專利名稱：抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，是一種生物藥品的制作方法。
背景技術：
從2002年11月16日中國廣東佛山發現第一例非典型肺炎(SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS)的病例以來，SARS首先在廣東省傳播開來，并迅速蔓延到世界各地，根據世界衛生組織(WHO)的最新統計，截止到4月26日，世界上已經有28國家和地區成為SARS的發病地區，全球共發生SARS病例4836例，死亡293例。中國大陸境內病人已達2753例，死亡122例。我國廣東省成為本次SARS的最初發病地和大面積流行地區。從SARS發生的那一刻開始，人們就對其致病的真正元兇-病原體進行了大量的追查，并從SARS病人體內分離到了冠狀病毒。荷蘭ERASMUS大學實驗室的科學家成功完成冠狀病毒實驗的動物模型，確證導致全球肆虐的SARS病癥是由一種新型冠狀病毒引起的。這一研究結果證實了全球科學家基于近期研究的主流觀點，國際病毒學界確認病原的“科斯假設”(KOCH’POSTULATES)四條件全部滿足。4月16日，WHO在日內瓦正式宣布，SARS病原已經找到，正式命名為SARS冠狀病毒。同時各國的科學家通過夜以繼日的工作，已成功破譯了SARS冠狀病毒全部基因組序列。根據SARS病毒的全基因序列分析結果，SARS病毒基因組結構與其他冠狀病毒的結構相似。預測得到的主要蛋白質有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)，纖突蛋白(Spike protein，S)，小膜蛋白(small membrane protein，E)，膜蛋白(Membrane protein，M)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N)等。根據核苷酸序列及推導的氨基酸序列比較結果，發現SARS冠狀病毒不屬于已知的冠狀病毒三個群中的任何一群，與已知的人與動物的冠狀病毒均不同，為一種新的冠狀病毒。
在美國國家生物信息中心(NCBI)，以SARS病毒為查詢序列進行搜索，發現下列幾種病毒和SARS病毒的序列相似性較高人的冠狀病毒(Humancoronavirus 229E)，小鼠的肝炎病毒(Murine hepatitis virus，MHV)，禽的傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)，牛的冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCV)，豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)，豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)。總體上看，幾種病毒的基因組結構非常相似。通過病毒基因組之間的比較，發現在14k-16k的位置是所有冠狀病毒都較為保守的區域。這一區域編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RDRP)。同時WHO公布的研究結果證明，用TGEV、HCoV 229E、MHV和貓腹膜炎病毒(Feline InfectiousPeritonitis virus，FIPV)的高免血清可以抑制SARS病毒的增殖。從高免動物(如兔、雞、牛、羊等)的血清或初乳中分離IgG，在被動免疫治療中有很重要的意義和價值。但這些來源提供的IgG產量低，成本高，通常只能局限于實驗室的免疫學診斷和基礎研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，以降低成本，提高抗體的穩定性，預防多種疾病，提高生物藥品的性能。
上述的目的通過以下的技術方案實現抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，所述的方法包括制作疫苗原，抗體制備、卵黃勻漿、稀釋、低溫過夜、過濾純化，制粉，其中所述的抗SARS禽卵黃抗體的制備方法是選擇100-140日齡SPF禽，首次免疫1.5-3.5ml，胸部肌肉注射2-4個部位，間隔2-4周重復加強免疫，每周采血監測抗體效價，二免1-2周后收集經抗體檢驗合格的禽卵，每周采血檢測抗體，中和抗體效價不低于1:256為合格，三免時間依據抗體監測情況決定，注射量與二免相同。
這個技術方案有以下有益效果1.近幾十年來，國內外學者就卵黃抗體的研究和開發作了許多工作，證明了免疫雞的蛋是提供特異性IgG的最方便、最廉價的來源。雞卵黃IgG是一種7S免疫球蛋白，與哺乳動物IgG略有不同。該蛋白的分子量約為180kDa，含兩個亞單位，即67-70kDa的重鏈和22-30kDa的輕鏈，又稱IgY(Yolk Immunoglobulin)。
2.卵黃中IgG的含量實際上等于甚至要高于母禽血清中的IgG。一只母禽在一個月中生產蛋制備卵黃抗體相當于500ml血清抗體。母禽通過兩種途徑將其全部同型抗體轉移到禽蛋首先是循環血液中的血漿將抗體轉移到成熟的卵泡中(也就是進入到卵黃中)，這種選擇性轉移到卵巢濾泡的a-球蛋白主要是IgG，這種由IgG受體決定的抗體轉移決定著母源血液中存在的全部IgG亞群選擇性向卵巢濾泡轉移。在輸卵管中進行的抗體轉移過程的第二個途徑只涉及到IgM和IgA，轉移的部位在蛋清，這為我們制備和利用卵黃IgG提供了方便條件。
3.IgY的生物學特性決定了它廣泛的應用領域。在免疫診斷方面，禽IgY具有不激活人類補體，不與蛋白A、蛋白G、哺乳動物Fc受體、補體以及類風濕因子結合等免疫學特性，與IgG幾無交叉反應，所以早就在醫學領域得到了廣泛應用。在免疫治療方面，因IgY耐熱、耐酸且性能穩定，水溶劑4℃保存120天、-20℃保存180天抗體效價不變，如果凍干或噴霧干燥則保存期可大大延長，可經過口服途徑治療年幼動物或人類的腸道傳染病，如嬰兒防病食品，齲齒預防，以及嬰幼兒輪狀病毒、人流感、弓形蟲病的防治等等。在國外，已經有應用抗豬致病性大腸桿菌卵黃抗體和抗犢牛沙門氏菌卵黃抗體治療豬致病性大腸桿菌和犢牛沙門氏菌感染的報道，國內也有相似的研究。國內廣泛使用的有雞傳染性法氏囊病、雞新城疫、小鵝瘟、鴨瘟、雞減蛋綜合癥、鴨肝炎、雞病毒性關節炎、雞傳染性喉氣管炎卵黃抗體等等。卵黃抗體對雞、鴨、鵝、豬、牛的治療實踐證明，對機體無任何毒副作用。
4.卵黃作為特異性抗體IgY的來源有許多優點。如母禽易于飼養，費用不高；收集雞蛋方便；無須抽取動物血液，無損傷，符合現代動物保護規則；產生有效的抗體反應所需抗原量小；在國內，禽是率先實現SPF化和產業化的實驗動物，有利于規模化生產；禽類與以人為代表的哺乳動物親緣關系較遠，有利于疾病控制，用禽生產人用的免疫球蛋白，不會將導致人類疾病的病原微生物引入到病人的體內，可以解決治療上的后顧之憂。家禽作為一個有效的抗體生產者，在用單一佐劑抗原免疫后，可長期維持抗體效價，在免疫后1周血清抗體的水平即反應到卵黃中，而且IgG只被分泌到卵黃中，快速、特異、持續時間長、對外界因素抗性強的特點使卵黃抗體十分適應當前“非典”防疫上的迫切需要，可以為“非典”治療和控制發揮重要作用。
附圖1是本發明的技術路線圖。
本發明的
具體實施例方式實施例1抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，所述的方法包括制作疫苗原，抗體制備、卵黃勻漿、稀釋、低溫過夜、過濾純化，制粉。
本發明根據附圖1給出的具體的工藝路線完成，具體過程詳細解釋如下1.免疫原的制備。選擇SARS病毒培養物經β-丙內脂滅活，聚乙二醇-6000濃縮8-15倍做水相。MAUTAMIDEISA-70為油相，按15-20∶50-80高速乳化成油包水型免疫原。
2.抗SARS禽卵黃抗體的制備。選擇100-140日齡的SPF禽，例如120日齡SPF禽，首次免疫1.5-3.5ml，胸部肌肉注射2-4個部位。間隔2-4周重復加強免疫(二免)。每周采血監測抗體效價，二免1-2周后收集經抗體檢驗合格的禽卵。每周采血檢測抗體，中和抗體效價不低于1∶256為合格。三免時間依據抗體監測情況決定，注射量與二免相同。
3.抗SARS禽卵黃抗體的提純。
抗SARS禽卵黃抗體合格蛋，用1∶1000-1500稀釋的金碘水溶液將禽卵洗凈、涼干，于超凈工作臺分離蛋黃。分離的蛋黃與雙蒸水按1∶2-4比例混合，放入搗碎機中以8000-20000/分的轉速攪拌2-4分鐘備用。
(1)將上述制備的卵黃液與溶劑(丙酮1-2份、石油醚4-6份)按1∶0.5-1.5的比例混合并高速攪拌(8000-20000轉/分，1-4分鐘)后離心10000克10-15分鐘，如此重復2-4次，保留水相棄油相和沉淀。
(2)將上述制備的卵黃液中加入海藻酸鈉使其終濃度為0.14-0.2％并調PH為6.0-7.0，高速攪拌(8000-20000轉/分，2-4分鐘)，離心10000克10-15分鐘，140-150目銅網過濾、棄沉淀。用飽和硫酸銨溶液與濾液混合制成50-60％的硫酸銨溶液并調PH至7.0-8.0，高速攪拌(8000-20000轉/分，2分鐘)后離心10000克10-15分鐘棄上清，沉淀用20-40％硫酸銨溶解并調PH7.0-8.0高速攪拌(8000-20000轉/分，2分鐘)后離心10000克10-20分鐘，如此重復二次之后用PBS溶解沉淀并透析。
4.SARS卵黃粉的制備工藝。
經測定卵黃和血清的中和抗體效價256倍以上為合格蛋，用1∶1000稀釋的金碘水溶液將禽蛋洗凈、涼干，于超凈工作臺分離卵黃。分離的蛋黃與雙蒸水按1∶2-4比例混合，放入搗碎機中以8000-20000/分的轉速攪拌2-4分鐘，放于-10℃以下冰柜備用。將1∶2-4比例稀釋的卵黃液10000克4℃離心30-40分鐘棄沉淀，140-150目銅網過濾，濾液濃縮2-4倍。噴霧干燥入口溫度120-160℃、出口溫度55-85℃。噴霧干燥蛋黃粉密封保存于2-8℃冷庫中，有效期1年，10-20℃保存有效期1個月。
5.病毒中和試驗。
病毒的禽胚半數感染量(ELD50)測定將SARS病毒用生理鹽水按濃度梯度10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13進行稀釋，分別接種10-20日齡SPF禽胚，每個稀釋度一組，每組4-8只禽胚，接種量0.1-0.5ml/胚。棄去接種后48小時前死亡胚，記錄48-120小時感染數和未感染數，按Reed-Muech法計算雞胚半數感染量。
病毒中和試驗將病毒分別稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，分別與等量的抗體原液混合，充分混勻后，置4℃反應2-4小時。將10-20日齡的SPF禽胚分成三組接種病毒第一組為正常血清對照組，接種正常血清；第二組為抗體毒性對照組，只接種抗體；第三組接種病毒和抗體的混合液，接種劑量0.1-05ml/胚。接種后，37℃培養，統計24小時后感染和未感染的雞胚，直至130-150小時，計算高免卵黃提純抗體的病毒中和指數，1∶256以上合格。
權利要求
1.一種抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的方法包括制作疫苗原，抗體制備、卵黃勻漿、稀釋、低溫過夜、過濾純化，制粉，其中所述的抗SARS禽卵黃抗體的制備方法是選擇100-140日齡SPF禽，首次免疫1.5-3.5ml，胸部肌肉注射2-4個部位，間隔2-4周重復加強免疫，每周采血監測抗體效價，二免1-2周后收集經抗體檢驗合格的禽卵，每周采血檢測抗體，中和抗體效價不低于1∶256為合格，三免注射量與二免相同。
2.根據權利要求1所述的抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的免疫原的制備是選擇SARS病毒培養物經β-丙內脂滅活，聚乙二醇-6000濃縮8-15倍做水相。MAUTAMIDEISA-70為油相，按15-20∶50-80高速乳化成油包水型免疫原。
3.根據權利要求1或2所述的抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的均漿方式為用1∶1000-1500稀釋的金碘水溶液將禽卵洗凈、涼干，于超凈工作臺分離蛋黃，分離的蛋黃與雙蒸水按1∶2-4比例混合，放入搗碎機中以8000-20000/分的轉速攪拌2-4分鐘。
4.根據權利要求1或2所述的抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的過濾純化過程包括(1)將上述制備的卵黃液與溶劑(丙酮1-2份、石油醚4-6份)按1∶0.5-1.5的比例混合并高速攪拌(8000-20000轉/分，1-4分鐘)后離心10000克10-15分鐘，如此重復2-4次，保留水相棄油相和沉淀；(2)將上述制備的卵黃液中加入海藻酸鈉使其終濃度為0.14-0.2％并調PH為6.0-7.0，高速攪拌(8000-20000轉/分，2-4分鐘)，離心10000克10-15分鐘，140-150目銅網過濾、棄沉淀。用飽和硫酸銨溶液與濾液混合制成50-60％的硫酸銨溶液并調PH至7.0-8.0，高速攪拌(8000-20000轉/分，2分鐘)后離心10000克10-15分鐘棄上清，沉淀用20-40％硫酸銨溶解并調PH7.0-8.0高速攪拌(8000-20000轉/分，2分鐘)后離心10000克10-20分鐘，如此重復二次之后用PBS溶解沉淀并透析。
5.根據權利要求3所述的抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的過濾純化過程包括(1)將上述制備的卵黃液與溶劑(丙酮1-2份、石油醚4-6份)按1∶0.5-1.5的比例混合并高速攪拌(8000-20000轉/分，1-4分鐘)后離心10000克10-15分鐘，如此重復2-4次，保留水相棄油相和沉淀；(2)將上述制備的卵黃液中加入海藻酸鈉使其終濃度為0.14-0.2％并調PH為6.0-7.0，高速攪拌(8000-20000轉/分，2-4分鐘)，離心10000克10-15分鐘，140-150目銅網過濾、棄沉淀。用飽和硫酸銨溶液與濾液混合制成50-60％的硫酸銨溶液并調PH至7.0-8.0，高速攪拌(8000-20000轉/分，2分鐘)后離心10000克10-15分鐘棄上清，沉淀用20-40％硫酸銨溶解并調PH7.0-8.0高速攪拌(8000-20000轉/分，2分鐘)后離心10000克10-20分鐘，如此重復二次之后用PBS溶解沉淀并透析。
6.根據權利要求1或2或5所述的抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的SARS卵黃粉的制備工藝過程包括經測定卵黃和血清的中和抗體效價256倍以上為合格蛋，用1∶1000稀釋的金碘水溶液將禽蛋洗凈、涼干，于超凈工作臺分離卵黃。分離的蛋黃與雙蒸水按1∶2-4比例混合，放入搗碎機中以8000-20000/分的轉速攪拌2-4分鐘，放于-10℃以下冰柜備用。將1∶2-4比例稀釋的卵黃液10000克4℃離心30-40分鐘棄沉淀，140-150目銅網過濾，濾液濃縮2-4倍。噴霧干燥入口溫度120-160℃、出口溫度55-85℃。
7.根據權利要求3所述的抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的SARS卵黃粉的制備工藝過程包括經測定卵黃和血清的中和抗體效價256倍以上為合格蛋，用1∶1000稀釋的金碘水溶液將禽蛋洗凈、涼干，于超凈工作臺分離卵黃。分離的蛋黃與雙蒸水按1∶2-4比例混合，放入搗碎機中以8000-20000/分的轉速攪拌2-4分鐘，放于-10℃以下冰柜備用。將1∶2-4比例稀釋的卵黃液10000克4℃離心30-40分鐘棄沉淀，140-150目銅網過濾，濾液濃縮2-4倍。噴霧干燥入口溫度120-160℃、出口溫度55-85℃。
8.根據權利要求4所述的抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，其特征是所述的SARS卵黃粉的制備工藝過程包括經測定卵黃和血清的中和抗體效價256倍以上為合格蛋，用1∶1000稀釋的金碘水溶液將禽蛋洗凈、涼干，于超凈工作臺分離卵黃。分離的蛋黃與雙蒸水按1∶2-4比例混合，放入搗碎機中以8000-20000/分的轉速攪拌2-4分鐘，放于-10℃以下冰柜備用。將1∶2-4比例稀釋的卵黃液10000克4℃離心30-40分鐘棄沉淀，140-150目銅網過濾，濾液濃縮2-4倍。噴霧干燥入口溫度120-160℃、出口溫度55-85℃。
全文摘要
抗非典型肺炎卵黃抗體的制作方法，本發明涉及一種抗非典的生物藥品的制作方法。我們發現有幾種高免動物的IgG和SARS病毒的序列相似性較高，基因組結構非常相似。但從高免動物的血清或初乳中分離IgG，產量低，成本高。本產品的制作方法包括制作疫苗原，抗體制備、卵黃勻漿、稀釋、低溫過夜、過濾純化，制粉，其中所述的抗體的制備方法是選擇100－140日齡SPF禽，首次免疫1.5－3.5ml，胸部肌肉注射2－4個部位，間隔2－4周重復加強免疫，每周采血監測抗體效價，二免1－2周后收集經抗體檢驗合格的禽卵，每周采血檢測抗體，中和抗體效價不低于1∶256為合格，三免時間依據抗體監測情況決定，注射量與二免相同。本方法用于制作抗SARS生物藥品。
文檔編號A61P11/00GK1546526SQ20031010773
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月2日 優先權日2003年12月2日
發明者孔憲剛, 王治國, 付朝陽, 王笑梅, 高洪雷, 周琦 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所