專利名稱：新的抗真菌化合物、制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明是關于有抗真菌活性的新化合物，制備方法及用途。更確切地說，本發明公開了分子式(1)的化合物，含有它的藥用組合物，利用微生物發酵制備此化合物的方法，以及使用的新的微生物，和化合物及其藥用組合物在制備治療和/或預防抗真菌藥物中的用途。
背景技術1950年以后，與抗生素相關的研究快速發展并廣泛普及，開發出了對于各種感染性疾病的許多治療藥物。另一方面，近年來出現了由念珠菌，曲霉，隱球菌等真菌引發的深部真菌的增加和嚴重化的現象，這些現象和白血病，惡性淋巴腫，HIV感染引起的免疫不全，抗癌藥物引起的免疫能力低下以及抗生素大量使用引起的菌的變異現象關系密切。
現在，深部真菌的治療中，常使用多烯大環內酯類，唑類，氟胞嘧啶類藥物，例如多烯類大環內酯類藥物的一種兩性霉素B，其抗真菌活性強，有很好的治療效果。但因為其腎毒性等副作用，被指出存在安全性的問題(Gallis等，Rev.Infect.Dis.Vol 12，p309～329，1990)，氟胞嘧啶類藥物也存在安全性低和存在耐藥菌等方面的問題。
另一方面，唑類藥物被認為安全范圍廣泛，副作用低，但有抗菌譜窄的問題，因此對嚴重的病癥的有效性低，而且被認為耐藥性在增加。(Rex等，Antimicrob.Agents Chemother Vol 39，p1～8，1995)而且，近年來Micafungin和Caspofungin等環肽類藥物(Denning，Lancet Vol362，9330 p1142～1151，2003)被開發，用于深部真菌感染的治療。
因為有上述的現狀，應對病因的變化、安全性的確保、耐藥菌的增加，希望能開發新的抗真菌藥物。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種新化合物；本發明的另一目的是提供一種制備該抗真菌化合物的方法；本發明更進一步的目的是提供一種具有抗真菌活性的新的藥物組合物。
本發明的發明人，從微生物代謝產物的篩選新抗真菌藥物的過程中，發現屬于牽連青霉(Penicillum implicatum)的真菌培養物中存在抗真菌活性的化合物，接著為了確定培養物中活性物質，將培養物分離純化并對化合物進行結構解析，發現了分子式(1)新化合物具有抗真菌活性，并在此基礎上完成了本發明。
本發明提供了具有抗真菌活性的分子式(1)的新化合物，而且本發明提供了對屬于青霉屬的菌種的培養，從它的代謝產物中得到式(1)表示的化合物的提取過程，提供了式(1)表示化合物的制備方法。
本發明提供了1.如分子式(1)表示的化合物及其可藥用的鹽；
2.制備上述化合物的方法，包括培養一種能夠產式(1)化合物的青霉菌屬微生物，和從培養物中提取純化該化合物的方法；3.產生化合物(1)的青霉菌屬微生物，牽連青霉(Penicillium implicatum)NCC00646 CGMCC 1079。
4.一種藥物組合物，含有式(1)化合物作為活性成分及藥用載體。
5.上述藥物組合物，可用于治療和/或預防真菌感染。
本發明分子式(1)表示的化合物，具有很好的抗真菌活性作為真菌感染疾病的治療和/或預防藥物，十分具有應用前景。
本發明的上述分子式(1)表示的新化合物(以下略稱為化合物(1))有下記的物理化學性狀。
(1)顏色和外觀無色粉末
(2)分子式C49H79N7O16(3)質譜(HRFAB-MS)測量值m/z 1022.5658[M+H]+理論值m/z 1022.5662[C49H80N7O16]+(4)相對旋光度[α]D＝-36.2°(c0.8，MeOH，25℃)(5)紫外吸收波譜λmax，nm(E1％1cm)223(sh，108)，276(15)，283(sh，13)/MeOH245(92)，291(16)/0.01N KOH+MeOH(6)紅外吸收波譜(KBr)vmax，cm-13360，2928，2855，1628，1520，1456，1232(7)1H核磁共振波譜(CDCl3，400MHz)δ(ppm)0.85(3H，d)，0.87(3H，t)，1.04(3H，d)，1.20(6H，d)，1.25～1.35(19H，m)，1.58(2H，m)，1.90(1H，m)，2.05(1H，m)，2.08(1H，m)，2.21(2H，t)，2.41(1H，m)，2.51(1H，m)，3.37(1H，dd)，3.78(1H，dd)，3.85(1H，dd)，3.91(1H，m)，3.96(1H，dd)，4.14(1H，m)，4.17(1H，dd)，4.21(1H，dd)，4.29(1H，d)，4.30(1H，d)，4.32(1H，d)，4.38(1H，dd)，4.50(1H，dd)，4.54(1H，m)，4.57(1H，dd)，4.83(1H，d)，4.94(1H，d)，5.22(1H，d)，6.74(2H，dd)，7.13(2H，dd)(8)13C核磁共振波譜(CDCl3，100MHz)δ(ppm)11.2，11.7，19.6(×2)，20.0，27.0，28.2，30.3，30.5，30.5，30.5，30.6，30.7，30.8，35.0，35.7，36.8，37.7，38.5，39.0，51.6，52.9，56.3，56.8，57.1，58.5，62.4，68.3，69.5，69.7，70.8，71.2，74.5，75.5，75.7，76.9，116.1(×2)，129.5(×2)，133.0，158.4，169.9，172.5(×2)，172.7，173.5，174.3，176.2(9)溶解性溶于甲醇，氯仿，乙酸乙酯和二甲基亞砜；不溶于正己烷和水。
和化合物(1)類似的化合物有棘白霉素B(echinocandin B)(sandoz等，Tetrahedron letters Vol 46，p4147～4150，1976)和Mulundocandin(Roy等，J.Antibiotics Vol 40，P275-289，1987)。但本發明的化合物(1)和已知化合物物理化學性狀不同，能夠明顯區別。
化合物(1)的可藥用鹽，可以舉例為鈉，鉀，鋰等堿金屬或鈣等堿土金屬鹽。
上述化合物(1)能夠使用產生該化合物的青霉屬真菌培養，從培養物中提取該化合物。作為產生化合物(1)的青霉屬真菌，只要能產生化合物(1)并不受限制。例如牽連青霉(Penicillium implicatum)真菌NCC00646.
化合物(1)的產生菌NCC00646從中國云南西雙版納(xi shuang ban na)的土壤中分離得到。
NCC00646的菌株在Czapek’s瓊脂培養基，potato dextrose瓊脂培養基中，26℃。菌落為青綠色到深綠色，絨狀，形成菌絲索，菌絲層致密。沒有可溶色素形成，背面為褐色。
分生孢子有基質形成，直徑2～2.5μm，長100μm。該青霉為單輪生或兩個梗基形成的復輪生，小梗8～12個密集，9～12×2～2.5μm，分生孢子球形或近球形，2.5～3μm，略粗糙。
從以上的菌學特征可以認為NCC00646屬于真菌的牽連青霉(Penicilliumimplicatum)。
菌株NCC00646于2003年12月18日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)中，保藏號CGMCC No.1079。
本發明中化合物(1)的產生菌可以使用NCC00646由來的突變體(既可以自然發生也可為誘變)，質體融合或基因重組的突變株。NCC00646菌株和突變株，可以由自然界生存的突變株，也可以為人工變異的突變株。
培養化合物(1)的產生菌，可以利用含有通常的微生物的營養源的培養基。
營養源，可以利用公知的真菌培養基。例如，用作碳源可以是葡萄糖、蔗糖、糖蜜、糊精、淀粉、甘油，動物油和植物油。用作氮源常常是大豆粉、麥芽汁、棉子，玉米漿、蛋白胨、牛肉膏、干酪素、酵母膏，尿素，以及硫酸銨和硝酸銨等銨鹽。加入一些無機鹽也很有效，如鈉、鉀、鈣、錳、鈷、銅鹽，以及氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽。另外，加入一些有利于真菌生長的有機物和無機物也有利于真菌的生長。
可以在需氧條件下，采用靜止培養法或者振蕩培養法培養化合物(1)的產生菌，靜置培養，振蕩培養或罐培養均可，其中采用靜置培養更有利。培養溫度和時間在化合物(1)產生菌生長的狀況下不受限制，可以根據培養基不同設定。適宜的培養溫度為20℃～30℃，26℃附近最佳。培養周期一般在2～21天內的產量達到最大。培養結束后，化合物(1)達到最高量時停止培養，提取化合物(1)。
從發酵液中提取的化合物(1)，根據其性狀，可以利用通常的分離手段。分離手段可以舉例為溶媒提取，吸附洗脫，各種樹脂層析及沉淀法等。這些手段的組合使用效果更好。
具體說，從NCC00646培養物中提取目標產物，可以先用67％的丙酮水溶液從菌株目的物的發酵液中抽提，蒸發除去粗提液中的丙酮，然后用乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯的抽提物用硅膠柱層析和凝膠過濾層析提純，最后用TLC或者HPLC純化得到化合物(1)。
化合物(1)和其可藥用鹽，具有抗真菌活性，其中任何一種含有有效成分的藥物組合物，對包含人在內的動物給藥后，效果明顯。具體來講，對真菌感染癥的治療和/或預防有效，可以作為抗真菌藥物。
作為經口服給藥的制劑，可以做成片劑、丸劑、膠囊劑、散劑，口服劑，顆粒劑、粉劑、懸濁劑，糖漿，舌下劑等。作為非經口給藥的制劑，可以做成針劑、皮膚吸收劑、吸入劑、栓劑等。本發明的藥物組合物的配方中可以加入一些可以接受的藥物添加劑，如表面活性劑、賦形劑、穩定劑、潤濕劑、崩解劑、增溶劑、等滲劑、緩沖劑、著色劑、芳香劑等。
藥用載體可以使用制藥行業中允許使用的載體，它的種類和組成可根據給藥途徑和方法而定。例如，液體載體可以為水，醇，大豆油，芝麻油等，固體載體可以為麥芽糖，蔗糖等糖類，賴氨酸等氨基酸，羥丙基纖維素等纖維素衍生物，環糊精等多糖，硬脂酸鎂等有機酸鹽。以注射劑形式的制劑，液體載體一般為生理鹽水，各種緩沖液，葡萄糖等糖類溶液等。
本發明中化合物(1)和它的鹽作為藥物組合物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和具體情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講，對成人的口服劑量是1～1,000mg/kg/天，靜脈注射的劑量是0.1～100mg/kg/天。
附圖1化合物NCC00646的紫外圖譜附圖2化合物NCC00646的紅外圖譜附圖3化合物NCC00646的核磁圖譜(1H譜)附圖4化合物NCC00646的核磁圖譜(13C譜)具體實施方式
以下為本發明的實施例，并不是對本發明的限定，也包括這里沒有顯示的改變的方法和修飾手段。
實施例1化合物NCC00646的制備(1)菌株NCC00646的培養將牽連青霉菌(Penicillium implicatum)的單孢子在新鮮的麥芽膏瓊脂(MEA)斜面培養24℃，5天。培養好的斜面制成含0.01％吐溫80的10毫升的孢子懸液。0.5毫升孢子懸液在含有麥芽膏瓊脂(MEA)的平皿中涂勻，培養5天后，用無菌環刮取平皿上的孢子，懸浮于無菌蒸餾水中，接種到含有15公斤麥麩的生物反應器中培養7天。培養容器(不銹鋼制)200×80×17cm(2)化合物NCC00646的提取純化上述培養物的一部分(2kg)，先用2L 67％的丙酮水溶液抽提，獲得粗提液。過濾并蒸出丙酮，然后用1.5L乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯抽提物蒸發后得到6.8g粗提物。粗提物用100ml甲醇溶解，加入20g硅膠(WAKOGEL C-300，Wako Pure Chemical Industries)減壓干燥，將吸附有粗提物的硅膠加到裝有30g硅膠的層析柱上，然后用氯仿∶甲醇＝99∶1(100ml)，氯仿∶甲醇＝97∶3(500ml)，氯仿∶甲醇＝90∶10(300ml)等的溶劑順序洗脫。在甲醇∶氯仿＝50∶50(500ml)部分，活性成分被洗脫出，減壓干燥后得到426mg的干燥固體。
干燥固體用甲醇溶解后，進行Sephadex LH-20凝膠過濾柱層析(Pharmacia，5cm i.d.×90cm)，并用甲醇洗脫。洗脫量為600～650ml部分的組份干燥后得到79mg固體。接著，這些固體用甲醇溶解，使用HPLC色譜柱(Cosmosil AR-II內徑2cm×25cm Nacalai Tesque)進行制備，流動相為乙腈∶蒸餾水＝40∶30。流動相的流速為10ml/min，13.5分鐘洗脫出的成分，減壓濃縮，得到化合物(1)6.2mg。
實施例2化合物NCC00646的抗真菌活性測定實施例2中得到的化合物(1)的抗真菌活性，采用液體濃度稀釋法測定對真菌菌株的最小抑菌濃度。真菌用YNBP培養基培養(含有緩沖劑的酵母氮基礎，含0.5％的葡萄糖，采用DIFCO方法產生)，28℃培養48小時。結果如表1。
表1.化合物(1)的抗真菌活性
表1顯示，本發明的化合物(1)有很好的抗真菌活性。
權利要求
1.如分子式(1)表示的化合物及其可藥用的鹽
2.一種制備權利要求1化合物的方法，包括培養一種能夠產式(1)化合物的青霉菌屬微生物，和從培養物中提取純化該化合物的方法。
3.權利要求2的方法，其中青霉菌屬微生物為牽連青霉(Penicillium implicatum)NCC00646 CGMCC 1079。
4.一種藥物組合物，含有權利要求1中的化合物作為活性成分及藥用載體。
5.權利要求4所述的藥物組合物，可用于治療和/或預防真菌感染。
全文摘要
本發明公開了具有分子式(1)的化合物NCC00646及它的可藥用鹽，具有抗真菌活性。本發明還公開了一種制備化合物NCC00646的方法。本發明還公開了含有化合物(1)的組合物在制備治療和/或預防真菌感染藥物中的應用。
文檔編號A61P31/10GK1796386SQ20041009244
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年12月27日
發明者張華 , 董悅生, 谷匡人, 飯田真依子 申請人:華北制藥集團有限責任公司, 明治制果株式會社