重復三次，光密度值高表明細胞存活數高。
二、統計學分析每組設6個復孔，結果以均值±標準差(X±SD)表示；差異顯著性用配對t檢驗。
三、實驗結果由表2數據可以看出，化合物Onjisaponin L、Onjisaponin J、Onjisaponin K、Tenuiphenone C及Tenuiphenone D對神經細胞凋亡的影響與模型組比較有顯著性差異，提示這些化合物對神經細胞具有保護作用。而據現代的藥理學研究表明神經細胞凋亡是導致老年性癡呆的誘因之一，由此提示這些化合物在防治和治療老年性癡呆方面具有很好的前景。
表2 化合物對神經細胞凋亡的影響(40μg/mL，X±SD)藥物名稱 OD值 細胞存活率(％)空白組1.224±0.082 100模型 0.846±0.053###69.12Onjisaponin L 1.018±0.061*** 83.17Onjisaponin J 0.987 ±0.054** 80.64Onjisaponin K 0.984 ±0.082** 80.39Tenuiphenone C1.000±0.049*** 81.70Tenuiphenone D1.006±0.049*** 82.19配對t檢驗與空白組比較，###P＜0.001；與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001本發明利用多種分離手段，包括正反相硅膠柱層析、大孔吸附樹脂柱層析、羥丙基葡聚糖凝膠柱層析和制備高效液相色譜法等，從遠志的植物中分離得到了5個新的化合物，包括酚酮及皂苷類化合物。這些新化合物的發現為今后進一步的藥理活性篩選及臨床研究，開發出療效確切、毒副作用小的新型防治和治療老年性癡呆藥物奠定了物質基礎。
權利要求
1.一種酚酮類化合物，具有結構式I所示結構 結構式(I)
2.一種權利要求1所述酚酮類化合物在制備益智和抗老年癡呆藥物中的用途。
3.一種酚酮類化合物，具有結構式II所示結構 結構式(II)
4.一種權利要求3所述酚酮類化合物在制備益智和抗老年癡呆藥物中的用途。
5.一種皂苷類化合物，具有結構式III所示結構 結構式(III)其中， 或
6.一種權利要求5所述皂苷類化合物在制備益智和抗老年癡呆藥物中的用途。
7.一種皂苷類化合物，具有結構式IV所示結構 結構式(IV)其中， 或
8.一種權利要求7所述皂苷類化合物在制備益智和抗老年癡呆藥物中的用途。
9.一種皂苷類化合物，具有結構式V所示結構 結構式(V)其中， 或
10.一種權利要求9所述皂苷類化合物在制備益智和抗老年癡呆藥物中的用途。
全文摘要
本發明利用多種分離手段，包括正反相硅膠柱層析、大孔吸附樹脂柱層析、sephadex LH－20柱層析和制備高效液相色譜法等，從遠志的植物中分離得到了5個新的化合物，包括酚酮及皂苷類化合物。這5個化合物，經活性測定實驗表明，具有抗神經細胞凋亡的功效，可以用于制備預防和治療抗老年性癡呆作用的藥物。
文檔編號C07J63/00GK1631865SQ20031012241
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月23日 優先權日2003年12月23日
發明者姜勇, 屠鵬飛 申請人:北京大學