使用蘇拉明、戊聚糖多聚硫酸酯、端粒酶反義體及端粒酶抑制劑的方法和組合物的制作方法

專利名稱：：使用蘇拉明、戊聚糖多聚硫酸酯、端粒酶反義體及端粒酶抑制劑的方法和組合物的制作方法與相關申請的相互參照本申請要求獲得臨時申請序列號60/444,061的優先權，該申請于2003年1月31日提交，標題為“蘇拉明、戊聚糖多聚硫酸酯以及人端粒酶反義體對端粒酶活性的抑制作用(inhibitionoftelomeraseactivitybysuramin，pentosanpolysulfateorantisensetohumantelomerase”。與本申請交叉參考的還有2003年6月18日提交的美國專利申請10/646,018，標題為“通過端粒破壞來調控藥物活性的方法和組合物(Methodsandcompositionsformodulatingdrugactivitythroughtelomeredamage”；以及2000年6月5日提交的美國專利申請09/587,559，標題為“調節細胞增殖和細胞死亡的方法和組合物(Methodsandcompositionsformodulationcellproliferationandcelldeath)”，其全文內容合并于本文中作為參照。政府資助的研究本申請中所述的工作部分地由美國衛生和人類服務部(theUnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices)資助(許可號為R01CA77091，R01CA97067，R37CA49816；R01CA78577；R01CA74179；R21CA91547；及U01CA76576)。發明
背景技術：
：領域本發明描述了一種靶向人端粒酶并抑制人類癌癥細胞中的端粒酶活性的反義分子(hTR-反義體(anti-sense))。本發明還描述了蘇拉明、戊聚糖多聚硫酸酯(PPS)或hTR-反義體抑制端粒酶活性的用途。本發明進一步地教導了另一種端粒酶抑制劑3’疊氮脫氧胸苷(3′-azido-deoxythymidine)(AZT)(其在非毒性劑量時產生納摩爾水平的血藥濃度)在治療腫瘤中的用途。本發明還教導了在用其他手術方法或非手術腫瘤體積減小(tumorsizereduction)(細胞減滅(cytoreduction))的同時或之后，用端粒酶抑制劑治療腫瘤的方法。本發明還教導了在非手術腫瘤體積減小治療之前，應用端粒酶抑制劑，可以提高腫瘤細胞對這種治療效應的敏感性。本發明還教導了如何使用端粒酶抑制劑，如蘇拉明、PPS或hTR反義體來預防腫瘤的發展。現有技術的說明端粒和端粒酶.端粒是染色體末端的帽狀結構，對于維持染色體的完整性和復制能力十分重要。由于DNA聚合酶不能復制染色體的3’末端，每次細胞分裂會使端粒縮短50到200bp。端粒損失達到低于某一臨界的最小長度就會引起細胞死亡(Lingner，etal.，Science，2691533-1534，1995)，或導致細胞開始衰老(senescence)(如喪失增殖能力)(Goldstein，Science，2491129-1133，1990；Martin，etal.，Lab.Invest.，2386-92，1979)。端粒酶這種酶包含RNA和蛋白成分，它可以恢復端粒的長度，在腫瘤細胞中幾乎普遍地存在，而在正常體細胞中一般不存在。(Hiyama，etal.，JNatlCancerInst，88116-122，1996).使用端粒酶抑制劑的方法.端粒酶的功能的重要性，以及其選擇性地存在于腫瘤細胞中引出了最初的假設，即端粒酶是理想的腫瘤特異性靶，端粒酶抑制劑是一種有治療效用的抗腫瘤藥物。(如inHuminiecki，L.，ActaBiochimicaPolonica，43531-538，1996).提出這一用法是基于如下假設活化的端粒酶是腫瘤的啟動和維持所必須的。尚無報道證實端粒酶抑制劑的臨床有效性。事實上，此后有幾項重要的發現被描述，它們均提示端粒酶抑制劑的治療價值有限。首先，目前已經公認端粒酶還有不依賴于端粒酶的其他端粒延長機制(如，Gan，etal.，FEBSLett.，52710-14，2002)。其次，即使端粒酶已經被完全抑制，腫瘤細胞中預存在的端粒也常具有足夠的長度，足以維持多個周期的細胞增殖。因此，端粒酶抑制劑要經過一段相當長的滯后時間后，才能產生細胞毒性。例如，端粒酶抑制劑在HeLa細胞中在經過23到26次細胞倍增后才產生細胞毒性。(Feng，etal.，Science，2691236-1241，1995)。因為腫瘤無控制地生長將引起致命的腫瘤負荷，如，一名患者通常會在腫瘤體積倍增不到10次后發生腫瘤介導的死亡，所以，端粒酶抑制劑這種需要一較長的滯后期才能對端粒酶產生抑制從而引起細胞死亡或衰老的特性使其不能實用，不是一種有用的治療藥物。雖然在近10年前就首次提出了用端粒酶抑制劑治療腫瘤的假設，但直到今天，沒有任何一種明確鑒定為是端粒酶抑制劑的藥物作為抗腫瘤藥物在人類患者中檢測。(美國專利申請第5,489,508號).在美國專利第10/464,018號中請中，申請者描述了如下發現用紫杉醇(紫杉醇)治療癌癥，可造成端粒損傷從而減低端粒酶活性，引起該腫瘤對紫杉醇的治療產生耐受性；而同時給予一種端粒酶抑制劑(如AZT，hTR反義體)可以減少這種耐受性，增強紫杉醇的抗腫瘤作用。本申請擴展了申請人此前發明的申請，教導了使得端粒酶抑制成為一種有效的抗腫瘤治療的方法。一方面，本發明教導了在給予端粒酶抑制劑之前或同時使用細胞減滅療法，來降低腫瘤負荷，這樣在端粒酶抑制劑能夠侵蝕端粒的長度使其降低至低于產生凋亡和細胞衰老的臨界水平之前，腫瘤負荷不會達到致死的水平，從而使得端粒酶抑制成為一種有效的療法。因此，本發明教導了使用端粒酶抑制劑來抗擊腫瘤的方法，包括給予患者細胞減滅療法，(即減小腫瘤體積的治療，如，外科手術、放射治療、化學治療等)，然后給予一種端粒酶抑制劑，其中該端粒酶抑制劑的血漿濃度應維持在端粒酶抑制的水平，持續一段較長時間，例如，數周或數個月。該端粒酶抑制劑也可以在細胞減滅治療的同時給予。這里所教導的內容基于申請中的如下發現在細胞減滅治療(如化學治療)過程中和/或結束后，使血漿中蘇拉明維持在端粒酶抑制而非毒性的濃度水平，可以促進腫瘤縮小，延緩腫瘤進展，延長人類癌癥患者的生存時間。本發明的另一方面教導了端粒酶抑制劑用于細胞毒治療終止后的用途，例如，因細胞毒治療的劑量限制性(dose-limiting)毒性而終止。細胞毒治療，比如化學治療，常對腫瘤患者產生毒性，因此不能無限期地使用(即作為維持療法在維持期這段時間中使用)。以臨床的觀點來看，這是一個重要的問題，因為大多數化學治療的腫瘤都要進展，而通常不能根除。例如，在腫瘤經化學治療可以根除的情況下，不到1％的非小細胞肺癌患者可以達到完全應答(Schiller，etal.，NewEngJMed，34692-98，2002)。因此，殘留的腫瘤細胞在細胞毒治療停止后可以再繼續生長。相反，因為端粒酶選擇性在腫瘤細胞中表達，端粒酶抑制劑不容易產生毒性，因此可以無限期或長時間應用。這樣，端粒酶抑制劑抑制細胞增殖或誘導細胞衰老的能力就可以阻止腫瘤的再生長，表現出生存優勢。例如，在非小細胞肺癌的人類患者中一種常用而有效的化學治療是紫杉醇(225mg/m2)與卡鉑(AUC＝6)聯合，每三周給藥一次。紫杉醇的神經毒性可以累積，通常在4到6次治療后達到劑量限制，迫使治療終止。通常的情況下腫瘤在數個月內開始繼續生長，因此平均生存期約為8個月(Schiller，etal.，2002)。關于這一領域內的現有技術，WO9738013A中教導了端粒酶的肽核酸反義體分子(peptidenucleicacidantisensemolecules)(PNA)與抗腫瘤藥物的聯合使用。Kondo描述了抑制端粒酶可以提高腫瘤對損傷DNA的藥物的易感性(Kondo，etal.，Oncogene，163323-3330，1998)。因此，早期的這些出版物教導了這一普遍被承認的概念對癌癥采用兩種有效治療方式的聯合治療較分別使用這兩種治療方式更有效。但是，這些出版物沒有揭示要使用細胞減滅治療來達到減小腫瘤體積的目的足以使端粒酶抑制劑的治療有效。這些出版物也沒有揭示可以在細胞毒治療終止后使用端粒酶抑制劑來作為一種抗擊癌癥的方式。因此，本申請所發現的理論是新的，即細胞減滅治療對于使端粒酶抑制成為一種有效的抗腫瘤療法是十分必要的，因為此前沒有這種用法，也沒有報道過此類結果。申請者發現，在細胞減滅治療的同時合用低劑量的蘇拉明，使血漿中蘇拉明濃度維持在足以抑制端粒酶，但不足以產生抗腫瘤活性的水平，在人類患者中仍能有效抗癌，這一發現也是令人驚訝的，因為現有技術表明，這樣低劑量的蘇拉明在人類沒有抗腫瘤活性。(Dreicer，etal.，Invest.NewDrugs，17183-189，1999；Falcone，etal.，Tumori，84666-668，1998；Falcone，etal.，Cancer，86470-476，1999；Hussain，etal.，JofClin.Oncol.，181043-1049，2000；Miglietta，etal.，JCancerRes.Clin.Oncol.，123407-410，1997；Mirza，eta/.，ActaOncologica，36171-174，1997；Motzer，etal.，Cancer，723313-3317，1993；Rapoport，etal.，Ann.Oncol.，4567-573，1993；Rosen，etal.，J.Clin.Oncol.，141626-1636，1996)。本發明也教導了用一種端粒酶抑制劑做預處理(pretreatment)，加強化療的抗腫瘤效果。這是基于本申請的發現，即用低劑量例如達到50微摩爾的血漿濃度的蘇拉明做預處理，這樣的濃度足以抑制端粒酶，但不足以產生細胞毒性，可以增加化療活性。將低劑量的蘇拉明在腫瘤確立(tumorestablishment)之前或之后使用，或在腫瘤負荷尚未危及生命時使用，都觀察到了蘇拉明的化療增敏作用。這一發現是新穎，因為此前沒有報道過這種用法和這種結果。事實上，這一發現是驚人的，因為現有技術表明，這樣低劑量的蘇拉明在非人類的動物中，無論在腫瘤確立之前還是腫瘤確立之后都沒有抗腫瘤活性(如，Pesenti，etal.，Br.J.Cancer，66367-372，1992)。端粒酶抑制劑.本申請教導了蘇拉明，PPS，或hTR反義體在抑制端粒酶中的用法。這是基于本申請的發現，即蘇拉明，PPS，或hTR反義體是有效的端粒酶抑制劑，可以使植于動物的腫瘤中端粒的長度縮短。現有技術教導了具有端粒酶抑制特性的數種化合物。(如，美國專利號Nos.5,656,638,5,760,062,5,767,278,5,770,613，以及5,863,936各文件中所述)。現有技術也教導了順鉑可以抑制端粒酶抑制作用，可能是由于端粒重復序列的交聯(Burger，etal.，EurJCancer，33638-644，1997)。現有技術進一步教導了使用肽核酸(PNA)反義分子和硫代磷酸(phosphorothioate)寡核苷酸，通過靶向端粒酶的RNA成分，抑制端粒酶活性的用途(Norton，etal.，NatBiotechnol，14615-619，1996).。但是，這些報道都沒有教導蘇拉明，PPS，或hTR反義體作為端粒酶抑制劑的用途。端粒酶抑制劑用作(癌癥)化學預防.建議用端粒酶抑制劑做化學預防。例如，Akama提示了給予噻唑(thiazolidinone)類化合物類端粒酶抑制劑作為預防用藥的可能性(Akama，etal.，U.S.PatentNo.6,452，014,2002)。但是Akama沒有教導使用蘇拉明，PPS，或hTR義體來抑制端粒酶的用法。使用蘇拉明的方法蘇拉明，一種多磺酸化的萘基脲(polysulfonatednaphthylurea)，具有多種藥理學活性(Ahmann，etal.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，10178，1991；Armand，Bonnay，Gandia，Cvitkovic，DeBraud，Bertheault，Droz，Carde，Schlumberger，andFourcault，1991；Dreicer，etal.，1999；Falcone，etal.，1998；Falcone，etal.，1999；Garrett，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817466-7470，1984；Grazioli，etal.，IntJImmunopharmacol，14637-642，1992；Hawking，Adv.Pharmacol.Chemother.，5289-322，1978；Hensey，etal.，FASEB，258156-158，1989；Hosang，J.Cell.Biochem.，29265-273，1985；Hussain，eta/.，2000；Manetti，etal.，Bioorganic&Med.Chem.，6947-958，1998；Mills，etal.，CancerRes.，503036-3042，1990；Myers，etal.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，9113，1990；Ono，eta/.，Eur.J.Biochem.，172349-353，1998；Pollak，etal.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，954，1990；Pollak，etal.，J.Natl.CancerInst.，821349-1352，1990；Stein，CancerRes.，542239-2248，1993；Takano，etal.，CancerRes.，542654-2660，1994；Wade，eta/.，J.Surg.Res.，53195-198，1992；Waltenberger，etal.，J.Mol.CellCardiol.，281523-1529，1996).其抗腫瘤活性據信是由于抑制了DNA聚合酶α和逆轉錄酶，抑制生長因子(即，血小板衍生的生長因子，纖維母細胞生長因子或FGF，轉換生長因子β，表皮生長因子，血管內皮生長因子及胰島素樣生長因子-1)的結合以及IL-2和轉鐵蛋白與各自的受體結合，抑制PKC的磷酸化活性和氨基葡聚糖代謝。蘇拉明還可以抑制Na/K-ATP酶，腫瘤壞死因子以及拓撲異構酶II。任何濃度的蘇拉明對端粒酶的抑制活性都是未知的，是本申請的新發現。蘇拉明已經在前列腺癌中表現出一定活性(DeClercq，CancerLetters，89-22，1979；Eisenberger，etal.，CancerTreatRev.，20259-273，1994；Fotes，etal.，BiochimBiophysActa.，38262-272，1973；Huang，etal.，Oncogene，9491-499，1994)，在多種實體瘤中進行過試驗，既作為單獨的藥劑使用也可與其他化學治療聯用。蘇拉明治療性血漿濃度在100到200μM(140-280μg/ml)(Funayama，etal.，AnticancerRes.，131981-1988，1993)，而指示的最寬范圍為70到210μM(100-300μg/ml)(Klohs，等，US5,597,830,1997)。在這些濃度時，蘇拉明在患者中表現出顯著的毒性，而活性僅達中度。多個研究組表示蘇拉明單藥治療在人類患者中沒有可評估的抗腫瘤效果，而對人類患者，高劑量的蘇拉明和細胞毒性藥物的聯合使用與單藥相比較也沒有產生有益的結果。基于這些發現，這些研究者推薦不使用蘇拉明，無論其是單藥使用還是與其他細胞毒性藥物聯合使用(Dreicer，eta/.，1999；Falcone，eta/.，1998；Falcone，eta/.，1999；Hussain，eta/.，2000；Miglietta，etal.，1997；Mirza，etal.，1997；Motzer，etal.，1993；Rapoport，etal.，1993；Rosen，etal.，1996)。因此，沒有本發明所根據的發現，就沒有使用蘇拉明的動機，不論是單藥還是任何劑量的蘇拉明與其他細胞毒性藥物聯用，或是將亞治療(subtherapeutic)劑量而且是非毒性劑量的蘇拉明與細胞毒性藥物聯用。唯一的例外就是使用亞治療劑量的蘇拉明，以便增強其他形式治療的作用。這一用法由申請者發現，在美國專利6,599,912號文件中有詳細描述，該用法需要在對患者進行其他形式的治療之前、治療過程中或之后短期內給予蘇拉明，如化療或放療。本發明支持蘇拉明的例外用法或不同用法，并強調指出需要一個較長的總治療期，例如數周或數個月，數年，或一段不確定的時間，以便抑制端粒酶，使得端粒縮短到足夠的程度，抑制細胞增殖或導致細胞死亡。本發明教導了持續抑制端粒酶的需要。因此，需要一種從體內清除較慢的化合物(compound)。蘇拉明符合這一需求。蘇拉明在人類患者中的藥代動力學以三級血漿濃度降低(triphasicplasmaconcentrationdecline)為特征，半衰期為5.5小時，4.1天和78天。總人體清除率(totalbodyclearance)為0.0095升/小時/m2(Jodrell，etal.，JClin.Oncol.，12166-175，1994)。蘇拉明在狗體內的分布也很慢，最終半衰期(terminalhalf-life)約為13天(見例8)使用PPS的方法.PPS是一種半合成的類肝素(heparinoid)，具有抗凝作用(Wellstein，etal.，BreastCancerRes.Treat.，38109-119，1996)。雞絨膜尿囊膜化驗(chickenchorioannantoicmembraneassay)中，在患者血漿中沒有抗凝作用、且低于其毒性作用的1000倍的濃度條件下，PPS抑制FGF與其受體結合，并抑制血管生成(Parker，etal.，J.Natl.CancerInst.，851068-1073，1993；Wellstein，etal.，1996)。僅在濃度超過1μg/ml(Parker，etal.，1993)時才發現抗凝作用。在體內條件下，如果治療在腫瘤還不可觸及時就開始，PPS可以抑制大鼠MAT-LyLu腫瘤的生長速度，但對于已經形成的腫瘤幾乎沒有作用，也不能抑制小鼠MCF7腫瘤的轉移(McLeskey，etal.，Br.J.Cancer，731053-1062，1996；Nguyen，etal.，AnticancerRes.，132143-2148，1993；Wellstein，etal.，J.Natl.CancerInst.，83716-720，1991)。PPS在臨床前腫瘤模型中的抗腫瘤活性使其得到臨床評估。結果顯示，當PPS劑量調整到避免其抗凝作用時，耐受性良好，但在患者中沒有顯示抗腫瘤活性(Lush，etal.，AnnOncol.，7939-944，1996；Swain，etal.，Invest.NewDrugs，1355-62，1995)。結果，不再將PPS作為潛在有效的抗腫瘤或抗血管生成藥物進行評估。在PDQ臨床試驗數據庫(http//www.nci.nih.gov)中檢索2000年1月27日所有進行中的癌癥臨床試驗，顯示全球有1,790項試驗，但沒有關于PPS的試驗。因此，沒有本發現，就沒有使用PPS治療癌癥的動機。用于抗腫瘤活性評估的PPS劑量約為每平方米每天400mg(相當于每天10mg/kg)，口服給藥。每天連續給藥，血漿濃度隨時間增高，在治療的第15天達到200-460ng/ml。在這一劑量水平，通常在第1-3個月時出現血液學毒性，如腹瀉，胃腸道出血或直腸炎(proctitis)。在本試驗中直腸炎是劑量限制性毒性(Marshalletal.，Clin.CancerRes.，32347-2354，1997)。要將端粒酶活性抑制50％所需PPS的濃度(0.5-0.6μg/ml，見實施例3)遠遠高于引起直腸炎毒性的濃度。該考慮以及以下發現對靶器官局部給予蘇拉明可以在靶組織中達到端粒酶抑制濃度(如5到100μg/g)，而血漿中蘇拉明的濃度相當低(如0.1μg/ml，見實施例13)，導致將PPS局部用于需要抑制端粒酶的器官這一發明。這種新用法減輕了系統性宿主毒性的潛在問題。使用AZT的方法.Melana等人最近總結了AZT的歷史情況(Melana，etal.，1998)。AZT用于治療人類免疫缺陷病毒所感染的患者。AZT最初是作為抗腫瘤藥物開發的。但是，它已不再被視為潛在的抗腫瘤藥物，因為在飲水中給藥時，其在動物中的細胞毒性相對較高。后來發現AZT在彈丸注射的方式給藥時，毒性很低。已經對AZT進行I期和II期臨床試驗，既有單藥使用也有與其他藥物聯合使用，用于胃腸道癌癥的治療。根據可獲得的數據計算，這些早期的研究使用的AZT劑量(如7到10g/m2/天)產生的血漿濃度超過10微摩爾，列舉如下。通常的口服劑量即每4小時2.5mg/kg或15mg/kg/天之后，患者血漿中AZT的平均穩態濃度為1.06μg/ml(Physician′sDeskReference，2003)。用AZT進行細胞毒性治療，使用的最小劑量為3g/m2/天(美國專利第5,116,823)，換算后約為85mg/kg/天。將15mg/kg/天時的1.06μg/ml的穩態濃度進行線性外推，得到6μg/ml的預期血漿濃度，對于85mg/kg/天的情況為22μM。現有技術教導，AZT是一種端粒酶抑制劑，產生50％抑制的濃度范圍波動于微摩爾到毫摩爾數量級(Strahl，etal.，NucleicAcidRes，22893-900，1994；Strahl，etal.，Mol.CellBiol.，1653-65，1996)。本發明教導了低劑量AZT的使用。申請者發現給予產生毫微摩爾血漿濃度的非毒性劑量的AZT，導致動物中已經充分確定的腫瘤縮小。在動物中加用這種非毒性劑量的AZT也可以加強紫杉醇的抗腫瘤活性。盡管AZT被認為是抗腫瘤藥物及端粒酶抑制劑，現有技術尚未描述如此低劑量AZT的用法及效力。事實上，本申請的發現，即產生納摩爾濃度的低劑量AZT的抗腫瘤活性是令人驚訝的，由于現有技術顯示，AZT產生抗腫瘤活性是在更高的劑量，所述劑量產生的血漿濃度在微摩爾水平(Clark，etal.，JCancerRes.Clin.Oncol.，122554-558，1996)。納摩爾的AZT增強化療活性這一發現也是令人驚訝的，因為現有技術顯示AZT的細胞毒或端粒酶抑制濃度是在微摩爾或毫摩爾的范圍內(Strahl，etal.，1994；Strahl，etal.，1996；(Melana，etal.，Clin.CancerRes.，4693-696，1998；例1中的表1).端粒酶反義體反義體構建體對端粒酶活性的抑制作用已有報道，它們應用于腫瘤治療的可能性也被提出過(Kelland，LancetOncol，295-102，2001)。但是，這里報道的hTR反義體尚未被描述過。而且，通過利用用端粒反義體構建體聯合長期端粒酶抑制治療以及細胞減滅治療聯用的方法沒有被提出或描述過。
發明內容本申請基于數個關于端粒酶抑制和端粒縮短的相關發現。首先，申請者發現蘇拉明，PPS和hTR反義體是有效的端粒酶抑制劑，可以縮短植于動物的腫瘤的端粒長度。第二點發現是，對負荷腫瘤的動物中已經充分成型的腫瘤，用蘇拉明進行預處理可以使化療活性增強。第三點發現是，端粒酶抑制劑，諸如蘇拉明和PPS等，可以增強癌癥的化療和放療的抗腫瘤活性。第四點發現是，在細胞減滅治療期間及其結束后使血漿蘇拉明維持在端粒酶抑制性濃度會促進腫瘤縮小，延緩腫瘤生長和延長人類腫瘤患者的生存時間。第五點發現是，將蘇拉明局部用于治療所意圖的靶組織，使得局部組織濃度達到足以使該組織內端粒酶被抑制、端粒被縮短的程度，而同時在血漿內蘇拉明的濃度極低，不足以抑制端粒酶。第六點發現是，使用產生極低量的血漿濃度的非毒性劑量的AZT，導致動物充分確定的腫瘤消除，并使紫杉醇在動物中的抗腫瘤活性增強。因此，申請者提供了可以應用于多種腫瘤治療中，并且使治療結果較標準治療有所改善的方法，化合物和組合物。第一方面，本發明教導了使用蘇拉明，PPS或hTR反義體，通過與端粒酶或含有端粒酶的細胞接觸，抑制端粒酶的方法。第二及其相關方面，教導了抑制患者優選哺乳動物中的端粒酶活性的方法，該患者患有端粒酶介導的疾病，所述方法包括給予該患者治療有效量的蘇拉明或其他端粒酶抑制劑。第三方面教導了改進腫瘤患者優選哺乳動物的治療結果的方法，包括給予患者使用端粒抑制劑量的蘇拉明或其他端粒酶抑制劑。給予端粒酶抑制治療的方式應使腫瘤暴露于端粒酶抑制劑的時間維持至少數個增殖周期，優選情況下，至少維持10或20個增殖周期。第四方面教導了增強癌癥患者優選哺乳動物的治療的方法，包括在細胞減滅治療期間或結束后，給予患者使用端粒酶抑制量的蘇拉明或其他端粒酶抑制劑。這種細胞減滅治療可以是腫瘤的外科切除或非手術治療，如放射治療，化療，光動力學治療。為了獲得更好的結果，可以使用一種或多種端粒酶抑制劑。第五方面，本發明教導了治療患者中癌癥的方法，所述方法通過首先確認患者可能患有癌癥或患有小到不能檢測的癌癥，給予該患者端粒酶抑制藥物，從而達到治療癌癥或抑制癌癥發展的目的。對這類患者使用端粒酶抑制藥物治療將會是有效的，因為初始的腫瘤體積較小，在腫瘤負荷威脅到患者的健康之前，還允許許多個腫瘤增殖周期。第六方面，本發明是一種治療緩解期患者的方法，所述緩解期在他或她的癌癥治療成功后，并且所述患者還有新發癌癥或癌癥復發的潛在危險。對患者毒性小或無毒性的藥物尤其適用，因為它具有良好的風險-受益比。蘇拉明，PPS或AZT等，在抑制端粒酶活性所需的低劑量時，對患者毒性很小或無毒，并提供這種良好的風險-受益比。第七方面教導了用hTR反義體轉染細胞來抑制端粒酶的方法。第八方面，本方面教導了使用無毒性劑量的AZT抗擊癌癥的方法，所述無毒性劑量產生的血漿濃度低于微摩爾范圍，例如在納摩爾范圍。第九方面，端粒酶抑制劑可以局部用藥，用于已知腫瘤附近的位置，或用于可疑目前或將來會發生腫瘤的器官。局部應用的端粒酶抑制劑會在應用部位附近的腫瘤細胞或組織內產生有效的端粒酶抑制性濃度。局部用藥，例如注射法或埋入法，可以采用儲存庫(depot)的形式，比如緩慢釋放的裝置。端粒酶抑制劑的局部給藥將在治療所靶向的組織中產生端粒酶抑制性濃度，而不需要在非治療靶向的血漿或其他器官中產生端粒酶抑制性濃度。此外，交叉參考的專利申請(美國專利申請第09/587,559號)中，申請人描述了這樣的發現，即酸性和堿性纖維母細胞生長因子(FGF)會導致對化療的廣譜腫瘤耐受，且FGF抑制劑可以增強癌癥化學治療和放射治療的抗腫瘤活性。蘇拉明和PPS是FGF抑制劑。本發明教導了這兩種制劑的端粒酶抑制活性。蘇拉明和PPS在產生FGF抑制的濃度也能產生端粒酶抑制作用。因此，蘇拉明或PPS可以與細胞毒抗癌治療聯合給予，以增強細胞毒藥物的效果，同時也抑制端粒酶，使端粒長度縮短，從而獲得附加的有益抗腫瘤效果。在細胞毒性療法結束后，可以繼續給予蘇拉明或PPS，以獲得長期抑制端粒酶活性的作用。這(兩)種藥物達即靶向FGF又靶向端粒酶的機制的用途給患者和治療的醫生提供了便利，也改善了細胞毒治療的結果(outcome)。如上文所解釋的，用端粒酶抑制劑進行有效的抗癌治療需要在腫瘤細胞的多個增殖周期中(overmultipleproliferationcyclesofthetumorcells)抑制端粒酶活性。這種持續的抑制在使用在患者體內具有長終末半衰期(例如超過一周)的藥物的情況下最有效地實現，以便在并不頻繁的治療中持續保持端粒酶活性的抑制作用。蘇拉明的清除半衰期在人類(Jordelletal.，1994)和非人類動物(見例8)中超過一周，滿足這一要求。本發明所述的化合物作為無害的端粒酶活性抑制劑，具有多種有價值的應用，例如用于哺乳動物諸如人中的癌癥的治療。本發明的藥物組合物可以應用于在體內殺死癌細胞的治療方案或用于在離體殺死癌細胞的治療方案。因此，本發明提供了治療癌癥的治療性化合物和組合物，以及治療人類及其他哺乳動物(例如，狗，貓，牛，馬和其他獸醫學所涉及的動物)中的癌癥及其他端粒酶介導的疾病的方法。本發明的其他特性和優點通過以下的詳細描述和權利要求書可以明顯體現出來。發明詳述為方便起見，將說明書，實施例及權利要求書中使用的某些術語集合于此，以便保證對于本發明的理解清晰一致。定義本文術語“異常生長(aberrantgrowth)”指一種細胞表型，其與細胞的正常表型不同，具體指與疾病諸如癌癥等直接或間接相關的那些細胞表型。本文術語“給藥(adminstering)”指將藥劑引入細胞，例如在體外；或動物體內的細胞，即在體內；或引入細胞之后再將所述細胞放回動物體內(即離體)。本文術語“藥劑”、“藥物”、“化合物”、“抗癌藥”、“化療劑(therapeutic)”、“抗瘤劑(antineoplastic)”及“抗腫瘤藥”可以互換使用，指具有抑制或減慢異常細胞生長(如腫瘤)特性的藥劑(除非作進一步限制)。前述術語也意圖包含細胞毒性，殺細胞性或細胞生長抑制性藥劑。術語“藥劑”包括小分子，大分子(如，肽、蛋白、抗體或抗體片段)，以及核酸(如，基因治療構建體，重組病毒、核酸片段(包括，例如合成核酸片段)。本文術語“凋亡”指任何非壞死的，細胞調控的細胞死亡形式，如本領域已經明確制定的標準所定義。本文術語“良性的”、“癌前的”和“惡性的”的定義按本領域公認的含義。本文術語“癌癥”、“腫瘤細胞”、“腫瘤”、“白血病”，或“白血病細胞”可以互換使用，指代任何腫瘤(“新生物”)，諸如癌(來源于上皮細胞)，腺癌(來源于腺體組織)，肉瘤(來源于結締組織)，淋巴瘤(來源于淋巴組織)或血液系統腫瘤(例如，白血病或紅白血病(erythroleukemia))。術語“癌”和“腫瘤細胞”也意圖包括癌組織或腫瘤團塊，應理解為癌細胞或腫瘤細胞的集合(compilation)。此外，術語“癌癥”和“腫瘤細胞”包括良性，癌前性及惡性的癌或細胞。通常情況下癌或腫瘤細胞會顯示各種本領域公知的特性(hallmark)，諸如生長因子非依賴性，缺乏細胞/細胞接觸生長抑制和/或異常核型。與之相反，通常情況下正常細胞在培養基內接種只能進行有限次數的傳代且/或表現出各種本領域公認的屬于正常細胞的特點(如，生長因子依賴性，接觸抑制，和/或正常核型)。本文術語“細胞”包括任何真核細胞，諸如體細胞或生殖細胞系的哺乳動物細胞或細胞系，如，HeLa細胞(人類)、NIH3T3細胞(鼠)、胚胎干細胞和各種細胞類型如造血干細胞、成肌細胞(myoblast)、肝細胞、淋巴細胞和上皮細胞以及例如本文描述的各種細胞系。本文術語“確認患者患有或將患有(identifyingapatienthavingorabouttohave)”是指使用各種本領域所公認的診斷或預后技術，包括例如前列腺特異性抗原(PSA)試驗、BRCA1和/或BRCA2基因分型(genotyping)、遺傳繪圖(geneticprofiling)等技術，患者已經被確診患有或從統計學角度看可能患有癌癥。這一術語也意圖包含僅僅知道或者接受任何提示患者正患有或將患癌癥的信息。本文術語“抑制或減慢細胞生長”，例如，癌細胞，是指使其生長和/或轉移減慢，干擾或停滯，并且可能但不是必然需要，例如，細胞的異常生長完全消除。這一術語也意圖包括通過細胞死亡(凋亡)或壞死來抑制或減慢細胞生長。本文術語“局域地(locally)”及“區域地(regionally)”可以互換使用，指將治療用于腫瘤團塊內，或帶有腫瘤的器官內，或總體腫瘤范圍或可以種植上轉移灶的區域，或癌前病灶內，例如對某種腫瘤類型特異的器官，如前列腺特異于前列腺癌。本文術語“腫瘤負荷”是本領域中廣泛公認的術語，指患者體內腫瘤組織的部分或全部質量、體積或尺寸。腫瘤尺寸要通過標準的臨床手段確定，通常包括觸診或影像學方法(例如，x線，CAT掃描，PET掃描，超聲掃描圖(ultrasoundsonogram))。腫瘤負荷可以通過腫瘤尺寸的總和來評價。腫瘤負荷是一種公認的反映疾病的臨床進程的指標，腫瘤負荷大預示預后不良，而腫瘤負荷小則是預后良好的征象。通常認為腫瘤負荷與腫瘤對患者的致命性相關。盡管人類患者經常能承受大約1kg的腫瘤負荷，但不能將其視為普遍規律，因為腫瘤發生的部位和腫瘤可能導致的破壞是與腫瘤團塊相關的致命性的重要決定因素。例如，在腦內生長的轉移腫瘤可以在尺寸僅有幾厘米時就致命，而發生在肝臟或內臟(viscera)的腫瘤即使大得多也可以承受。因此，對于腦內發生了腫瘤轉移的患者，致命性的腫瘤負荷量可以比沒有腦內轉移的患者小很多。本文術語“系統性”指為使藥物廣泛分布于受試者的系統性而采用的治療途徑，諸如口服或經靜脈內用藥。同樣“系統”濃度指的是整個體內的濃度，如循環血漿中檢測到的濃度。本文術語“可藥用的載體”是領域內公認的，包括一種可藥用的材料、組合物或運載體(vehicle)，適于用來將本發明的藥物用于哺乳動物。本文術語“藥物組合物”包括適用于哺乳動物(如人類)的制劑。當本發明的化合物作為藥劑用于哺乳動物，如人類時，以該藥劑原型或以藥物組合物的形式用藥，所述藥物組合物含有例如0.1到99.5％(較為優選的是0.5到90％)的活性成分(如，治療有效量)以及可藥用的載體。本文術語“受試者”意為包括人類和非人類動物(如，小鼠、大鼠、兔、貓、狗、家畜和靈長類)。優選的人類動物包括患有某種病癥的人類患者，該病癥的特點是異常的細胞生長，如癌癥。本文術語“端粒”指真核細胞染色體的末端，其在癌細胞中經常會反常的延長。本文術語“端粒酶”指細胞酶或酶活性，其針對核苷酸聚合作用或維護染色體末端的、已知為端粒的結構。本文術語“端粒酶抑制藥物”和“端粒酶抑制劑”指抑制(完全或部分地)端粒酶活性的藥物。本文術語“端粒酶抑制作用”指可直接測定的對端粒酶的抑制作用，例如，通過采用改良的TRAP測定法證實，其中改良的TRAP測定法由Gan等人描述(Ganeta/.，Pharm.Res.，18488-493，2001)；或根據用TALA測定法證實所有細胞內平均端粒長度的縮短，其中TALA測定法證由Gan等人描述(Ganeta/.，Pharm.Res.，181655-1659，2001)；或用FISH測定法證實各個細胞中的單個端粒的損耗(erosion)，其中FISH測定法由Gan等人描述(Ganetal.，Pharm.Res.，181655-1659，2001)。本文術語“化學增敏劑”指一種藥劑，它可以增強第二種藥劑，如抗癌化療藥劑的抗腫瘤效果。術語“化學增敏作用”指通過化學增敏劑，癌癥化療藥劑的抗腫瘤活性與沒有使用這種化學增敏劑時該癌癥化療藥劑的抗腫瘤活性相比而言有所提高。本文術語“化學預防”指使用藥劑預防腫瘤、癌癥的發生。術語“化學預防藥劑”指可以預防腫瘤、癌癥發生的藥劑。本文中，端粒酶抑制藥劑和/或化學治療劑的“治療學有效量”指這種藥劑單獨或聯合使用時的量，所述量在以單劑或多劑給予受試者(如人類患者)后，可以有效抑制端粒酶的活性(對于端粒酶抑制藥劑)或抑制或減慢異常細胞生長例如癌癥(對于化學治療劑)。本文術語“戊聚糖多聚硫酸酯(pentosanpolysulfate)”或“PPS”指半合成的硫酸酯化的(sulfated)多聚陰離子，其由β-D-吡喃木糖殘基構成，特性與肝素類似，分子量在1500-5000范圍內。舉例來說，Merckindex，第10版，第1025頁，Merck&Co，Inc，1983中有對該化合物的描述。表示該化合物的其他名稱還有木聚糖氫硫酸酯(xylanhydrogensulfate)、木聚糖多聚硫酸酯(xylansulfate)、CB806l；Fibrase；Hemoclar.本文術語“生物標志”與領域內公認的意義相同，指分子或化合物，如蛋白或基因，其存在或其水平可以提示疾病的存在或發生疾病的可能性提高，所述疾病如癌癥。例如，前列腺特異抗原水平升高的患者很可能患有或發生前列腺癌。BRCA1或BRCA2基因具有突變的患者很可能患有或發生乳腺癌和卵巢癌。本文術語“離體(exvivo)”指使用在組織培養中的活細胞進行的試驗。端粒酶抑制劑如上所述，細胞的無限增殖常涉及端粒酶的活化等。更具體的是，分析端粒酶的活性已經證實了端粒酶活性與許多腫瘤細胞系保持無限增殖的能力之間的關系，所述腫瘤細胞系包括皮膚、結締組織、脂肪、乳腺、肺、胃、胰腺、卵巢、宮頸、子宮、腎臟、膀胱、結腸、前列腺、中樞神經系統、視網膜和血液腫瘤細胞系(Kimeta/.，1994，Science，2662011-2014)。這一信息以及現有技術的補充都提示端粒長度的縮短可以產生凋亡信號或復制性的老化(replicativesenescence)(WO93/23572)，表明在足夠長的時間內抑制端粒酶活性可以作為一種有效的抗癌治療。在一項相關的實施方案中，本發明是抑制細胞增殖或復制的方法。在這項方法中，本發明所描述的可以抑制端粒酶活性的一種或多種制劑是在細胞復制時提供的。如上所解釋的，端粒酶對線性染色體DNA的末端完全地復制而不會損失每股鏈的5’末端的終末堿基有重要作用。無限增殖的細胞和迅速增殖的細胞利用端粒酶來在染色體末端添加端粒DNA重復。端粒酶抑制會導致增殖的細胞不能添加端粒，這些細胞就會逐漸停止分裂。這種抑制細胞增殖能力的方法可以有效用于治療與細胞增殖速度提高相關的疾病，諸如在癌癥中(惡性細胞中的端粒酶活性)，及例如造血作用(hematopoiesis)(造血干細胞中的端粒酶活性)，這對于本領域普通技術人員來說也是顯而易見的。因此，一方面，本發明教導了蘇拉明、PPS和hTR-反義體抑制端粒酶的用途，用于預防或治療多種類型的惡性腫瘤。具體是，本發明的化合物可以提供高度廣泛的治療惡性腫瘤的方法，如表達端粒酶的人腫瘤細胞系和腫瘤的高百分比所證明的。更重要的是，本發明中描述的化合物可以有效提供選擇性攻擊惡性細胞的療法，因此避免了與細胞毒性化學治療藥劑有關的多種有害的副作用，所述藥劑是不加區別地殺傷分裂中的細胞。本發明的化合物可以擴展到蘇拉明和PPS的類似物，這些類似物也抑制端粒酶。另一方面，本發明提供了用于抑制端粒酶的化合物，與這些化合物有關的藥物組合物和方法，或它們的可藥用的鹽，其中包括使端粒酶與化合物或其可藥用的鹽接觸，其中該化合物是蘇拉明或PPS。在一項優選的實施方案中，將要抑制的端粒酶是哺乳動物的端粒酶，如人的端粒酶。端粒酶抑制劑的抗腫瘤活性本發明的第二方面及其相關方面是，發現了蘇拉明在受試者體內的量維持在可以有效抑制端粒酶活性的水平時，可以縮短腫瘤端粒的長度。因此，本發明的這一方面教導了抑制患者的端粒酶活性的方法，這類患者優選的是哺乳動物患有端粒酶介導的疾病，所述方法包括給藥患者治療有效劑量的蘇拉明或其他端粒酶抑制劑。本發明所描述的化合物可以抑制細胞提取物、培養的細胞和完整動物細胞中的端粒酶。本發明中制劑的活性也可以用本文描述的技術來展示。用來鑒定本發明的化合物的方法之一是使細胞、組織、較優選的是細胞提取物或其他含有端粒酶的制備物，與數種已知濃度的受試化合物在與端粒酶活性相容的緩沖劑中接觸。檢測每個濃度的受試化合物的端粒酶活性，且化合物的IC50值(可以對酶活性產生的抑制作用達初始或對照值的50％的受試化合物濃度)以及其IC90用標準技術測定。可采用用于確定本發明中的制劑對端粒酶的抑制濃度的另外的方法，其根據本發明所公開的信息，對于本領域技術人員是顯而易見的。根據如上描述的方法，檢測并發現蘇拉明和PPS的IC50值低于10μM。關于使用本文描述的化合物來治療惡性疾病，預期本發明所描述的化合物會在端粒酶依賴細胞系中誘導驟退(crisis)。對端粒酶依賴的細胞系，如人類咽喉FaDu細胞，預期用本發明的化合物進行治療也會引起所治療細胞中端粒長度的縮短。預期本發明中描述的化合物也會引起人類腫瘤細胞系細胞分裂過程中的端粒縮短，所述人類腫瘤細胞系如FaDu細胞和人前列腺PC3細胞。但是重要的是，在作為對照的正常人類細胞中，如纖維母細胞來源的BJ細胞，觀察到的端粒縮短與僅用運載體，如生理鹽水處理的細胞沒有差別。本發明所描述的化合物在推薦的端粒酶抑制的濃度時，在正常細胞中也沒有顯著的細胞毒效應。此外，本發明描述的化合物對端粒酶的特異性可以通過將它們對端粒酶的活性(IC50)與它們對其他酶類的活性比較來進行評價。如本領域內所公認的，酶是促進生物反應的分子。舉例來說，體外試驗中，具有與端粒酶類似的相似核酸結合或修飾活性的酶包括DNA聚合酶I，HeLaRNA聚合酶II，T3RNA聚合酶，MMLV逆轉錄酶I，拓撲異構酶I，拓撲異構酶II，末端轉移酶和單鏈DNA結合蛋白(SSB)。也包括其他不屬于該組的酶。如果化合物對于端粒酶的IC50值相對于其對于被篩查的其他酶的IC50值而言較低，認為該化合物對端粒酶具有特異性。或者，如果化合物對于端粒酶的IC90值相對于其對于被篩查的其他酶的IC90值低，就認為該化合物對端粒酶具有特異性。也可以用小鼠異種移植物模型進行體內試驗，所述小鼠異種移植物模型如將FaDu腫瘤細胞植入裸鼠，用本發明的化合物進行治療的小鼠被預期具有腫瘤團塊，一般說來，可能會減小、持續不變或者甚至在首次劑量用藥后一段時期內會增大，但是隨著持續的治療，腫瘤治療(mass)將會縮小。與之相反，預期用生理鹽水處理的對照組動物發生的腫瘤團塊將會持續增大。根據前述信息，本領域技術人員將會意識到本發明也提供了對涉及本發明的化合物給藥的治療方案進行選擇的方法。為了這一目的，進行末端限制片段(terminalrestrictionfragment，TRF)分析是有幫助的，這種分析中，將腫瘤細胞的DNA用對特異性序列不是端粒序列(T2AG3)n的限制性內切酶酶解。這種分析方法的一個示例是以前的一項專利申請(美國專利申請第10/464,018號)。DNA酶解之后，進行凝膠電泳來將限制內切片段按大小分離開來。分離開的片段用端粒序列特異性核酸引物檢測，測定含有樣本中細胞的端粒DNA的末端片段的長度。通過測量端粒DNA的長度，人們可以估計應端粒酶抑制劑的給藥應持續多久，以及是否還應該采用其他的治療方法(如，外科手術，化療和/或放療)。另外，在治療中，人們可以檢測細胞來判斷經過進行性(progressive)細胞分裂，端粒長度是否發生了縮短，以便證明治療的效果。在化療前的端粒酶抑制預處理本發明的第三個方面是發現了在癌癥化療開始前用蘇拉明治療可以增強腫瘤化療的有效性，此時存在最小殘余病變(minimalresidualdisease)，給予的蘇拉明的量可以有效抑制端粒酶活性。因此，本發明的這一方面教導了改善癌癥患者優選哺乳動物的治療結果的方法，包括給患者使用端粒酶抑制量的蘇拉明或其他端粒酶抑制劑。優選的是，給予端粒酶抑制治療的方式應使腫瘤暴露于端粒酶抑制劑的時間維持至少數個增殖周期，更優選的情況，至少維持10或20個增殖周期。優選的方法是在給予細胞毒性方案前給予端粒酶抑制劑。可替換的優選方法是在給予細胞毒性方案之前及其期間給予端粒酶。優選的實施方案是，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明，給予蘇拉明的量可以有效抑制端粒酶活性，而不足以產生抗腫瘤活性。細胞減滅治療之后繼續端粒酶抑制作用本發明的第四方面是發現了在細胞減滅治療期間或結束后維持血漿中蘇拉明的濃度在端粒酶抑制性水平可以促進腫瘤縮小，延緩腫瘤生長，并延長腫瘤患者的生存時間。因此，本發明的這一方面提供了強化癌癥患者治療的方法，所述癌癥患者優選的是哺乳動物，包括在細胞減滅治療期間或結束后給患者使用治療有效量的蘇拉明或其他端粒酶抑制劑。這種細胞減滅治療可以是外科切除腫瘤或非手術治療，如，放射治療，化療，光動力治療(photodynamic)。優選的，給予端粒酶抑制治療的方式要使腫瘤暴露于端粒酶抑制劑的持續時間相當于至少數個增殖周期，更優選地應達至少10到20個增殖周期，端粒酶抑制劑的血漿濃度應為已知可以對腫瘤產生端粒酶抑制的濃度。優選的方法是在給予細胞毒性治療方案期間和之后給藥端粒酶，這樣細胞毒性治療方案會減小患者的腫瘤負荷，從而可以為端粒酶抑制劑提供足夠長的前導時間(leadtime)，使得端粒縮短到低于引起細胞死亡和老化的臨界長度。另一個實施方案中，通過外科方式實現腫瘤尺寸的縮小。再一個實施方案中，在細胞毒性治療方案終止后(如由于在癌癥患者中的劑量限制毒性作用而終止)后，給予端粒酶抑制劑作為抗擊癌癥的方式。優選地，在細胞毒性治療方案終止之后給予端粒酶抑制劑，而且端粒酶抑制劑的用藥應持續至少數周、數個月、數年，或更優選的是，無限期使用。申請者發現蘇拉明和PPS使腫瘤細胞對細胞毒性治療如癌癥化學治療和放療的敏感性增加(美國專利申請序列號09/587,559；實施例10)。因此，這兩種化合物中任何一種或兩種化合物的聯合使用可以用來使腫瘤細胞對細胞毒性抗癌治療敏感性增加，而且同時也提供抑制端粒酶活性的附加益處，從而促進端粒的縮短。在細胞毒性腫瘤治療方案終止后，用蘇拉明和PPS或其他端粒酶活性的抑制劑的治療可以持續下去。蘇拉明和PPS的這種雙重治療獲益代表了使用這些化合物治療的意外優勢。利用端粒酶抑制作用的化學預防第五方面，本發明教導了治療患者的癌癥的一種方法，其通過以下過程進行確認患者將患有癌癥，或體內的(harbor)癌癥小到常規方法不能檢測的程度時，給予患者端粒酶抑制藥物，從而達到治療癌癥或抑制癌癥發展的目的。例如，某些檢測腫瘤的常規方法是物理方法(如，觸診)，病理學方法(如，尿或便中的血)或影像學方法(如，X線、CAT掃描、PET掃描、超聲掃描圖)。對可能患有癌癥的或體內有不可檢測的癌癥的患者進行確認也可以通過監測生物標志物或基因缺陷來完成。例如，患者的血漿前列腺特異抗原(PSA)的水平可能超過正常界值即4ng/ml，但是直腸指檢可能沒有可以觸及的腫瘤，通過超聲成像也看不到腫瘤。升高的PSA水平提示前列腺癌癥的形成或存在可能性大，而物理檢測未發現則提示腫瘤相當小，或處于前驅(precursor)狀態。另舉一例，一名女性患者目前沒有可測定的腫瘤，卻具有BRCA1或BRCA2兩種基因的突變，顯示其患乳腺或卵巢癌的易患素質很強烈。領域內公認的其他用于評價腫瘤發生可能性的和腫瘤負荷方法也包括在內。對這類患者使用端粒酶抑制藥物治療可能有效，因為初始的腫瘤體積較小，在腫瘤負荷成脅到患者的健康和安樂之前，還留有許多個腫瘤增殖周期。第六方面，本發明是一種治療緩解期患者的方法，這類患者在他或她的癌癥治療成功后，還有新發癌癥或癌癥復發的較大(substantial)危險。例如，一名患者因彌漫播散的大B細胞淋巴瘤而使用如下經靜脈內給藥的治療方案方案環磷酰胺(cyclophosphamide)750mg/m2，阿霉素(doxorubicin)50mg/m2，長春新堿(vincristine)1.4mg/m2，及口服強的松(prednisone)100mg/m2，結果顯示患者對此治療反應緩慢，逐漸達到緩解，患者癌癥發生復發的統計學上的可能性較高(Armitage，eta/.，JClin.Oncol.，4160-164，1986)。該患者用端粒酶抑制劑治療將會獲益。如果患者的腫瘤再次出現，端粒酶抑制劑會有效進行抗擊該患者的癌癥。對患者毒性小或無毒性的藥物尤其適用，因為它具有良好的風險-受益比。蘇拉明，PPS或AZT等，在抑制端粒酶活性所需的低劑量時，對患者毒性很小或無毒，也就具有這種良好的風險-受益比。用hTR反義體進行端粒酶抑制本發明的第七個方面是基于申請者的發現，即用hTR反義體轉染細胞可以在體外有效抑制端粒酶的活性。實施例4中，明顯顯示出了定義hRT反義體的核酸序列。因此，本發明教導了用hRT反義體轉染的細胞來抑制端粒酶的方法。低劑量AZT第八方面，本方面教導了使用無毒性劑量的AZT抗擊癌癥的方法，其產生的血漿濃度低于微摩爾范圍，例如納摩爾范圍。一個實施方案中，將AZT給予腫瘤患者，沒有伴隨其他治療。另一個實施方案，在手術細胞減滅治療后給癌癥患者使用AZT。另一個實施方案，在非手術細胞減滅治療之前，期間或其后使用AZT。端粒酶抑制劑在靶位置或靶器官的局部用藥第九方面，端粒酶抑制劑可以在已知腫瘤附近的位置局部或區域性用藥，或用于可疑目前腫瘤發生的器官或預計將來會發生腫瘤的器官。局部應用的端粒酶抑制劑會在給藥部位附近的腫瘤細胞或組織內產生有效端粒酶抑制性濃度。局域性用藥，例如注射法或埋入法，可以采用儲存庫的形式，比如緩慢釋放的裝置。根據治療部位的不同，植入可能需要外科手術。例如，一名高級別表皮膀胱癌的患者經過成功治療后可能沒有已知的殘余腫瘤，但統計學上腫瘤復發的風險高。在這樣的患者中，可以通過經尿道插入術(transurethralinsertion)直接在膀胱內置入慢性釋放端粒酶抑制劑的裝置，持續釋放的時間可以在數周、數個月或數年。釋放出來的端粒酶抑制劑可以在膀胱的粘膜層或肌肉層產生有效的抑制濃度，從而抑制腫瘤的形成，并最終抑制任何復發腫瘤。另舉一例，在前列腺特異抗原(PSA)濃度升高而懷疑前列腺癌的患者，可以采用在前列腺內部或其附近局域性給予或植入緩慢釋放的化合物，來遞送一種或多種端粒酶抑制劑，來減少發生有癥狀的腫瘤的機率。端粒酶抑制劑的局部給藥將在治療所靶向的組織中產生端粒酶抑制性濃度，而不在血漿或并非治療的靶的其他器官中產生端粒酶抑制性濃度。本發明的這一方面是基于如下發現，將蘇拉明局部用于靶器官，結果在靶組織中產生端粒酶抑制濃度(如，5到100μg/g)，而血漿內的蘇拉明濃度很低(如0.1μg/ml或更低)。局域性給藥端粒酶抑制劑與系統性用藥途徑相比具有某些優勢。一個優勢是它即避免了頻繁給藥的需要，又能保證端粒酶抑制作用持續不間斷。另一優勢是，局部用藥減小了端粒酶抑制劑對其他病非治療靶的組織產生毒性作用可能。即使全身性給藥低劑量端粒酶抑制劑如蘇拉明后也沒有明顯毒性，其中需要在癌癥患者中提供端粒酶抑制濃度(如，見實施例7)，減少非腫瘤攜帶器官的暴露可以進一步減少超敏反應或其他少見事件的幾率。考慮到系統性用藥后可能表現出毒性的其他端粒酶抑制劑的應用，這一優勢就更加突出了。另一使用PPS(或蘇拉明)的實施方案中，本發明可以通過采用膀胱局部給藥如注射或植入來治療膀胱間質炎，所述藥物可為在儲存庫如慢性釋放裝置中的形式。這一方法可以用來使治療患有膀胱間質炎的患者的治療結果增強，并通過將有效量的以一種或多種物質局部給藥患者的方式實現蘇拉明，蘇拉明的可藥用的鹽、戊聚糖多聚硫酸酯(PPS)及PPS的可藥用的鹽。抑制或減少細胞生長的方法一方面，本發明描述了抑制或減少細胞生長的方法，所述細胞生長例如異常生長，如增生或肥大性(hypertrophic)細胞生長，通過將細胞與至少一種細胞減滅藥物和至少一種端粒酶抑制藥物接觸來實現。一般說來，這些方法包括一個步驟，即將病理性過度增殖的細胞(如癌細胞)與至少一種端粒酶抑制藥物接觸，其劑量可以有效減少或抑制細胞的增殖或導致細胞殺傷。本方法可以用于培養的細胞，如，在體外或離體條件下，也可以用于受試者體內的細胞，如，作為體內治療試驗的一部分。治療方案可以實施于人類或其他動物受試者。本發明的聯合治療的治療有效性增強，代表了一種有希望的方案，其可以替代傳統的高毒性抗腫瘤藥物方案。雖然端粒酶抑制藥物也可以單獨使用，本藥物優選地與細胞毒性藥物聯用，以獲得優于任一藥物單用的預期療效的治療效果。更進一步的，這些藥物還可以與其他抗癌藥物聯用，如抗微管藥物，拓撲異構酶I抑制劑、拓撲異構酶II抑制劑、抗代謝藥物、有絲分裂抑制劑、烷化劑，嵌入劑、可以影響信號轉換途徑的藥劑(如蛋白激酶C抑制劑，如抗激素，如生長因子受體的抗體)、促進凋亡和/或壞死的藥劑，生物反應調節劑(如干擾素，如白介素，如腫瘤壞死因子)、手術或放射治療。使用上述策略，細胞毒藥物與端粒酶抑制藥物聯用時得到增強且優選協同的作用，提高了抗癌藥物的有效性，從而允許使用較低劑量的這些藥物的一種或多種(甚至，例如，可以使用藥物的亞治療劑量，只要其僅在單獨使用而不是聯用時被測試或使用)；由此降低受試者如人類癌癥患者中的誘導的副反應(如，任何領域內公認的與給予未更改劑量的化療藥物相關的副反應，如，脫發、中性粒細胞減少(neutropenia)、腸上皮細胞脫落(intestinalepithelialcellsloughing)等)。治療癌癥的方法本發明中的方法可以用于治療多種器官系統的惡性疾病，如影響肺、乳腺、淋巴樣組織(lymphoid)、胃腸道(如，結腸、直腸)、泌尿生殖道(如，前列腺、膀胱、睪丸)、咽的惡性疾病，以及腺癌，其包括如下惡性疾病，諸如結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫瘤、肺非小細胞癌、小腸癌和食道癌。可以用本發明的方法治療的常見實體腫瘤包括例如纖維肉瘤(fivrosarcoma)、肌肉瘤(myosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、軟骨肉瘤(chondrosarcoma)、成骨肉瘤(ostergeincsarcoma)、脊索瘤(chordoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、內皮肉瘤(endotheliosarcoma)、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、淋巴管內皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、間皮瘤(mesothelioma)、尤文氏肉瘤(Ewing’stumor)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、胃癌(gastriccancer)、食管癌(esophagealcancer)、結腸癌(coloncarcinoma)、直腸癌(rectalcancer)、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、頭和頸部的癌(canceroftheheadandneck)、皮膚癌、腦癌、鱗狀細胞癌、皮脂腺癌(sebaceousglandcarcinoma)、乳頭狀癌(papillarycarcinoma)、乳頭狀腺癌(papillaryadenocarcinoma)、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、髓樣癌(medullarycarcinoma)、支氣管源性癌(bronchogeniccarcinoma)、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌、絨毛膜癌(choriocarcinoma)、精原細胞瘤(seminoma)、胚胎性癌(embryonalcarcinoma)、Wilm氏瘤(Wilm’stumor)、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮細胞癌、膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤(oligodentroglioma)、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波奇肉瘤(Kaposi’ssarcoma)。本發明的方法也可以用于抑制或減少造血細胞起源的細胞的生長，如來源于髓系、淋巴系或紅系或其任何前體細胞。舉例說，本發明涉及各種骨髓來源的疾病的治療，所述疾病包括急性早幼粒細胞性白血病(acutepromyeloidleukemia)(APML)、急性粒細胞白血病(acutemyelogenousleukemia)(AML)和慢性粒細胞白血病(chronicmyelogenousleukemia)(CML)，但不限于此。(綜述于Vaickus，L.(1991)Crit.Rev.Oncol./Hemotol.11267-97)。可以用此法治療的淋巴細胞的惡性疾病包括，急性成淋巴細胞性白血病(acutelymphoblasticleukemia)(ALL，包括B系ALL和T系ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia)(CLL)、幼淋巴細胞性白血病(prolymphocyticleukemia)(PLL)、毛細胞白血病(ha的cellleukemia)(HLL)和Waldenstrom氏巨球蛋白血癥(WM)(Waldenstrom′smacroglobulinemia)，但不限于此。預期可以使用本發明的治療方法其他類型的惡性淋巴瘤還包括，非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′slymphoma)及其變體，如外周T細胞淋巴瘤(peripheralT-celllymphomas)、成人T細胞白血病/淋巴瘤(adultT-cellleukemia/lymphoma)(ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneousT-celllymphoma)(CTCL)和大顆粒淋巴細胞白血病(largegranularlymphocyticleukemia)(LGF)，但不限于此。其他可以用本發明的方法治療的惡性疾病包括紅白血病、淋巴瘤、何杰金氏病和來源不明的惡性疾病，例如，難以分類的惡性病以及表現多種細胞類型的惡性病，諸如某些胚胎性癌或畸胎瘤。舉例說明，受試者可以是患非小細胞肺癌的患者，使用紫杉醇、卡鉑和長期蘇拉明聯合治療，在紫杉醇/卡鉑聯合治療因藥物相關的毒性或因患者對其反應終止而需要停用之后，蘇拉明治療可以順利地持續進行。或者，患非小細胞肺癌的患者可以使用吉西他濱(gemcitabine)、順鉑和長期蘇拉明聯合治療。另舉一例，受試者可以是激素難治性(refractory)前列腺癌的患者，使用磷酸雌二醇氮芥(estromustinephosphate)、泰索帝(taxotere)和長期蘇拉明聯合治療或阿霉素、酮康唑(ketoconazole)和長期蘇拉明聯合治療。再舉例說明，受試者可以是患轉移性乳腺癌的患者，對其使用環磷酰胺、阿霉素、5氟尿嘧啶和長期蘇拉明聯合治療，或阿霉素、泰索帝和長期蘇拉明聯合治療。相關的例子中，受試者是患有具有HER2/neu致癌基因的過度表達的晚期(advanced)乳腺癌的患者，對其使用赫賽汀(Herceptin)和長期蘇拉明治療，聯用或不聯用紫杉醇或順鉑。再舉例說明，受試者可以是患有進展性或轉移的結直腸癌的患者，使用依利替康(irinotecan)和長期蘇拉明聯合治療。相關的例子中，受試者是患進展性結腸癌的患者，使用5氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸(leucoorin)和長期蘇拉明聯合治療。給藥方法本發明的優選實施方案中，端粒酶抑制劑是系統性應用。例如，所選的化合物可以經胃腸道外給藥(如，經皮下、經靜脈內、經肌內、經腹腔內、經皮內、經鞘內等方式)、口服、經鼻、吸入式肺內給藥、經直腸給藥和/或透皮給藥。另一個實施方案中，端粒酶抑制劑是局部或區域性用藥。例如，所選的化合物可以經膀胱內(intravesically)給藥(如，給藥至膀胱內)、經前列腺內給藥、經腫瘤內給藥或局部性(topically)給藥。另一個實施方案中，本方法進一步地包括使用重復劑量的相同或不同藥劑，某些細節將在下文中進一步討論。給藥方案本領域的普通內科醫師或獸醫可以很容易地確定并給予有效量的所述藥劑(如，以藥物組合物的形式)。例如，通常情況下，內科醫師或獸醫可以從低于所需劑量的水平開始使用本發明的化合物，以便啟動所需的治療效果，并逐漸提高劑量，直至達到所需效果。總的來說，本發明的化合物合適的劑量是可以產生治療效果即可以治療受試者的疾病如癌癥的最低有效劑量。這一有效劑量通常由上述因素決定。一般地，將本發明的化合物經靜脈和皮下給藥患者的劑量，由每公斤體重約0.0001到約100mg，更優選的范圍是約0.01到約10mg每公斤體重，更加優選的是約0.01到約4mg每公斤體重。如果需要，可以將活性藥劑的有效日劑量在全天內以適當間隔分為二、三、四、五、六或更多個亞劑量來給藥，可選為以單位劑量形式。一個優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明，且蘇拉明的濃度足以抑制端粒酶活性，但不足以產生下述作用的一或多種情況(i)對細胞增殖有顯著抑制；(ii)在人類或動物腫瘤細胞中引起顯著的細胞死亡；(iii)在受試者如人類受試者中有可測定的抗腫瘤效果和/或(iv)細胞周期停滯。評價其在培養的細胞中的效果可使用實施例14中描述的系統來確定。一個優選的實施方案中，端粒酶抑制劑是蘇拉明，其用藥的水平使得存在的蘇拉明血漿濃度不會出現下述一或多種情況(i)顯著的細胞周期停滯；(ii)顯著的細胞死亡；(iii)顯著的細胞生長抑制，例如，血漿濃度是這樣的水平，如果將同樣濃度的蘇拉明用于培養的細胞中，被治療的培養細胞中至少有50％，較優選則為至少80％，最優選的為99％在用蘇拉明治療后可以繼續下述一或多種情形分裂周期中的(cycling)細胞繼續在細胞周期中前進；細胞保持活力或細胞仍能增殖。優選的是，給予的蘇拉明量產生的血漿濃度為約0.001到100μg/ml，較優選的是約0.1到約70μg/ml，更加優選是大約0.5到30μg/ml。蘇拉明的藥代動力學以三級濃度清除為特征，半衰期分別為5.5小時，4.1天和78天。總人體清除率為0.0095升/小時/m2(Jodrell，etal.，JClin.Oncol.，12166-175，1994)。基于藥代動力學原理，本領域內的專業人員可以計算出，平均應給予患者的初始劑量約為240mg/m2，從而達到的血漿濃度將在168小時內由約90μg/ml(63pM)降至約為14μg/ml(10μM)。選擇168小時或1周的間期來舉例，是因為通常按這一時間間隔到治療的內科醫師處復診。在所需的其他治療間期中，也可以進行類似的計算來確定給予蘇拉明的初始劑量，以便達到優選的蘇拉明血漿濃度。在其后的治療周期中為調節血漿濃度所需的維持劑量也可以同樣計算。在優選的實施方案中，優選血漿內總的蘇拉明暴露量應在112天中小于7840μM-天，在112天中小于7100μM-天，在84天中小于5,880μM-天，在84天中小于5,300μM-天，在20天中小于2,000μM-天，在96小時中優選地應小于800μM-天，在96小時中優選地應小于600μM-天，在96小時中優選地應小于500μM-天，在96小時中優選地應小于400μM-天，在96小時中優選地應小于300μM-天，在96小時中優選地應小于252μM-天，在96小時中優選地應小于200μM-天，在96小時中優選地應小于150μM-天，在96小時中優選地應小于100μM-天，在96小時中最優選地應小于52μM-天。總的蘇拉明暴露量以μM-天表示，是以μM-天為單位表示的藥物血漿濃度(如24小時中的平均微摩爾濃度)與以天為單位表示的治療期間兩者的乘積。例如，以13μM的蘇拉明對受試者治療4天，導致總藥物暴露量在96小時中為52μM-天。優選地，給予蘇拉明的量所產生的血漿濃度應小于100μM/ml，優選地應小于90μM/ml，優選地應小于80μM/ml，優選地應小于60μM/ml，優選地應小于40μM/ml，更優選地應小于15μM/ml，最優選地應小于10μM/ml。在優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明，給予蘇拉明或使血漿中蘇拉明濃度維持在足以抑制端粒酶活性的水平的期間超過一個月，或更優選的為超過一年，或更優選的為無限期。在優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明，給予蘇拉明或使血漿中蘇拉明濃度維持在足以抑制端粒酶活性的水平的期間超過60天，優選的為超過100天，優選的為超過150天，優選的為超過1年，更優選的為超過2年，最優選的為無限期，超過給予細胞減滅治療的期間。在優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明，給予蘇拉明的方式是局部給藥靶器官，將蘇拉明治療所針對組織中的蘇拉明濃度維持在足以抑制端粒酶活性的水平的期間超過1個月，或優選的為超過1年，或更優選的為無限期。例如，使用蘇拉明來進行癌癥預防時，治療可能需要使用數年，延伸到患者的整個余生。在一項優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明，給予蘇拉明的方式是局部給藥靶器官，將蘇拉明治療所針對組織中的蘇拉明濃度維持在足以抑制端粒酶活性的水平的期間超過60天，優選的為超過100天，優選的為超過150天，優選的為超過1年，更優選的為超過2年，最優選的為無限期，超過給予細胞減滅治療的期間。在優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明，給藥蘇拉明或將血漿中蘇拉明的濃度維持在足以抑制端粒酶活性或增強細胞減滅治療效力的水平的期間為30天以上，優選的為超過60天，優選的為超過100天，優選的為超過150天，優選的為超過1年，最優選的為超過2年，所述期間為在給予細胞減滅治療第一天之前的期間。本文描述的方法使用蘇拉明來增強細胞減滅治療的抗腫瘤效果，選擇蘇拉明劑量使其在用細胞減滅療法治療的哺乳動物中所產生的血漿濃度低于100μg/ml，優選低于80μg/ml，優選低于60μg/ml，更優選低于40μg/ml，最優選低于15μg/ml。蘇拉明的給藥可以在使用至少一種抗癌藥或其他細胞減滅治療之前、同時或之后進行。本文所示動物試驗顯示，以兩個每周一次(twoweekly)10mg/kg靜脈內彈丸式蘇拉明對小鼠的治療增強其后應用的抗腫瘤藥(如紫杉醇)的療效，而不會產生附加的體重減輕。計算采用這一劑量可以使得在定量給藥(doseadministration)72小時后產生的血漿蘇拉明濃度約為10μM(～14μg/ml)。現有技術的方法使用高劑量的蘇拉明，將其單獨使用或與細胞毒藥物聯用，對于人類患者，要產生可測量的抗腫瘤作用需要將血漿蘇拉明的濃度維持在150到300μg/ml(Eisenbergereta/.，(1995)JClinOncol132174-2186；Klohs，美國專利第5,597,830和第5,767,110號)。目的在于維持蘇拉明血漿濃度在150到300μg/ml的通常的蘇拉明劑量時間表組成為第一周內初始給藥量為2100mg/m2，并每28天重復給藥后續劑量，所述給藥持續6個月或更久；后續劑量的調整使用貝葉斯定理(Bayesian)藥代動力學方法(Dawsonetal.，ClinCancerRes437-44，1998；Falconeeta/.，Cancer86470-476，1999)。以這種劑量和長期治療，蘇拉明會對人類患者引起以下毒性作用腎上腺機能不全、凝血疾病(coagulopathy)、外周神經病及近端肌無力(DorrandVonHoff，CancerChemotherapyHandbook，1994，pp859-866)。確知這些毒性作用的發生率和嚴重性與劑量累積有關，而且本文描述的方法可以將其減至最小。一項優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是PPS，優選地，給藥蘇拉明的濃度足以抑制端粒酶活性并導致腫瘤細胞的端粒縮短，但不足以產生下述一或多種影響(i)顯著的抗凝活性；(ii)在人類或動物腫瘤細胞中引起顯著的細胞死亡；(iii)在受試者如人類受試者中有可測定的抗腫瘤效果和/或(iv)細胞周期停滯。雖然本發明的藥劑可以單獨給予也可以與其他藥物聯合給予，優選所述藥劑作為藥物組合物的形式給藥。在一項優選的實施方案中，所述端粒酶抑制劑是蘇拉明。組合物和配方另一方面，本發明涉及藥物組合物，其包括至少一種端粒酶抑制劑和可藥用的載體。優選的，存在的藥劑的量可有效抑制人類腫瘤中端粒酶的活性，并增強對過度增殖的細胞的殺傷。在一項優選的實施方案中，所述藥物組合物或多種藥物組合物的包裝中帶有使用說明，如本文所述。本發明也包含定時釋放的(timed-release)配方，例如，端粒酶抑制劑的緩慢釋放的配方和可藥用的載體。在另一個實施方案中，藥物組合物適用于將靜脈內注射。這一組合物也適于局部性、區域性或系統性用藥。在另一個實施方案中，藥物組合物可以包含一種或多種可藥用的載體。而另一個實施方案中，發明有涉及納米顆粒，其包含交叉相連的凝膠和治療藥劑，如端粒酶抑制劑，例如蘇拉明或PPS等。此外另一個實施方案中，本發明涉及包含納米顆粒和可藥用的載體的復合物。該載體，例如，可以適用于系統性給藥、區域性給藥或局部給藥。在一個實施方案中，納米顆粒直徑約為約500到約1μm，或約為600nm到約800nm。本發明還有涉及含有治療藥物如端粒酶抑制劑、如蘇拉明或PPS等的納米顆粒。在一個實施方案中，所述納米顆粒直徑為約500nm到約100μm，約500nm到約50μm，約500nm到約25μm，約500nm到約20μm，約500nm到約15μm，約500nm到約10μm，約750nm到約10μm，約1μm到約10μm，約750nm到約7.5μm，約1μm到約7.5μm，約2μm到約7.5μm，3μm到約7μm，或約5μm。另一個實施方案中，發明有涉及化合物，其包含納米顆粒和可藥用的載體。該可藥用的載體，例如，可以適用于系統性給藥、區域性給藥或局部給藥。本發明還涉及治療患者的方法，包括對患者給藥本發明的納米顆粒和可藥用的載體。另一個實施方案中，本發明涉及適用于經口服或系統性給藥患者的納米顆粒，其含有紫杉醇，其中所述的納米顆粒直徑約為5μm。另一個實施方案中，本發明涉及適用于經口服或系統性給藥患者的納米顆粒，其含有蘇拉明或PPS，其中所述的納米顆粒直徑約為5μm。本發明還涉及試劑盒，即制品，其用于癌癥的治療。這種試劑盒包括可藥用的載體中的端粒酶抑制劑，容器，以及使用所述端粒酶抑制劑來抑制或減少細胞生長的說明書，所述細胞生長例如與腫瘤或癌癥有關的異常生長。例如，本發明的試劑盒中可能包含用于提前、后續或同時給藥的端粒酶抑制劑。試劑盒也可以提供配制成劑型的端粒酶抑制劑和適用于局部、區域或系統性用藥的載體。更進一步，試劑盒也可以提供預后、診斷和/或癌癥的分期，用于例如，評價對癌癥的易感性和抵抗力。含有本發明的復合物的藥物組合物可以含有濕化劑、乳化劑和潤滑劑，如月桂基硫酸鈉(sodiumlaurylsulfate)和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包被劑、甜味劑、調味劑及香化劑，和防腐劑。本發明的配方包括適于各種給藥方式的配方，所述給藥方式包括口服、經鼻、局部、吸入、透皮、經頰、經舌下、經直腸、經陰道和/或經胃腸道外給藥。按各種用藥途徑采用合適的形式。例如，可以用藥片或膠囊的形式給藥，通過注射、吸入、滴眼液、軟膏、栓劑等，通過注射、輸注或吸入給藥；用洗劑或軟膏局部給藥；用栓劑經直腸給藥。該配方易于以單位劑量的形式提供，可以用制藥技術中眾所周知的方法制備。單劑形式中與載體物質結合的活性成分的量通常是可以產生治療效果的量。通常情況下，按百分比例計，活性成分的量可以在約1％到約99％，優選的是約5％到約70％，最優選的是約10％到約30％。本發明適于口服給藥的配方的形式包括膠囊、扁囊、丸劑、藥片、錠劑(采用有味道的基質，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或西黃蓍膠)、藥粉、顆粒劑，或用水或非水液體中的溶液或懸浮液，或制成水包油或油包水的液體乳劑，或制成酏劑或糖漿，或制成軟錠劑(采用惰性基質，如白明膠或甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或漱口液等。透皮貼劑具有額外的優勢，可以使得本發明的藥物有控制地釋放入體內。這種藥劑形式可以通過將所述化合物溶解或分散入合適的介質中制成。也可以用吸收增強劑來提高化合物通過皮膚的流速。這種流速可以通過下述兩種方式之一控制提供控速膜或將活性化合物分散到聚合物基質或凝膠中。眼科配方、滴眼液、藥粉、溶液等也可以認為包含在本發明的范圍內。本發明適于經胃腸道外給藥的藥物組合物含有本發明的化合物中的一種或多種，其與一種或多種以下物質聯合可藥用的消毒等張含水或非水溶液、分散劑、混懸劑，或乳劑，或無菌粉劑，其在使用前要溶解于無菌的可注射溶劑或分散劑中，其中可以含有緩沖劑、抑菌劑、使得配方與目的受者血液等張的溶質，或懸浮劑或增稠劑。某些情況中，為了延長藥物的作用，需要通過經皮下或經肌內注射的方式減慢藥物的吸收。這可以通過使用晶體的懸液或水溶性差的無定形物質來實現。藥物的吸收速率依賴于其溶解率，而溶解率則由晶體的大小和晶體形式決定。或者可以通過將藥物溶解或懸浮到油質載體中來使得經胃腸道外給藥的藥物形式吸收減慢。可注射的存儲形式的制備是通過在生物可降解的聚合物例如多乳酸聚乙醇酸交酯(polylactide-polyglycolide)中，形成受試化合物的微膠囊狀基質。根據藥物與聚合體的比值和所用的特定聚合體的性質，藥物的釋放速度可以得到控制。其他生物可降解的聚合體的例子包括，例如聚(原酸酯(orthoester))和聚(脫水物(anhydride))。可注射的存儲形式也可以用另一種方式制備，即將藥物包埋(entrapping)于與機體組織相容的脂質體或微乳劑中。無論選擇哪種給藥途徑，本發明的化合物和/或本發明的藥物組合物都是用本領域專業人員眾所周知的常規方法配制成的可藥用的劑型，其中該化合物可以以合適的水合形式應用。本發明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可能各不相同，以便獲得一定量的活性成分，所述一定量可有效實現對具體患者、組合物和給藥方式的所需反應，而對患者沒有毒性。所選的劑量水平由多種因素決定，包括本發明所采用的具體化合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑、給藥時間、所采用的具體化合物的排泄率、治療持續的時間、與所用藥物聯合使用的其他藥物、制劑和/或物質、所治療患者的年齡、性別、體重、狀態、總體健康情況和既往病史，以及醫學領域內公認的類似因素。實施例現已簡要說明本發明，提供以下實施例以有利于進一步理解。提供這些實施例旨在說明本發明的一些實際應用領域，并非限制本發明的應用。在所述的所有實施例中，除非特別說明，本發明所運用的技術均為化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、細胞培養、動物飼養等常規技術，均屬于現有技術人員能力范圍內的技術并在文獻中有詳述。如參見Sambrook，FritschandManiatis，MolecularCloningColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；DNACloning，第1和2卷，(D.N.Glover，Ed.1985)；HarlowandLane，AntibodiesaLaboratoryManual，(1988)ColdSpringHarbor；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait，Ed.1984)；NucleicAcidHybridization(B.D.HamesandS.J.Higgins，Eds.1984)；theseriesMethodsInEnzymology(AcademicPress，Inc.)，特別是第154和第155卷(WuandGrossman，Eds；andCurrentProtocolsinMolecularBiology，eds.Ausubeleta/.，JohnWiley&Sons(1992)).材料與方法基本方法學所需材料(例如，藥物、化學品及反應物，人乳腺MCF7細胞，因FaDu細胞，前列腺PC3細胞)，免疫缺陷鼠體內的FaDu腫瘤異種移植物以及三維腫瘤組織培養均根據美國應用專利序列號09/587,662，andGanetal.，FEBSLetters，52710-14，2002所述獲得、準備及使用。組織培養細胞的藥物效果的測定方法如美國應用專利序列號09/587,662所述。細胞溶解產物及完整細胞內端粒酶活性的抑制改良的端粒重復擴增方案(ModifiedTelomericRepeatAmplificationProtocol)(TRAP)分析(Gan，etal.，Pharm.Res.，18488-493，2001)用于測定細胞溶解產物中的端粒酶活性。完整細胞內端粒酶活性的測定采用細胞內TRAP分析，如下所述用PBS洗滌細胞(1×105)兩次，并離心分離。將細胞沉淀重懸于含有5u/毫升的鏈球菌溶血素(Streptolysin)O、2微摩的TS引物及50微摩dNTP的100微升無血清RPMI1640中，室溫保溫5分鐘。酶鏈球菌溶血素O增加細胞膜對TS引物的通透性。進入細胞后，TS引物由細胞內端粒酶原位延長。然后，將延長后的TS引物從細胞中分離，作為PCR放大的模版。向細胞中加入200微升含有10％PBS的RPMI1640培養基以終止反應。將混合物在30℃保溫30分鐘，以利用端粒酶延伸細胞內TS引物。之后，將細胞溶解，使用TRAP方法直接對含有已經被延長的TS引物的細胞溶解物進行分析。培養的細胞中的端粒酶長度的測定兩種方法可用于測定端粒酶的長度。第一種方法是基于端粒酶含量及長度測定的溶液雜交法(TALA)(Gan，etal.，Pharm.Res.，181655-1659，2001)，測定終端限制片段(TRF)的平均長度。第二種方法是原位熒光雜交法(FISH)來測定端粒酶信號，并估計染色體末端各個端粒的大約長度。FISH方法如美國應用專利序列號.09/587,662及Gan等，2001所述。衰老細胞的測定可使用(Dimri等，1995)所述的4-半乳糖苷酶染色法測定衰老細胞。實施例1蘇拉明及AZT是有效的端粒酶抑制劑-在細胞提取物及培養的細胞中端粒酶的抑制蘇拉明是有輕度的抑制反轉錄酶活性的作用、但不確定是否能抑制端粒酶的藥劑，在多種人類腫瘤細胞系中對其進行了研究，所述細胞系包括人類咽FaDu，人類前列腺PC3及人類乳腺MCF7細胞。將其活性與AZT活性相比較。處理方法使用蘇拉明或AZT的處理在允許培養瓶內的細胞接觸生長界面之后開始。試驗當天，將培養基移出，用含有抑制劑的培養基置換。所用藥物濃度分別是0，0.1，1，5，10，50微摩的蘇拉明，或0，0.1，1，10，100微摩的AZT。在含有0到50微摩的蘇拉明或AZT的培養基中生長7-15周后，測定細胞溶解物及完整細胞中的端粒酶活性及端粒長度。蘇拉明及AZT對端粒酶活性的影響在人類癌癥細胞中端粒酶活性可以被蘇拉明和AZT抑制，并有濃度依賴性。產生50％抑制的濃度見表1。產生90％抑制所需的濃度少于50毫摩。表1端粒酶活性的抑制a不能確定，由于從AZT到三磷酸鹽的活化僅發生在完整細胞中而非細胞提取物中，所述活化是抑制端粒酶的部分。蘇拉明和AZT對端粒酶長度的影響使用蘇拉明或AZT進行的7-15周的延長處理導致FaDu細胞中的34-55％端粒縮短，PC3細胞中約30％端粒縮短。結論蘇拉明在毫摩濃度水平能夠有效地抑制端粒酶的活性，并與已知端粒酶抑制劑AZT的作用相似。實施例2在負瘤動物體內，蘇拉明是有效的端粒酶抑制劑蘇拉明在體內抑制端粒酶并縮短端粒長度。蘇拉明為端粒酶抑制劑在體內的有效性，是通過對免疫抑制的小鼠體內所移植腫瘤細胞內的端粒長度進行測定來評估的。處理方法將FaDu細胞(0.51×106細胞/100ul)移植于雄性BALB/cnu/nu鼠皮下。該鼠接受經尾靜脈內注射的重復劑量的10毫克/千克蘇拉明。首次劑量應在腫瘤移植后立即給與，之后每周兩次重復給藥。蘇拉明治療2-6周后收集腫瘤標本。采用熒光原位雜交法分析冰凍組織切片中各細胞內的端粒長度。從各個切片中隨機選取10個400倍放大的顯微鏡視野，記錄端粒信號減弱或消失的腫瘤細胞百分比例。結果與注射生理鹽水而非蘇拉明的對照組進行比較。蘇拉明在體內對端粒酶長度的影響經蘇拉明或生理鹽水處理后的鼠體腫瘤種植成功率相同，均為100％，體重升高不明顯。FISH的結果顯示隨時間延長，腫瘤細胞內的端粒長度逐漸縮短。在蘇拉明處理過的動物體內，第一個兩周內，端粒信號減弱或消失的細胞比例保持在約10％的對照組水平；在第三周升高到40％的細胞，第四周為75％，第五周超過80％，第六周95％。在使用生理鹽水處理的對照動物體內細胞未觀察到變化。結論蘇拉明能夠有效地縮短體內所生長腫瘤的端粒長度。實施例3PPS是有效的端粒酶抑制劑PPS抑制端粒酶研究了暴露于PPS后FaDu細胞內端粒酶活性的抑制。處理方法使用PPS的處理在允許培養瓶內的細胞接觸生長界面之后開始。試驗當天，將培養基移出，用含有抑制劑的培養基置換。所用藥物濃度分別是0，0.1，1，5，10，50微摩的PPS。使用改良的定量TRAP分析對端粒酶活性進行測定。對端粒酶活性的影響在FaDu及SKOV-3細胞中端粒酶活性被PPS抑制，并有濃度依賴性。導致50％抑制的濃度分別為0.56和0.60微克/毫升。導致80％抑制的濃度對于兩種細胞均為小于10微克/毫升。導致90％抑制的濃度對于兩種細胞均為小于100微克/毫升。結論PPS能夠有效的抑制細胞內的端粒酶活性。產生50％端粒酶活性抑制的濃度低于抗凝所需濃度(約1微克/毫升)。實施例4hTR-反義體抑制端粒酶反義體研究包括下述兩個步驟(a)建立對人端粒酶RNA部分的有義體及反義體；(b)用hTR-反義體(或者hTR-有義體對照)穩定轉染細胞，以及(c)確定hTR-反義體抑制端粒酶活性以及誘導縮短端粒的能力。方法在現有技術如Mo等，CancerRes.2003.等中有詳述。反義和有義構建體制備人類端粒酶RNA部分的有義體及反義體表達質粒。下面給出185堿基對的有義體及反義體序列，其與GenBank序列(登錄號NR001566)一致。上述處理可以得到含有hTR片段的5種克隆。序列分析表明，一種克隆為有義體，另外四種均為反義體。將這些hTR有義體及反義體表達質粒轉染入人類因FaDu癌癥細胞。轉染方法反義構建體的轉染采用IPTG-可誘導型哺乳動物表達系統。所得克隆用于實驗。hTR-反義體對細胞生長的影響表2總結了結果，所述結果顯示與未用反義體轉染的、未經轉染但經IPTG處理的、由有義體轉染并經IPTG處理的或轉染了反義體但未經IPTG介導的細胞(即對照，+IPTG，+有義體+IPTG，及反義體)相比，反義體+IPTG細胞(即經hTR-反義體轉染，又經IPTG處理以誘導hTR表達的細胞)生長速度較慢。hTR-反義體對紫杉醇細胞毒作用的影響研究兩種穩定的hTR-反義體轉染的細胞克隆。紫杉醇的細胞毒作用采用SRB方法進行定量測定，所述方法對細胞蛋白總量進行測定。經hTR-反義體轉染的細胞使用IPTG處理44(克隆#1)至57(克隆#2)天，再用紫杉醇處理96小時。表2中總結了所得結果，顯示hTR-反義體可抑制端粒酶活性；從反義體轉染的轉染細胞中紫杉醇的IC50較其它對照組細胞的IC50減小，可以看出在兩個克隆中hTR-反義體均可使紫杉醇的細胞毒性作用增強約兩倍。表2hTR反義體對細胞生長、紫杉醇細胞毒性、端粒長度以及端粒酶活性的影響185bp反義hTR序列5′；1cagctgacattttttgtttgctctagaatgaacggtggaaggcggcaggccgaggctttt61ccgcccgctgaaagtcagcgagaaaaacagcgcgcggggagcaaaagcacggcgcctacg121cccttctcagttagggttagacaaaaaatggccaccacccctcccaggcccaccctccgc181aaccc3’185bp有義hTR序列5’1gggttgcggagggtgggcctgggaggggtggtggccattttttgtctaaccctaactgag61aagggcgtaggcgccgtgcttttgctccccgcgcgctgtttttctcgctgactttcagcg121ggcggaaaagcctcggcctgccgccttccaccgttcattctagagcaaacaaaaaatgtc181agctg3’hTR反義體對端粒長度及端粒酶活性的影響采用TALA方法對端粒長度(即末端限制性片段)進行測定。采用改良的TRAP方法對端粒酶活性進行測定。表2中總結的結果表明，hTR反義體可以減少端粒長度及減低端粒酶活性。結論總而言之，這些結果表明采用hTR-反義體對人類腫瘤細胞進行處理，可以抑制端粒酶活性、損失端粒、抑制細胞生長及增強紫杉醇的細胞毒作用。實施例5使用端粒酶抑制量的蘇拉明可使動物體內的腫瘤體積減小在某些動物中使用低劑量蘇拉明后出現腫瘤體積的減小測定移植了FaDu腫瘤的免疫抑制的小鼠中低劑量蘇拉明對于腫瘤體積的影響。處理方法在免疫抑制的小鼠的大腿區經皮下注射植入5×105FaDu細胞。蘇拉明(10毫克/千克)經腹腔注射給藥，每周兩次共6周。腫瘤細胞接種當日開始給藥蘇拉明。處理將注射用的蘇拉明溶液改為生理鹽水，對于對照組動物的其他處理完全一致。每周兩次觀察腫瘤大小。低劑量蘇拉明對腫瘤生長的影響6只動物接受了蘇拉明治療。在5只動物中，腫瘤體積隨時間增大。另外一只中的腫瘤起初仍生長，2周后達4毫米，之后逐漸減小，于第六周完全消失。結論經長時間的端粒酶抑制劑蘇拉明處理，可使得某些宿主體內的腫瘤完全消失。實施例6使用低劑量蘇拉明進行預處理，可以增強負瘤動物中化學治療的抗瘤活性本例描述經端粒酶抑制劑的延長預處理后化療劑的抗瘤作用增強。端粒酶抑制劑的處理在瘤負荷尚低不能觸及時就開始，與微小或不可檢出的腫瘤的情況相似。處理方法在6-8周齡的雌性無胸腺裸鼠大腿區經皮下注射5×105有活力的FaDu細胞。蘇拉明(10毫克/千克)則經腹腔注射給藥，每周兩次共6周。腫瘤細胞接種當日、腫瘤非常小時(代表微小病變(minimaldisease))，開始給藥蘇拉明。除了將注射溶劑由蘇拉明溶液改為生理鹽水，對于對照動物的其他處理完全一致。6周預處理期后，中斷蘇拉明處理，所有動物均接受每周兩次的10毫克/千克紫杉醇治療，共三周。在紫杉醇治療的三周內每周兩次觀察并記錄腫瘤大小。低劑量蘇拉明預處理的作用如表3中所示，用鹽水預處理6周的對照組動物，在3周后顯示腫瘤體積增大，而接受蘇拉明預處理的動物則出現腫瘤體積縮小。表3在使用紫杉醇進行治療的鼠體內蘇拉明預處理對腫瘤體積的影響實施例7維持低、端粒酶抑制性濃度的蘇拉明可以促進腫瘤縮小、延緩腫瘤生長、延長人類癌癥患者的生存期患有病理確診的、進展期、轉移性、分期為IIIB、IIV期的非小細胞肺癌的人類患者，使用紫杉醇、卡鉑及蘇拉明進行治療。治療每三周給予一次。蘇拉明的負荷(load)劑量為約240毫克/平方米，后面的劑量申請人研發的數學等式計算(PCT專利號PCT/US02/30210)。這些蘇拉明劑量使得至少21天后血漿濃度達到約2至約90毫摩。如實施例1中所示，這些濃度足以抑制端粒酶。共54名患者接受了治療。首先接受治療的6位患者接受了單劑量蘇拉明治療，其他患者接受了間隔24小時的分開劑量的治療。未發現使用蘇拉明引起的任何毒性。49名患者的數據可評估。總反應率為40.8％(包括6％完全反應，對應無可檢測的腫瘤；34.8％部分反應，對應腫瘤縮小至少50％)疾病進展時間(timetodiseaseprogression)(TTP)超過6個月，中位生存時間(mediansurvivaltime)(MST)超過12個月(Villalona-Calero，etal.，Clin.CancerRes.，93303-3311，2003；Villalona-Calero，etal.，MSLCMeeting，Vancouver，August，2003)。這些臨床試驗結果與在患有進展期、轉移性、IIIB/IV期非小細胞肺癌的相似患者中，對紫杉醇/卡鉑進行的前期臨床試驗結果的比較顯示，加入蘇拉明可使紫杉醇/卡鉑的抗腫瘤活性有明顯的提高。例如，近期完成的290名患者的實驗顯示，總體反應率為約17％(僅有＜1％的患者獲得了完全的反應)，TTP為3.1個月，MST為8.1個月(Schilleretal.，NewEngJMed，34692-98，2002)。結論長期(如12到30周)保持端粒酶抑制性蘇拉明血漿濃度，能夠增強紫杉醇及卡鉑的抗腫瘤活性，提高反應率，延緩腫瘤進展、延長人類癌癥患者的生存期。實施例8蘇拉明在狗體內的血漿半衰期較長狗體內的蘇拉明藥代動力學使用四只比格犬(beaeledog)對蘇拉明的血漿藥代動力學進行研究。處理方法使用四只比格犬，體重為11.4±0.4千克。在動物兩前腿的頭靜脈中插管。將6.75毫克/千克蘇拉明在30分鐘內經靜脈輸注入一側靜脈，從另一側靜脈抽取血樣。蘇拉明以蘇拉明鈉鹽水溶液的形式給藥。在5分鐘、30分鐘、1，2，4，6，9，12，24，48及72小時、7、14及21天時抽取血樣，注入肝素化的管內，離心制備血漿。用高效液相色譜法測定蘇拉明的血漿濃度，前面已有詳述(Kassack，etal.，JChromatogr.BBiomed.Appl.，686275-284，1996)。以標準方式進行無隔室(Non-compartmental)藥代動力學分析(Gibaldi，etal.，Pharmacokinetics.，1982)。結果在狗體內，蘇拉明消除緩慢，總清除率為2.1±0.2毫升/小時/千克，最終半衰期為13.0±3.8天。結論蘇拉明在狗體內消除緩慢，其消除半衰期格外長，達13天。實施例9PPS增強了化療的抗腫瘤活性本實施例教導第二種端粒酶抑制劑聚戊糖多聚硫酸酯(PPS)，其增強了細胞毒藥物在培養的腫瘤細胞及腫瘤患者的原代培養物中的抗腫瘤活性。PPS的化療有義體化效應發生在端粒酶抑制性濃度為10至100微克/毫升之間時，分別低于產生抗腫瘤活性的PPS濃度的＞10倍和＞100倍。(Wellstein等，J.Natl.CancerInst.，83716-720，1991；Zugmaier，等，Ann.NYAcad.Sciences，886243-248，1999)。使用兩種腎細胞癌細胞(RCC45和RCC54)進行研究。5-氟尿嘧啶(fluorouracil)作為化療藥物。細胞經5-氟尿嘧啶合并或不合并PPS處理96小時，使用ELISA測定藥效，其作為摻入DNA前體(溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine)，BrdU)的抑制作用。結果顯示PPS在10至100克/毫升無細胞毒性；作為單一藥物，PPS的IC50為1,400克/毫升。表4顯示了5-氟尿嘧啶的IC50值(即產生50％抑制的藥物濃度)隨PPS的加入而減低。表4的結果還顯示加入端粒酶抑制濃度的第二種端粒酶抑制劑蘇拉明(30微摩)，能進一步減低5-氟尿嘧啶的IC50，這說明端粒酶抑制劑的化療增敏作用是可相加的。表4非毒性濃度的PPS增強5氟尿嘧啶的活性實施例10非常低濃度的端粒酶抑制劑AZT增強了化療藥物的體內抗腫瘤作用本實施例描述了在攜帶人頭和頸部癌癥FaDu異種移植物的免疫缺陷的小鼠體內，端粒酶抑制劑AZT對化療藥物(例如紫杉醇)抗腫瘤作用的增強作用。在攜帶人頭和頸部癌癥FaDu異種移植物的免疫缺陷的小鼠(雄性Balb/cnu/nu小鼠，6-8周齡)體內，在有或沒有AZT的情況下，評估紫杉醇的活性，異種移植物的形成如下在左、右側肋壁區經皮下注射0.1毫升生理鹽水中的106有活力的腫瘤細胞，生長約14天后于藥物治療開始前腫瘤大小超過15mm3。四個治療組是鹽水對照組、AZT組、紫杉醇組、紫杉醇+AZT組。對鹽水對照組連續5天每天注射鹽水200微升；紫杉醇組連續5天每天注射溶于Cremophor及乙醇中的10毫克/千克紫杉醇(即Taxol)200微升；AZT組經皮下埋植的Alzet微型泵以速度200納克/小時接受7天AZT輸注。紫杉醇+AZT組接受紫杉醇組及AZT組的組合治療，其中AZT的輸注較紫杉醇注射提前開始一天。紫杉醇治療開始后第1、3、6、8及10天測定動物體重及腫瘤大小。藥物治療的抗腫瘤效果有以下三種方法進行測定。第一種是測定腫瘤體積的縮小。腫瘤體積測定首先通過制備Jeltrate突出(protruding)腫瘤模型(mold)(這種模型成型迅速)，之后制備并稱重恢復模型(countermold)。其次，測定細胞凋亡效應。第10天，將動物安樂死，獲得腫瘤標本并將其浸泡于福爾馬林中。制作5微米厚的組織切片并用蘇木精和伊紅進行染色。對腫瘤切片進行形態學評價，評估腫瘤細胞密度以及凋亡細胞密度。由于凋亡細胞隨時間消失，所以非凋亡細胞的密度可以作為細胞凋亡的第二指標。細胞密度通過使用圖像分析法，在隨機選定四個400倍放大的顯微鏡視野中計數細胞數目來測定(Song，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，978658-8663，2000)。第三，測定藥物延長存活時間的能力。監測動物100天后或指導瀕死狀態(moribundity)(指腫瘤長度超過10厘米)。AZT的血漿濃度在平行試驗中測定，使用在皮下植入Alzet1002滲透性微型泵的三只小鼠。藥物的注入在采集動物血樣前進行四天。這樣的長時間輸注保證獲得恒定的穩定狀態蘇拉明血漿濃度。采用可購得的ELISA分析法測定AZT血漿濃度(Neogen，Lexington，KY)。表五中總結的結果顯示，AZT增強了紫杉醇的體內抗腫瘤效果，首先，AZT和紫杉醇的組合治療使得在10天的隨訪期中腫瘤體積減小，而在對照組、紫杉醇組、AZT組則觀察到了高至4倍的腫瘤體積的增加。第十天時，接受紫杉醇和AZT聯合治療的動物體的腫瘤體積明顯小于其他所有劑量組的(p＜0.001，ANOVA、重復測定)。第二，腫瘤形態的評價顯示，接受紫杉醇和AZT聯合治療的動物，其腫瘤的凋亡細胞密度高于其他劑量組2-4倍，非凋亡細胞的密度低于其他劑量組2.6-4倍。第三，生存(survival)時間分析(KaplanMeier分析)，顯示達瀕死狀態的中位時間對于對照組及AZT組而言為21-26天，而對于紫杉醇組增加到了42天和對于聯合治療組為49天。紫杉醇組無腫瘤的存活者，而聯合治療組有兩例無腫瘤的存活者(2/12，16％)。接受紫杉醇和AZT聯合治療的組的生存率在統計學上明顯高于所有其他組(p＜0.01，對數秩(logrank)檢驗)。單一藥物(紫杉醇或AZT)的治療產生最小毒性，無毒性相關死亡發生，與治療前體重比較體重減輕幅度最小(＜3％)。在紫杉醇中加入AZT不會加重體重的減輕，提示AZT不會增加紫杉醇的宿主毒性。采用ELISA法測定的AZT血漿濃度為9.6納摩。該濃度明顯低于抑制端粒酶所需濃度(FaDu細胞中2微摩，見表1)或誘發細胞毒性所需的濃度(20微摩FaDu細胞；Mo等，CancerRes.63579-585，2003)。本研究的結果令人吃驚。表5AZT對紫杉醇抗腫瘤作用的強化作用ap＜0.05與對照組和AZT組比較bp＜0.05與所有其他組比較。c數據表示四組獨立試驗的平均值±SD。細胞密度及凋亡水平利用在圖像分析以每個腫瘤4個隨機連續區域進行測定。結論結果顯示使用可得到納摩級AZT血漿濃度的極低AZT劑量進行治療，可增強化療的抗腫瘤活性。實施例11給藥端粒酶抑制量的AZT可以導致動物體內的腫瘤體積縮小動物體內的腫瘤體積在給藥AZT后減小使用移植了FaDu細胞的免疫抑制的小鼠測定重復給藥單一藥物AZT對腫瘤體積的影響。處理方法在免疫缺陷的小鼠兩側肋腹區經皮下注射106FaDu細胞/一側肋腹。采用Alzet滲透性微型泵通過連續皮下輸注給藥AZT，給藥速度為5微克/小鼠/天。該AZT劑量導致約10納克/毫升的穩定血漿濃度。接種后14天開始給藥AZT，持續14天。對于對照組動物，將注射的蘇拉明溶液改為生理鹽水，其他處理完全一致。每周兩次觀察腫瘤體積。AZT治療對腫瘤生長的作用所有16只移植有腫瘤細胞的動物在接受AZT治療前均顯示有可測定的腫瘤。其中的2只動物中，腫瘤在開始接受AZT治療時停止生長，隨后體積逐漸減小。第38天腫瘤已不可觸及，第59天尸檢證實腫瘤完全消失。這兩只動物初始腫瘤平均體積為35立方毫米(范圍18-80立方毫米)，與其余動物中的腫瘤體積相似。結論長期使用可得到納摩級血漿濃度的低劑量單藥物AZT(端粒酶抑制劑)治療，可以使得腫瘤完全消失。實施例12預期端粒酶抑制治療聯合腫瘤體積-縮小治療可改進治療效果本實施例顯示了當將細胞減滅治療與長期使用端粒酶抑制劑聯合應用時，細胞減滅治療的抗腫瘤效果的預期強化。端粒酶抑制劑的使用可以在細胞減滅之前、與細胞減滅同時或在細胞減滅完成之后進行。使用端粒酶抑制劑的長期治療與細胞減滅治療聯用的效果為了使端粒酶抑制劑能夠有效地抑制細胞增殖，或誘導凋亡及細胞衰老，宿主體內的腫瘤負荷必須較小，使得在端粒酶抑制劑削減端粒長度至抑制增殖及誘導凋亡和細胞衰老的臨界水平以下前，腫瘤負荷不會達到致死水平。這可通過采用細胞減滅治療實現。因此，如果某種形式的細胞減滅治療與長期的端粒酶活性抑制聯合應用，那么腫瘤細胞內的端粒長度將隨時間縮短，最終誘導細胞凋亡或細胞衰老。處理方法其最佳治療方法為某種形式的細胞減滅性治療的癌癥患者，將接受所選細胞減滅治療。為個體患者所選的細胞減滅治療取決于患者的癌癥、健康狀況、年齡、以前的治療史以及在治療方案中通常考慮的其他因素。當細胞減滅性治療方案完成后，如果認為患者仍然未治愈或疾病可能復發，則患者將接受利用端粒酶抑制劑的繼續治療，所述繼續治療所用劑量足以誘發端粒酶抑制效應。繼續治療的療程應持續至少2周，優選長于2月，或更優選長于6個月，或更優選直至認為所述患者痊愈。優選這樣的可選治療方案，其中端粒酶抑制劑治療在細胞減滅治療前開始或與其同時開始，并持續至細胞減滅治療完成后，這是由于能使腫瘤暴露于端粒酶抑制作用較長一段時間。結論預期將端粒酶抑制治療與常規細胞減滅性治療聯合使用，可使得端粒酶抑制治療更為有效，也將解決長期存在的一個問題，就是優先利用端粒酶抑制作用來治療腫瘤患者的方法。實施例13局部給藥蘇拉明可導致目標靶器官內而非血漿內的端粒酶抑制性濃度本實施例描述局部給藥端粒酶抑制劑，可實現在靶組織或器官內達到端粒酶抑制性濃度，而在血漿中存在低且無效的端粒酶抑制性濃度。區域性遞送后的蘇拉明膀胱壁及系統濃度將蘇拉明溶液緩慢滴入狗的膀胱腔內，并對作為與膀胱腔的距離之函數的膀胱壁濃度(bladderwallconcentrationsasafunctiondistancefromthebladdercavity)，及系統性血漿濃度進行研究。處理方法使用體重9.0±0.4千克的5只比格犬。在動物的頭靜脈中插管用于給藥麻醉劑，在頸靜脈中插管用于取血樣。插入尿道導管用于定量滴注(doseinstillation)和膀胱內容物取樣。經膀胱內給藥動物蘇拉明水溶液(20毫升水含有6毫克/毫升蘇拉明)。間斷120分鐘頻繁抽查膀胱內容物及系統性血漿中的濃度(concentrationsofthebladdercontentsandsystemicplasmaweresampledatfrequentintervalsfor120minutes)，此時處死動物并收集膀胱組織。表面積約2厘米x2厘米的組織切片取自膀胱壁，在干冰冷卻的不銹鋼平盤(flatstainlesssteelplate)內快速冰凍。對組織樣品的外緣進行修整，以免被滴注液污染，將冰凍組織塊切成與尿道上皮表面平行的40微米切片。利用HPLC分析測定組織層、血漿及膀胱內容物中的蘇拉明濃度。結果對于經膀胱內接受蘇拉明6毫克/毫升的動物，膀胱內容物中的濃度從0分鐘時的6毫克/毫升降低到120分鐘時的3.6毫克/毫升。所有時點的血漿濃度均低于0.1微克/毫升。膀胱壁組織內的藥物濃度自尿道表面(0毫米)到漿膜表面(4-5毫米)逐漸遞減。0毫米處的組織濃度大約為約80微克/克，以對數-線性(log-linear)模式遞減直至約2毫米處，在該處的濃度達到約3微克/克。在膀胱壁殘余物中的濃度顯示濃度幾乎不隨深度變化，約為3微克/克。結論這些結果顯示在器官內區域性給藥可提供在目的器官或組織內的端粒酶抑制性的藥物濃度，而系統性血漿濃度則低很多倍，不足以產生端粒酶抑制性效應。實施例14細胞培養系統細胞培養分析試驗對人前列腺PC3腫瘤細胞、人乳腺MCF7細胞或人咽FaDu細胞進行。如果本文三種細胞中的任何一種符合本發明的需要，端粒酶抑制劑的選擇和劑量適合用于本發明。優選使用PC3細胞。人類前列腺PC3腫瘤細胞、乳腺MCF7細胞或咽FaDu細胞可自美國通常培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得。這三種細胞系的倍增時間均為大約24小時。所有三種細胞系應作為單層培養于含5％CO2、95％空氣的潮濕環境、37℃中。PC3細胞應保持在RPMI1640培養基中；MCF7細胞保持在RPMI1640或者極限必需培養基(MEM)中；FaDu細胞保持在MEM中。所有培養基應補充有9％熱滅活的胎牛血清、2毫摩1-谷氨酰胺、0.1％10毫摩非必需氨基酸、90微克/毫升慶大霉素以及90微克/毫升頭孢噻肟鈉(cefotaximesodium)。使用胰蛋白酶從亞滿底的培養物收獲細胞，于鋪板前再懸于新鮮培養基中。根據錐蟲藍排除法(trypanblueexclusion)，存活力＞90％的細胞被用于評價端粒酶抑制劑如蘇拉明的細胞毒作用。細胞鋪于96孔板，密度使得在藥物治療階段末期不能達到滿底。通過在無藥物培養基中20-24小時允許細胞附著于所述板的表面。之后，將細胞與含有FGF拮抗劑(一個實施例使用0.2毫升蘇拉明)的培養基一同保溫，所述FGF拮抗劑的濃度跨至少在4個對數范圍(spanningatleast4logscales)。將藥效測定為對BrdU摻入的抑制，例如可依據CellProliferationELISABrdU(BoehringerMannheim)。結論本發明參照各種實施方案描述并以其舉例說明，本領域技術人員會發現可以做各種改進，其成分可以使用其等價物替代，而不偏離本發明的范圍。另外，可根據本發明的教導進行多種修飾以適于具體情況或材料而不偏離本發明的基本范圍。利用用常規實驗，本領域技術人員將認識到或能夠肯定本發明具體描述的具體實施方案的許多等同物。所述等同物包含在權利要求的范圍內。因此，本發明并非意圖限與作為實施本發明的最佳方式的具體實施方案，但本發明將包括所有落入權利要求范圍內的實施方案。在本申請中，所有單位均為米系統，所有量和百分比都通過重量表示，除非另有說明。同時，本申請所引用的所有文獻都包含在本文中作為參考。中的除非另外說明，僅使用常規的試驗方法，這里特別敘述的很多本發明特殊應用實施例的等價物。這些等價物均包含在后述的權利聲明范圍中。因此，需要強調的是本發明并不限制于那些作為最佳實踐本發明預期的方式的一些特殊，在本申請中，所有單位使用的是米系統，所有計數及百分比均為權重。并且，這里的所有引用后均列有參考文獻出處。參考文獻·美國專利5,116,823·美國專利5,489,508.·美國專利5,597,830.·美國專利5,656,638.·美國專利5,760,062.·美國專利5,767,110.·美國專利5,767,278.·美國專利5,770,613·美國專利5,863,936.·美國專利6,452,014·WO專利9323572.·WO專利9738013A·Ahmann，F.R.，J.Schwartz，R.Dorr，andS.Salmon，SuramininhormoneresistantmetastaticprostaticcancerSignificantanticanceractivitybutunanticipatedtoxicity.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，10，178，1991.·Armand，J.P.，M.Bonnay，D.Gandia，E.Cvitkovic，F.DeBraud，F.Bertheault，J.P.Droz，P.Carde，M.Schlumberger，andD.Fourcault，PhaseI-IIsuramin(SRM)studyinadvancedcancerpatients.(abstract)，Proc.Am.Assoc.CancerRes.，32，175，1991.·Armitage，J.O.，D.D.Weisenburger，M.Hutchins，D.F.Moravec，M.Dowling，S.Sorensen，J.Mailliard，J.Okerbloom，P.S.Johnson，D.Howe，andetal.，Chemotherapyfordiffuselarge-celllymphoma-rapidlyrespondingpatientshavemoredurableremissions.，JClin.Oncol.，4，160-164，1986.·Burger，A.M.，J.A.Double，andD.R.Newell，Inhibitionoftelomeraseactivitybycisplatininhumantesticularcancercells..EurJCancer，33.638-644，1997.·Clark，J.，W.Sikov，F.Cumings，M.Browne，W.Akerley，H.Wanebo，A.Weitberg，T.Kennedy，B.Cole，J.Bigley，J.Beitz，andJ.Darnowski，PhaseIIstudyof5-fluoruracilleucovorinandazidothymidineinpatientswithmetastaticcolorectalcancer.，JCancerRes.Clin.Oncol.，122，554-558，1996.·DeClercq，E.，SuraminApotentinhibitorofthereversetranscriptaseofRNAtumorviruses.，CancerLetters.8，9-22，1979.·Dimri，C.P.，Lee，X.，Basile，G.，Acosta，M.，Scott，G.，Roskelley，C.，Medrano，E.E.，Linskens，M.，Rubeli，I.，Pereira-Smith，O.，andPeacocke，M.Abiomarkerthatidentifiessenescenthumance¨sincultureandinagingskininvivo.Proc.Natl.Acad.USA.，929363-9367，1995.·Dreicer，R.，D.C.Smith，R.D.Williams，andW.A.See，PhaseIItrialofsuramininpatiertswithmetastaticrenalcellcarcinoma.，Invest.NewDrugs，17，183-189，1999.·Eisenberger，M.A.andL.M.Reyno，Suramin，CancerTreatRav.，20，259-273，1994.·Falcone，A.，A.Antonuzzo，R.Danesi，G.Allegrini，L.Monica，E.Pfanner，G.Masi，S.Ricci，M.DelTacca，andP，F.Conte，Suraminincombinationwithweeklyepirubicinforpatientswithadvancedhormone-refractoryprostatecarcinoma.，Cancer，86，470-476，1999.·Falcone，A.，E.Pfanner，I.Brunetti，G.Allegrini，M.Lencioni，C.Galli，G.Masi，R.Danesi，A.Antonuzzo，M.DelTacca，andP.F.Conte，Suraminincombinati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制量的端粒酶抑制劑來治療患有腫瘤的癌癥患者的治療后果的方法，包括有以下步驟(a)獲得所述腫瘤的樣本；(b)對所述腫瘤樣本進行末端限制片段(TRF)分析以確定末端片段的長度，所述末端片段含有樣本中細胞的端粒DNA；以及(c)使端粒DNA長度與使用端粒酶抑制量的端粒酶抑制劑治療癌癥患者所需的時間長度相關，其中所述端粒酶抑制劑是蘇拉明、可藥用的蘇拉明鹽、戊聚糖多聚硫酸酯(PPS)、可藥用的PPS鹽、hTR-反義體轉染物中的一種或多種。53.權利要求52的方法，其中所述患者為哺乳動物。54.確定使用端粒酶抑制量的端粒酶抑制劑治療患腫瘤的癌癥患者的治療效力的方法，包括以下步驟(a)獲得所述腫瘤的樣本；(b)對所述腫瘤樣本進行末端限制片段(TRF)分析以確定末端片段的長度，所述末端片段含有樣本中細胞的端粒DNA的；以及(c)使端粒DNA的長度與所述治療的時程相關。55.權利要求54的方法，其中所述患者為哺乳動物。56.改進間質性膀胱炎患者的治療后果的方法，包括以下步驟對所述患者局部給藥有效量的下述一種或多種藥物蘇拉明、可藥用的蘇拉明鹽、戊聚糖多聚硫酸酯(PPS)、可藥用的PPS鹽。全文摘要本發明提供了用于抑制端粒酶活性的方法、組合物，以及由端粒酶介導疾病或病癥的治療。在由端粒酶活性介導的疾病或病癥如癌癥的治療中，本發明的方法、合成物及本發明的組合物可以單獨使用，也可以與其他有藥理活性的藥物、外科手術或放射治療聯用。文檔編號A61K48/00GK1768075SQ200480009121公開日2006年5月3日申請日期2004年1月30日優先權日2003年1月31日發明者杰西·L·S·奧,M·吉爾勞姆·溫特杰斯申請人:杰西·L·S·奧,M·吉爾勞姆·溫特杰斯