一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因的克隆及其應用的制作方法

專利名稱：一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因的克隆及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，是一種具有應用前景的植物新基因，即苦蕎過敏性貯藏蛋白基因(Tartary buckwheat allergenic storage protein(簡稱TBc)，其表達的蛋白，以及部分多核苷酸片段(簡稱TBa)和表達產物的純化。
背景技術：
蕎麥屬于蓼科植物，其栽培種分為甜蕎(Fagopyrum esculentum)和苦蕎(Fagopyrum)tataricum)兩種。前者在亞洲、歐洲和拉美等國栽培較廣，后者在國內西南和一些北方高寒地區普遍栽培。苦蕎麥不僅是一種良好的膳食營養源，也是一種具有食療、食補作用的傳統藥用植物。許多研究和使用證明苦蕎麥能有效的降低人體血糖、血脂和尿糖，對糖尿病和高血壓等心腦血管疾病有很好的預防和治療效果。近年來國內的一些苦蕎功能保健產品相繼面市，受到消費者的普遍歡迎，市場前景廣闊。但蕎麥中所含的過敏源也可引起接觸和食用蕎麥食品的人群產生過敏癥狀。因此，國外有不少科學家開始研究甜蕎(common buckwheat)中的過敏成分，在國內對蕎麥中的過敏成分的研究尚屬起步，而對苦蕎麥(tartary buckwheat)主要過敏源基因的克隆、表達則未見報道。利用克隆、表達技術獲得苦蕎主要過敏性蛋白，可為下一步大規模生產苦蕎過敏源，用于過敏性診斷及分子改造奠定基礎。
過敏反應是人類常見的一類免疫疾病，由于它癥狀復雜，種類繁多，危害廣泛且很難根治，所以長期以來一直是醫學界的一大難題。目前，對植物來源過敏蛋白研究較多的有水稻、花生和大豆。2001年Bannon等報道了重組花生過敏原用于過敏性檢測和免疫治療的體外免疫效果，從而為花生過敏患者提供了一種安全可靠的免疫檢測和治療手段。目前，有關蕎麥重組過敏源的研究國內外研究較少，日本學者2001年報道了甜蕎中的主要過敏源，而有關苦蕎主要過敏蛋白基因及其重組過敏蛋白的研究在國內外尚屬空白。本發明獲得的基因及其表達產物可為臨床過敏反應的診斷與治療增加新內容，其中苦蕎過敏蛋白基因可制備低致敏DNA疫苗的用途，基因產物苦蕎過敏蛋白可用于蕎麥過敏病人的脫敏治療等方面，從而填補蕎麥研究領域的一項空白。

發明內容
本發明的目的是提供一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白(tartary buckwheat allergen)全長cDNA基因(簡稱TBc)及其制備方法。以及它編碼的苦蕎麥過敏性貯藏蛋白，該蛋白具有與特異性抗體IgE結合位點，能促發由IgE介導的I型過敏反應。
本發明的另一個目的是提供一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白C端多肽片段(簡稱TBa)及其它的原核表達方法和表達產物的純化及應用。
本發明提供的苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因TBc的cDNA核苷酸序列，含有1548核苷酸，包括啟始密碼子ATG和終止密碼子TAA。如圖1所示。
所述的cDNA全長基因編碼一個515氨基酸組成的的蛋白質，它的通順閱讀框包含一段22個氨基酸的信號肽序列和一個493氨基酸的成熟蛋白。如圖2所示。
所述苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因的制備方法，其特征在于包括如下步驟(a)、提取苦蕎麥總RNA并以其為模板，合成cDNA第一鏈；(b)、采用RT-PCR和3′RACE法擴增3′端585核苷酸及其3′端尾部序列；(c)、根據步驟(b)得到的部分基因設計特異性引物擴增5’端及全長基因序列。
所述的苦蕎麥過敏性貯藏蛋白，含有C端的第321位至515位的多肽片段TBa。如圖3所示。
所述的多肽片段TBa含有195個氨基酸，為它編碼的基因包含585個核苷酸序列和終止密碼子TAA。
一種載體，即多肽片段TBa的重組表達載體，含有編碼多肽片段TBa的核苷酸序列和原核載體，它是將3′端585個核苷酸基因片段克隆至原核表達載體后獲得的重組子pET28a-TBa。所述的載體，是質粒，含有T7啟動子。
一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白工程菌，它含有如前所述的載體。是將所述的多肽片段C端基因重組子轉化至一種菌中，例如大腸桿菌BL21細胞中，構建成工程菌，例如pET28a-TBa/BL21。
多肽片段TBa的表達方法，是在合適表達TBa的條件下，培養工程菌，IPTG誘導表達目的蛋白，從培養物種分離、純化目的蛋白TBa。具體包括如下步驟(a)、構建pET28a-TBa表達載體；(b)、將pET28a-TBa按照標準法轉化至菌中，工程菌株接種在含卡那霉素的LB培養基中，誘導表達2-4小時；(c)、收集菌體，破碎細胞，層析純化，冷凍干燥后獲得產品。
優選將pET28a-TBa表達載體轉化到大腸桿菌BL21中，構建大腸桿菌pET28a-Tba/BL21，接種在含卡那霉素的LB培養基中，37℃，200r/min振蕩培養至O.D 600nm為0.6，加入IPTG使終濃度為0.1mmol/L，誘導表達2-4小時；收集菌體，破碎細胞，將上清經親和層析純化，合并每次柱洗脫獲得的目的蛋白，冷凍干燥后獲得產品。
苦蕎麥過敏性貯藏蛋白全基因通過Blast分析，表明與甜蕎的主要過敏性貯藏蛋白全長cDNA有91％的同源性，與甜蕎豆球類蛋白及13S貯藏蛋白的全長cDNA有近90％的同源性，說明得到的苦蕎過敏蛋白全長cDNA序列為苦蕎中一新基因。
采用免疫印記法(Western Bloting)和酶聯免疫測定法(ELISA)證明，苦蕎麥過敏性貯藏蛋白具有與特異性抗體IgE結合位點，能促發由IgE介導的I型過敏反應。苦蕎過敏性蛋白基因編碼的蛋白質，是具有一定生物學功能的新型植物過敏源，苦蕎過敏蛋白基因可用于制備低致敏DNA疫苗。過敏蛋白在制備診斷和治療特異性苦蕎過敏癥藥物中的用途。


附圖1苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因TBc的全長cDNA序列以及推測的氨基酸序列。
附圖2苦蕎麥過敏性貯藏蛋白全長氨基酸序列。
附圖3苦蕎麥過敏性貯藏蛋白C端多肽片段(TBa)的氨基酸序列。
附圖4重組表達載體pET28a-TBa結構示意圖。
附圖5重組表達產物TBa的SDS-PAGE電泳圖，圖中Mr為分子量標準，1為表達產物，2為純化后的表達產物。
具體實施例實施例1 苦蕎麥過敏蛋白基因全長cDNA的克隆步驟一，苦蕎麥總RNA提取及cDNA第一鏈的合成取苦蕎種子適量，洗凈，30℃萌發至根尖1cm左右，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。以苦蕎總RNA為模板，以Oligo(dT)為引物合成非端部擴增所用cDNA第一鏈，稱作cDNA1。另以總RNA為模板，以3′RACE試劑盒提供的引物AP(5′-ggc cac gcg tcg act agt act ttt ttt tttttt ttt t-3′)合成擴增3′端所用cDNA第一鏈，稱作cDNA2。合成的cDNA1和cDNA2分別在-20℃保存備用。
步驟二，苦蕎麥主要過敏源基因TBa及其3′末端的克隆采用RT-PCR和3′RACE法擴增過敏源基因B亞基TBa及其3′末端序列，具體操作是根據本室先前從苦蕎中純化、測序所得的該過敏蛋白的N-末端氨基酸序列和文獻報道的甜蕎BT1蛋白質序列推測出相應核苷酸序列設計PCR引物I5′-gga ttg gaa caa gcg ttc tgcaac ct-3′、引物II5′-aac aat aga gaa acg ttc cct ctc ct-3′用于TBa的擴增。另采用引物I和引物AUAP5′-ggc cac gcg tcg act agt ac-3′用于3’末端序列的擴增。每50μl PCR反應體系分別加入1μl cDNA1和cDNA2作為模板，PCR擴增，電泳檢測，發現分別在600bp和400bp附近出現預期的特異性擴增條帶，回收此條帶分別連接至T-easy載體，構建重組質粒pGEM-T-TBa，轉化大腸桿菌DH5α，挑選重組克隆測序。測序結構表明，以cDNA1為模板獲得的基因片段由585個堿基組成，用Blast數據庫同源性分析顯示585bp片段與甜蕎主要過敏蛋白BT1同源性達93％，可編碼一個長度為195個氨基酸組成的多肽片段，此多肽是蕎麥中的主要過敏性成份之一。另外以cDNA2為模板獲得的基因片段由404個堿基組成，包括終止密碼子TAA和加尾信號(polyA)。若去除尾部polyA序列，可獲得一個編碼195個氨基酸的結構基因，由該基因推測的氨基酸序列見附圖3。根據上述分析可以判斷本發明獲得了苦蕎主要過敏性蛋白的結構基因片段。
步驟三，苦蕎麥主要過敏源基因5’端及全長cDNA的克隆根據步驟二得到的結構基因內部序列設計3′特異性引物λ25′-tcc ttc gtc tcc aacaac ctg-3′，并依據甜蕎BT1推測的核苷酸序列選用一段保守區設計引物λ35′-caa cgc tccagg cag agt gag-3，以苦蕎cDNA1為模板，先合成一段807bp左右的基因片段，其中包括5′端基因序列543bp及結構基因TBa部分序列264bp。以AAP5′-ggc cac gcg tcg actagt acg ggi igg gii ggg iig-3′和AUAP5′-ggc cac gcg tcg act agt ac-3′為引物，并根據上述擴增得到的5′端807bp基因序列設計引物w15′-ttc tgg tgc tgg tcc ccg-3′和w25′-ctcacg gga ttg gcg gtc-3′，利用5′-RACE和巢式PCR法克隆獲得5′端全長序列。經序列測定表明，克隆到的5′端部分基因片段519bp，包括807bp基因片段中的結構基因57bp，在5’端46bp處出現起始密碼子ATG，其后為66bp的信號肽序列。將步驟二、三獲得的四個基因片段(TBa結構基因585bp、3′端404bp及5′端807bp和519bp)進行疊加、拼接，獲得苦蕎麥過敏蛋白全長cDNA序列，經測序表明全長基因共計1548bp，可編碼一個515個氨基酸的蛋白質，包括22個氨基酸信號肽序列和493個氨基酸的成熟肽序列(見附圖1，附圖2)。
實施例2 苦蕎麥過敏蛋白C端多核苷酸片段在大腸桿菌中表達步驟一 表達載體pET28a-TBa的構建。
將實施例1步驟二中獲得重組質粒pGEM-T-TBa和pET-28a空載體分別用BamH I和Hind III雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收585bp目的DNA片段，和5.3kb載體DNA片段，經連接后，轉化大腸桿菌DH5α，篩選具有卡那霉素抗性的轉化子。提取質粒，經BamH I和Hind III雙酶切得到585bp和5.3kb兩個片段，分別與苦蕎過敏蛋白基因TBa和表達載體pET-28a大小相同，再經DNA序列分析，證明苦蕎過敏蛋白基因TBa已經克隆到表達載體pET-28a中，將此重組質粒命名為pET28a-Tba(見附圖4)。
步驟二 利用大腸桿菌工程菌株pET28a-Tba/BL21制備過敏蛋白TBa。
將pET28a-TBa按照標準法轉化大腸桿菌BL21，構建大腸桿菌工程菌株pET28a-Tba/BL21，單克隆接種在含0.25μg/ml卡那霉素抗性的液體LB培養基中，37℃200r/min振蕩培養過夜，然后以1％的接種量接種在含0.25μg/ml卡那霉素抗性的液體LB培養基上，37℃200r/min振蕩培養至O.D 600nm為0.6，加入IPTG使終濃度為0.1mmol/L，誘導表達3小時，收集菌體，超聲破碎，13000r/min離心分離上清和沉淀，經SDS-PAGE檢測后，和空菌比較在凝膠電泳圖譜上出現一條新的蛋白帶，與預計蛋白分子量大小相一致，目的蛋白可溶性表達量約占菌體總蛋白的30％。
步驟三 目的蛋白的親和純化所選用的表達載體pET28a上帶有編碼6個組氨酸的核苷酸序列，因此可用親和層析進行純化。將步驟二獲得的可溶性表達蛋白樣品通過Hitrap chelating親和柱，平衡后用0.5ml 0.1mol/L鎳鹽溶液洗脫，收集目的蛋白，SDS-PAGE檢測后在電泳圖譜上顯示單一條帶，表明獲得了純度較高的目的蛋白純品(見附圖5)，合并每次柱洗脫獲得的目的蛋白，經冷凍干燥即為苦蕎麥過敏蛋白TBa產品。
本發明是按上述方案從苦蕎麥天然資源中獲得苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因，并對其序列做相關分析。將C端多核苷酸基因片段(585bp)克隆至原核表達載體，經大腸桿菌中可溶性表達，親和純化獲得純度較高的22kD重組苦蕎麥過敏性貯藏蛋白片段，可以為深入研究蕎麥食品過敏機理，蕎麥過敏蛋白基因的分子改造和育種改良奠定基礎。
權利要求
1.一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因，其特征在于具有如下cDNA全長核苷酸序列1 ATGTCAACTA AACTCATCCT CTCCTTCTCC CTGTGCCTTA TGGTACTAAG51 CTGCTCTGCG CAGGCAGCGC AGCTATGGCC ATGGCGGAAG GGACAAGACA101 GCCGCCCCCA CCACGGCCAC CAGCAATTCC AGCAGCAATG TGATATCCAG151 AGGCTCACCG CCTCTGAGCC CTCTCGTAGA GTCCGTTCTG AGGCCGGAGT201 TACCGAGATT TGGGACTACA ACACCCCTGA GTTCCGATGC ACCGGATTTG251 TCGCCGTCCG TTACGTAATT CAGCCAGGAG GCCTCTTGCT TCCTTCCTAC301 TCCAACGCCC CTTACATCAC CTTTGTCGAG CAAGGGGAGG GAGTGCAGGG351 AGTGGTCATC CCAGGATGTC CCGAGACCTT CCAGTCGGAC TCCGAGTACC401 CTCAGTCTCA GAGAGGCCAA CGCTCCAGGC AGAGTGAGAG CGAAGAATCC451 AGCCGCGGGG ACCAGCACCA GAAGATTTTC AGAGTCAGAG AAGGTGACGT501 CATCCCATCT CCCGCCGGTG TCGTGCAGTG GACTCACAAC GACGGTGACC551 AAGATCTCAT CAGTGTCACT CTTCTCGATG CCAACAGCTT CCACAACCAG601 CTCGATGAGA ACGTTAGGAG CTTCTTCCTA GCTGGTCAGA GCCAGCAAGG651 CAGGGAGGAA CGCCGCAGCC AGCAACAGAC GAGGGAGGAA GGCGGTGACC701 GCCAATCCCG TGAGAGCGAT GACGTCGAAG CACTTATCGG CGCAAACATC751 TTGAGTGGAT TCCAGGACGA GATCCTCCAC GAACTCTTCC GAGATGTTGA801 CCGGGAGACC ATCAGCAAGC TCAGAGGCGA GAACGACCAG AGAGGATTCA851 TCGTCCAGGC TCAGGACCTC AAACTCCGGG TCCCAGAGGA TTCTGAAGAA901 GGATATGAGA GGCAAAGAGG TGACAGGAAA AGAGACGAAA GAGGAAGCGG951 AAGGAGCAAT GGATTGGAGC AAGCGTTCTG TAACCTAAAA TTCAGGCAAA1001 ATGTTAACAG GCCTTCTCAC GCCGACGTCT TCAACCCACG CGCCGGACGT1051 ATCAACACCG TCAACAGTAA CAATCTCCCA ATCCTCGAAT TCCTCCAACT1101 TAGCGCCCAA CACGTCGTCC TCTACAAGAA TGCGATCATC GGACCGAGAT1151 GGAACTTGAA CGCACACAGC GCACTGTACG TGACAAGAGG AGAAGGAAGA1201 GTCCAGGTTG TTGGAGACGA AGGAAAGAGT GTATTCGACG ACAACGTGCA1251 GCGAGGACAG ATCCTTGTGG TGCCACAGGG ATTCGCAGTG GTGGTGAAGG1301 CAGGAAGACA AGGATTGGAG TGGGTGGAGT TGAAGAACAA CGATAACGCC1351 ATAACCAGTC CGATTGCCGG TAGGACTTCG GTGTTGAGGG CGATCCCTGT1401 GGAGGTACTG GCCAACTCGT ATGATATCTC GACGGAGGAA GCATACAAAT1451 TGAAGAATGG GAGGCAGGAG GTTGAGGTCT TCCGACCATT CCAGTCCCGA1501 TATGAGAAGG AGGAGGAGAA GGAGAGGGAA CGTTTCTCCA TAGTTTAA
2.如權利要求1所述的苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因的制備方法，其特征在于包括如下步驟(a)、提取苦蕎麥總RNA并以其為模板，合成cDNA第一鏈；(b)、采用RT-PCR和3′RACE法擴增3′端585核苷酸及其3′端尾部序列；(c)、根據步驟(b)得到的部分基因設計特異性引物擴增5’端及全長基因序列。
3.一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白，其氨基酸序列如下1 MSTKLILSFS LCLMVLSCSA QAAQLWPWRK GQDSRPHHGH QQFQQQCDIQ51 RLTASEPSRR VRSEAGVTEI WDYNTPEFRC TGFVAVRYVI QPGGLLLPSY101 SNAPYITFVE QGEGVQGVVI PGCPETFQSD SEYPQSQRGQ RSRQSESEES151 SRGDQHQKIF RVREGDVIPS PAGVVQWTHN DGDQDLISVT LLDANSFHNQ201 LDENVRSFFL AGQSQQGREE RRSQQQTREE GGDRQSRESD DVEALIGANI251 LSGFQDEILH ELFRDVDRET ISKLRGENDQ RGFIVQAQDL KLRVPEDSEE301 GYERQRGDRK RDERGSGRSN GLEQAFCNLK FRQNVNRPSH ADVFNPRAGR351 INTVNSNNLP ILEFLQLSAQ HVVLYKNAII GPRWNLNAHS ALYVTRGEGR401 VQVVGDEGKS VFDDNVQRGQ ILVVPQGFAV VVKAGRQGLE WVELKNNDNA451 ITSPIAGRTS VLRAIPVEVL ANSYDISTEE AYKLKNGRQE VEVFRPFQSR501 YEKEEEKERE RFSIV
4.如權利要求3所述的苦蕎麥過敏性貯藏蛋白，其特征在于它含有C端的第321位至515位的多肽片段，其氨基酸序列為321 GLEQAFCNLK FRQNVNRPSH ADVFNPRAGR INTVNSNNLP ILEFLQLSAQ371 HVVLYKNAII GPRWNLNAHS ALYVTRGEGR VQVVGDEGKS VFDDNVQRGQ421 ILVVPQGFAV VVKAGRQGLE WVELKNNDNA ITSPIAGRTS VLRAIPVEVL471 ANSYDISTEE AYKLKNGRQE VEVFRPFQSR YEKEEEKERE RFSIV
5.一種載體，含有權利要求4所述的編碼多肽片段的核苷酸序列和原核載體。
6.權利要求5所述的載體為質粒，含有T7啟動子。
7.一種苦蕎麥過敏性貯藏蛋白工程菌，其特征在于它含有權利要求5或6所述的載體和一種菌。
8.權利要求4所述多肽片段的表達方法，其特征在于，包括如下步驟(a)、構建pET28a-TBa表達載體；(b)、將pET28a-TBa按照標準法轉入一種菌中，構建成工程菌株，接著接種在含卡那霉素的LB培養基中，誘導表達2-4小時；(c)、收集菌體，破碎細胞，層析純化，冷凍干燥后獲得產品。
9.權利要求8所述的方法，其中(b)步驟的條件為，37℃，200r/min振蕩，培養至O.D 600nm為0.6，加入IPTG使終濃度為0.1mmol/L，誘導表達2-4小時。
10.權利要求8所述的方法，其中菌為大腸桿菌BL21，構建大腸桿菌工程菌株pET28a-Tba/BL21。
11.權利要求1所述的苦蕎過敏蛋白基因可在制備低致敏DNA疫苗中的用途。
12.如權利要求3或4所述的過敏蛋白在制備診斷和治療特異性苦蕎過敏癥藥物中的用途。
全文摘要
本發明通過RT－PCR和RACE技術克隆和序列測定獲得苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因(TBc)，該基因全長1548核苷酸，開放閱讀框可編碼一個515個氨基酸組成的蛋白質，其中包含22個氨基酸的信號肽序列和493個氨基酸的成熟肽序列，分子量約58kDa。將該基因3′端的部分結構基因(TBa)構建表達載體，通過原核表達后，可獲得一個分子量約22kDa的功能蛋白，該功能蛋白包含195個氨基酸。由苦蕎麥過敏性貯藏蛋白基因編碼的完整蛋白質和功能蛋白均是苦蕎中的主要過敏源，可促發由IgE介導的I型過敏反應。本發明可用于制備診斷和治療特異性過敏癥藥物。
文檔編號A61P37/08GK1715410SQ200410092438
公開日2006年1月4日 申請日期2004年12月24日 優先權日2004年12月24日
發明者王轉花, 張政, 李玉英, 景巍 申請人:山西大學