新穎的多能性干細胞及其用途的制作方法

專利名稱：新穎的多能性干細胞及其用途的制作方法
技術領域：
本發明是有關于分離的骨髓干細胞(BMSCs)，其在受選細胞中具有無法偵測的含量或低含量。重要的是該細胞為多能性(multipotent)且可用于產生各種期望的細胞類型。本發明具有廣泛的實用性應用，包括應用于心血管疾病的預防與治療。
背景技術：
逐漸意識到充血性心力衰竭(CHF)是為一種日益增加且廣布于世界各地的疾病，已有報告指出某些病因，例如，心肌梗塞(MI)所造成的不可逆傷害。
梗塞面積是為充血性心力衰竭發病率與致死率的主因。舉例而言，影響左心室(LV)40％或40％以上的梗塞面積通常與難治愈的心因性休克與病程發展迅速的充血性心力衰竭有關。心肌具有有限的自我修復或再生的能力，與肌肉不可逆的損失，以及伴隨收縮與心肌瘢痕的纖維化，該為已熟知的原則，是在一連串的事件中占有一席的地，意即非缺血性心肌的漸進式心室重建(progressive ventricular remodeling)，最后導致漸近式心力衰竭(HF)。
已努力朝更了解心力衰竭的方向著手，舉例而言，心肌細胞(CMC)損失的幸存暗示被認為與心力衰竭有關。此項給予設法治療上一些重要性暗示，即在心力衰竭病程期間幫助維持可生存的心肌細胞。目前，臨床所使用的醫藥與手段并未顯示在以有功能的收縮性組織置換心肌瘢痕的功效。因此，有鑒于與心肌梗塞和心力衰竭相關的主要發病率與致死率，新穎的方法已在找尋該病癥的主要病理性缺陷，例如，血管與心肌細胞的損失。
眾所皆知特定組織干細胞(tissue specific stem cell)僅能分化成起源組織的細胞。然而，逐漸意識到至少某些成人的特定組織干細胞可分化成不同于起源組織的株系，該可塑性(plasticity)被認為是轉分化(trans-differentiation)。骨髓細胞被發現具有再生許多非造血組織(例如神經外胚層細胞、骨胳肌細胞、心肌細胞、內皮細胞、肝管與膽管的內皮細胞，及肺、消化道與皮膚內皮細胞)的能力。近年來，涉及多能性成人祖細胞(MAPCs)的骨髓細胞(BM)所衍生的所有干細胞已經以骨髓間質細胞(MSCs)共純化。MAPCs被認為廣泛地增殖，且分化成全部三種胚層細胞。
已企圖將骨髓細胞所衍生的干細胞做治療性的應用。研究顯示將轉植成缺血性心肌層的內皮祖細胞(EPC)、血管細胞(angioblast)、或CD34(+)細胞納入至新生血管的病灶，并且對心肌梗塞(MI)后的左心室(LV)的功能具有有利的影響。在其它研究中已證明出有愈來愈多各方面功能的骨髓所衍生的造血干細胞(HSCs)。
被發掘可用在心臟再生的成人干細胞的其它來源為非造血性間葉(mesenchymal)干細胞(或骨髓間質細胞，MSCs)。骨髓間質細胞可衍生自成人骨髓，并具有分化成多株系的能力。在細胞培養中，骨髓間質細胞在超過許多世代仍可維持在一個不分化且穩定的表現型(phenotype)。在具有心肌梗塞的動物模型中，亦證明出鼠、牛及人類的骨髓間質細胞可進行心肌增生(cardiomyogenic)的分化。
雖然已有報告指出衍生自骨髓的間質細胞具有使心肌組織再生的功能，但是對于該未成熟細胞是具有許多臨床功能仍不明確。
舉例而言，當有愈來愈多的證據顯示骨髓包含具有可塑性細胞群，這并無法確定來自單一細胞階段的高度未分化間質細胞的分離或增殖是否成功。間質細胞的純系增殖做為增強治療的可靠度與功效而言相當重要。再者，過去企圖培養一些骨髓細胞(例如，多能性成人祖細胞)，需要以增殖性細胞激素處理使其減少對臨床使用的吸引力。更重要地，多能性成人祖細胞已顯示在注入至囊胚后有最小移植至心肌的能力。有些骨髓細胞(例如，Lin-c-KIT+細胞或血管細胞)已顯示具有使活體內分化成心肌組織的重要組群再生的能力。然而，該細胞相當烯少且欠缺已被接受的培養方法。
特別在治療應用上，有關使用骨髓細胞的其它缺點。舉例而言，在受傷的心肌模型中并未建立是否單一人類骨髓細胞參與新生血管與心肌增生。尚未使用人類的多能性干細胞來證實骨髓細胞的分化。藉由免疫組織化學染色法(immunohistochemical staining)利用多能性干細胞的研究證明分化成心肌增生的表現型，然而經合并細胞的數量并不多，且型態上的特征與成熟的心肌細胞不同。
因此，該與其它的缺點限制了骨髓細胞作為可預防、治療或降低與心臟疾病(例如心肌梗塞)相關病癥嚴重性的來源的應用。
期望能有適合在組織培養中分離與維持以作為克隆分離物技術的骨髓細胞。尤其期望是否有該骨髓細胞可維持以作為多能性純系，特別是作為用于至少一種(優選為內皮細胞、骨胳肌細胞與心肌細胞全部三種)的來源。甚至更期望是否可將該骨髓細胞轉植至患病或受傷的心肌組織，以有助于預防、治療或降低相關的病癥。

發明內容
我們發現可從一種或僅少數種的骨髓細胞培養(增殖(expanded))一種新種類的多能性骨髓干細胞(BMSCs)。優選的多能性骨髓干細胞可長時期的增殖，與至少分化為三種株系的能力。來自多能性骨髓干細胞的該細胞的形成可受控制，并可用于提供一種非受限多能性來源的分化細胞與組織(包括移植物)。本發明具有廣泛的重要應用，包括涉及多能性骨髓干細胞(或其所衍生的細胞)移植至需要該治療的接受體。
更特而言的，我們已經從骨髓分離出一種新穎的多能性(即可塑性)干細胞群，可在細胞培養中增殖而不需要可偵測的標記物，或用于至少約50群體倍增(population doublings)的可塑性的損失，更典型為至少約100群體倍增，通常約140群體倍增或更多。一方面，我們發現從人類骨髓以無性生殖的方式所增殖的多能性骨髓干細胞(亦稱為hBMSCs)不屬于習知的由骨髓所衍生的干細胞群，例如造血干細胞、間質干細胞或多能性成人祖細胞(例如內皮祖細胞)。重要地，本發明優選的多能性骨髓干細胞當其在合適的限制條件期間，具有分化成至少三種分化細胞類型的能力，特別是內皮細胞、骨胳肌細胞與心肌細胞。在此具體實施例中，本發明為適當地提供一種所需要的非受限多能性來源的分化細胞與組織(包括移植物)，例如，用以預防、治療或降低罹患與心血管疾病相關的病癥(包括與梗塞相關的病癥)。
因此，一方面，本發明提供一種骨髓干細胞的分離株，是通過標準細胞標記檢測分析法予以測定具有下列至少一種無法檢測到的或低水平的細胞標記物及優選為具有所有下列細胞標記物標記物標記物優選標記物CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI類受體(MHC class Ireceptor)與MHC II類受體(MHC class II receptor)。
該骨髓干細胞(BMSC)具有重要的用途與優點。舉例而言，該骨髓干細胞有高的可塑性，以及可用來提供一種非受限多能性來源的細胞與組織以著手心血管疾病，尤其是被指示要以再生治療的心血管疾病。雖然曾企圖使用其它干細胞來著手此類疾病，但是相較于本文所述的骨髓干細胞，該細胞相對地有較小的可塑性。患病而要治療的病患可提供各種心血管細胞和組織。第一次，本發明著手提供此需要，骨髓干細胞可快速地轉變成為一種或多種心血管細胞，尤其是干細胞、平滑肌細胞、心肌細胞。從靈長目動物(例如人類病患，即hBMSC)分離出骨髓干細胞的具體實例中，該細胞可于活體外維持與/或治療(例如以一或多種有絲分裂素(mitogen))，以及放回(移植)至病患(或免疫上相關的個體，例如家族成員)以治療該心血管疾病。本發明的特征有助于降低病毒所引發的不必要感染的風險，例如，受體細胞的免疫排斥。或者/再者，該骨髓干細胞可從病患分離出，并于活體外處理(使用或不使用有絲分裂素)以產生組織移植物，特別是病患至少為同種異體(allogeneic)及優選為異體免疫兼容(syngeneic)的具體實例。與例而言，可使用該移植物以著手心血管疾病，其中需要相對大量的骨髓干細胞或其衍生的細胞。
本發明進一步提供產生本文所述的分離骨髓干細胞的方法(例如hBMSC)。在一具體實例中，該方法包括下列至少一步驟，及優選為下列全部步驟a)收集來自哺乳動物的骨髓干細胞，其細胞的尺寸小于約100微米，優選為小于約50微米，優選為約40微米或40微米以下，b)在為貼壁細胞(adherent cell)所選擇的條件下，將所收集的細胞于培養基中培養(增殖)，c)選擇貼壁細胞，并于培養基中增殖該細胞至半融合狀態(semi-vonfluency)，d)以調配好的培養基將該經培養的細胞進行連續稀釋(serial dilution)至孔室(chamber)中，該稀釋足以產生小于1細胞/孔室的密度，以使該經增殖的細胞為克隆分離物(clonal isolate)，e)將各克隆分離物進行培養(增殖)，以及選擇具有產生分離骨髓干細胞群的經增殖細胞的孔室。
在其它方面，本發明是提供包括本文所述的分離骨髓干細胞(例如，但不限于hBMSC)的組織或移植物，進一步提供一種包含該移植物的細胞、組織或器官的培養。
本發明的又其它方面，是提供用于預防、治療或降低心血管(心臟)疾病的嚴重性的方法。在一具體實例中，該方法包括對需要該治療的哺乳動物投予至少一種如本文所述的分離骨髓干細胞(例如，hBMSC)。優選地，該投予為足以預防、治療或降低哺乳動物中此類疾病的嚴重性。或者/再者，在可幫助提高該心臟疾病的條件下，該方法包括投予該哺乳動物至少一種本發明的移植物。
本發明進一步提供一種用于預防、治療或降低心臟疾病的嚴重性醫藥產物。在一具體實例中，該產物包括至少一種下述的成份如本文所述的分離骨髓干細胞群(例如，hBMSC)，及/或視需要用于分離該哺乳動物的細胞的說明書；本發明的移植物及/或視需要用于制備、維持與/或使用該移植物的說明書；本發明的細胞、組織或器官的培養，與/或視需要用于制備哺乳動物的細胞、組織或器官的說明書。
本發明亦提供藉由下列至少一步驟，及優選為下列全部步驟，以獲得分離的骨髓干細胞a)收集來自哺乳動物的骨髓干細胞，其細胞的尺寸小于約100微米，優選為小于約50微米，優選為約40微米或40微米以下，b)在為貼壁細胞所選擇的條件下，將所收集的細胞于培養基中培養(增殖)，
c)選擇貼壁細胞，并于培養基中增殖該細胞至半融合狀態，d)以調配好的培養基將該經培養的細胞進行連續稀釋至孔室中，該稀釋足以產生小于1細胞/孔室的密度，以使該經增殖的細胞為克隆分離物，e)將各克隆分離物進行培養(增殖)，以及選擇具有產生分離骨髓干細胞群的經增殖細胞的孔室。
本發明的其它特征、用途與優點如下所述。


第1A至1E圖顯示本發明的人類骨髓干細胞(hBMSC)的特征。
第2A至2D圖顯示hBMSC在活體外分化成內皮細胞(EC)與平滑肌細胞(SMC)株系。
第3A至3M圖顯示hBMSC在活體外分化成神經中樞與內胚層株系。
第4A至4X圖顯示hBMSC在活體外轉分化與融合成心肌細胞、內皮細胞(EC)與平滑肌細胞(SMC)。
第5A至5F圖顯示hBMSC的移植減低心肌梗塞鼠模型中有害的心臟重建。
第6A至6T圖顯示在心肌梗塞中經移植的hBMSC的移植與多株系分化。
第7A至7U圖顯示hBMSC的移植提高心肌細胞的分化，并降低心肌壞死。
第8A至8B圖顯示hBMSC的移植正調控血管新生細胞激素與心臟移植的mRNA的表現。
第9A至9L圖顯示hBMSC增加微血管與心肌細胞的密度，并增進心肌纖維化。
第10圖顯示使用多表面抗原決定位置(epitope)的FACS分析結果。
具體實施例方式
如上所討論，本發明是提供一種新穎的多能性骨髓干細胞分離株，是通過標準細胞標記檢測分析法予以測定具有下列至少一種無法檢測到的或低水平的細胞標記物及優選為具有所有下列細胞標記物標記物優選標記物CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHC I類受體(MHC class I receptor)與MHC II類受體(MHC class II receptor)。該標記物可藉由本文所指稱的標準細胞標記物偵測分析法予以快速測定。本發明的骨髓干細胞具有廣泛的重要用途，包括用于與心血管疾病相關病癥的預防、治療或緩解，尤其是與缺血(心肌缺血)、梗塞(心肌梗塞)、充血性心力衰竭(CHF)與冠狀動脈相關的跡象直接或間接相關的冠狀動脈疾病。
「標準細胞標記物偵測分析法」的術語意指設計用來偵測與視需要定量下述其中一種細胞標記物(即CD90、CD117、CD34等)的傳統免疫或分子分析法。該傳統免疫分析法的例子包括西方墨點法、ELISA與RIA。用在該分析法的優選抗體如下述所提供。一般來說請參見，Harlow andLane的AntibodiesALaboratory Manual，CSH Publications，N.Y.(1988)，用于揭示相關的該與其它合適的分析法。特定適用于該用途的分子分析法，包括利用本文所揭示的寡核酸引子的聚合鏈反應(PCR)型分析法(例如，請參見表1)。請參見WO92/07075是用于有關重組PCR與相關方法的一般性揭示。亦請參見Sambrook等人的Molecular CloningALaboratory Manual(第二版，1989)；以及Ausubel等人的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1989；是有關可用于偵測此細胞標記物的公認的免疫與分子分析法。
「分離」用于所涉及的骨髓干細胞意指從骨髓與其它自然伴隨骨髓的細胞取代物(substituent)中分離的細胞。優選地，本發明的骨髓干細胞為至少80％或90％至95％的純度(w/w)。骨髓干細胞，尤其是hBMSC在許多醫藥、臨床與研究應用上的最佳條件為具有至少98至99％的同構型(w/w)。一旦進行實質上的純化或分離，該骨髓干細胞將實質上不具有不想要的骨髓污染物。只要部分地純化或實質地純化，該骨髓干細胞將適合用于治療或其它如本文所述的用途。純化可藉由各種標準技術，例如細胞培養、顯微鏡與離心技術(例如Ficoll梯度)而予以測定。
可發現特別有關于分離與調節內皮細胞(ECs)的揭示，尤其是內皮祖細胞(EPCs)，例如美國專利案第5,980,887號與PCT-US99/05130(WO99/45775)。
術語「哺乳動物」意指靈長目動物、經馴養的動物，或其它哺乳動物，例如嚙齒類動物或兔類。優選的靈長目動物有黑猩猩、猴子或需要治療的人類病患。合適的經馴養的動物包括沙鼠、馬、狗、貓、山羊、綿羊、豬、雞等。優選的嚙齒類動物為大鼠或老鼠。優選的骨髓干細胞為從靈長目動物分離出，尤其是從需要心血管治療的人類個體分離出。
本發明的骨髓干細胞更特指如藉由觀察(通常為顯微鏡)基本上呈圓形者，且具有直徑為小于約25至35微米，優選為小于約15微米。本發明的其它特定細胞的端粒 限制片段(TRF)長度為小于約30至40千堿基(kilobase)，優選為小于約20千堿基，例如約17千堿基。用于量測骨髓干細胞直徑與測定TRF的優選方法如下文所述。
本發明其它特定的骨髓干細胞基本上為整倍體(euploidy)，其中于細胞培養中整倍體基本上維持至少10代(passage)，優選為約20至約200代。用來測定細胞染色體套數的方法是為已知且如下文所提供。
本發明更特定的骨髓干細胞能形成內皮細胞(ECs)，例如，在與內皮細胞促進條件接觸后，藉由標準內皮細胞分化分析法予以測定。該內皮細胞促進條件的實例是為此范疇中已知，并且包括與某些血管新生因子和細胞有絲分裂素接觸，例如該是揭示于美國專利案第5,980,887號；PCT/US99/05130(WO 99/45775)，且合并于此以資參考。該揭示的因子與有絲分裂素，是包括酸性與堿性的纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor)(aFGF與bFGF)，血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF-1)、VEGF 165、表皮生長因子(epidermalgrowth factor，EGF)、轉形生長因子α與β(transforming growthfactor)(TGF-α與TGF-β)、血小板衍生的內皮生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、肝細胞生長因子(HGF)、類胰島素生長因子(insulin like growthfactor，IGF)、紅血球生長素(erythropoietin)、群落刺激因子(colonystimulating factor，CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、血管新生生長素(angiopoietin-1，Ang1)與一氧化氮合成(nitric oxide synthase，NOS)；及其功能性片段。請參見，Klagsbrun等人的Annu.Rev.Physiol.，53217-239(1991)；Folkman等人的J. Biol Chem.，26710931-10934(1992)與Symes等人的CurrentOpinion in Lipidology，5305-312(1994)。亦可使用有絲分裂素的突變蛋白(mutein)與片段，只要它們能誘發或促進內皮細胞的形成。
優選的內皮細胞促進條件包括與VEGF接觸，尤其是VEDF-1、VEGF165或兩者。另外優選的內皮細胞促進條件，包與某些細胞介質蛋白(例如血清纖維結合蛋白(fibronectin))接觸。請參見下文的實施例2。
術語「標準內皮細胞分化分析法」意指用于偵測與監控內皮細胞功能的任何分析法，例如揭示于限國專利案第5,980,887號與WO99/45775。優選的分法包括內皮細胞特異標記物的偵測，例如于實施例2所示者。
優選者亦有可形成平滑肌細胞(SMCs)的骨髓干細胞，尤其是與平滑肌細胞促進條件接觸后，藉由標準平滑肌細胞分化分析法予以測定。典型平滑肌細胞促進條件是為此范疇中已知，且包括與前述的至少一種血管新生因子或細胞有絲分裂素接觸。優選的平滑肌細胞促進條件涉及與血小板衍生的生長因子(PDGF)接觸，該PDGF包括其突變蛋白或其活性片段。
術語「標準平滑肌細胞分化分析法」意指能偵測與視需要定量下述至少一種平滑肌細胞特異標準，優選為下述全部平滑肌細胞特異標準，的免疫或分子測試(例如，ELISA、西方墨點法或PCR)αSMA、PDGFβ受體、SM22α與SMI。可接受的分析法的說明如實施例2所提供。
本發明的骨髓干細胞又進一步可形成神經細胞，特別是在與神經細胞促進條件接觸后，藉由標準神經細胞分化分析法予以測定。各種神經細胞促進條件是為此范疇中已知，且包括與前述的一種或多種因子與有絲分裂素接觸。優選的條件為涉及與肝細胞生長因子(HGF)單獨接觸，或優選為合并纖維母細胞生長因子4(FGF-4)。又進一步優選的神經細胞促進條件，涉及進一步與DMSO或醫藥上可接受的丁酸鹽(例如，其鈉鹽或鉀鹽)接觸。又進一步優選的神經細胞促進條件，包括與合適的細胞介質蛋白接觸，例如，聚-L-鳥胺酸-層粘蛋白(poly-L-ornithine-laminin)。
術語「標準神經細胞分化分析法」意指能偵測與視需要定量下述至少一種平滑肌細胞特異標記物，優選為下述全部平滑肌細胞特異標記物的免疫或分子測試(例如，ELISA、西方墨點法或PCR)GFAP、GalC、NF200、微管蛋白(tubulin)、髓磷酯堿性蛋白(myelin basic protein)、MAP2、GAD與Tau。請參見實施例2(是揭示特別優選的神經細胞促進條件)。
本發明其它合適的骨髓干細胞，包括與輔助心肌細胞(accessorycardiomyocyte)接觸后可形成心肌細胞的該細胞。術語「輔助心肌細胞」意指在與骨髓干細胞接觸前即為心肌細胞的細胞。該輔助心肌細胞的例子包括經人工培養的該細胞，與抑制心肌組織的心肌細胞。在某些具體實例中，藉由骨髓干細胞而形成的心肌細胞將由干細胞與輔助心肌細胞間的細胞融合來幫助。該心肌細胞(尤其是附屬細胞)可藉由其中一種或組合包括該涉及于活體內、活體外和體外維特的方法予以維持。
綜合上述，本發明的目的是提供一種包括本文所述的分離骨髓干細胞的移植物(在某些具體實例中是為由本文所述的分離骨髓干細胞所組成的移植物)。「移植物」意指包括來自哺乳動物的骨髓干細胞與其它視需要的細胞(內皮細胞、平滑肌細胞與心肌細胞)的細胞或組織制品。提供者(doner)定義為骨髓干細胞的來源，而受體(recipient)為接受該移植物的個體。提供者與受體間的免疫關是可為同種異體、自體或有需要的異種。本發明優選的具體實例，提供者與受體一般為同卵雙生，且通常為相同個體(免疫兼容)。該例子中，對提供者與受體而言，該移植物將為免疫兼容。
「移植物」亦指投予至接受體的本發明骨髓干細胞，而變成該接受體一種多種組織或器官的一部分。有時該術語「移植」用來指骨髓干細胞意欲同化成標的組織或器官(無論是骨髓干細胞或已分化細胞)。優選涉及心血管組織(例如靜脈、動脈，優選為心肌組織)的移植。本發明的移植亦可形成組織培養制品，其中本發明的骨髓干細胞是已組合其它細胞，與/或促進分化的有絲分裂素，與/或產生意欲植入的細胞選殖。若有需要，該制品可合并合成或半合成纖維，以給予該移植物結構。對某些應用優選的纖維，例如Dacron、Teflon或Gore-Tex。
本發明優選的移植物實例為從提供者分離出的hBMSC的制品，以預防、治療或降低與心血管疾病的嚴重性，例如心肌壞死或梗塞。該制品可包括醫藥上可接受的載體(例如鹽水)，及視需要可包括有絲分裂素、血管新生因子、心肌細胞、內皮細胞、內皮祖細胞與平滑肌細胞中至少一種，以幫助所欲移植的結果。
本發明優選的心肌細胞，是表現出心肌細胞特異蛋白(心肌肌鈣蛋白I，cTnI)。優選的內皮細胞為ILB-4。特別有興趣的平滑肌細胞，是表現α-SMA與相關標記物者。
如上所述，本發明是進一步提供產生如本文所述骨髓干細胞的方法，包括從人類病患獲得該細胞(hBMSCs)。在一具體實例中，該方法包括下列至少一步驟，及優選為下列全部步驟a)收集來自哺乳動物的骨髓干細胞，其細胞的尺寸小于約100微米，優選為小于約50微米，優選為約40微米或40微米以下，b)在為貼壁細胞所選擇的條件下，將所收集的細胞于培養基中培養(增殖)，c)選擇貼壁細胞，并于培養基中增殖該細胞至半融合狀態，d)以調配好的培養基將該經培養的細胞進行連續稀釋至孔室中，該稀釋足以產生小于1細胞/孔室的密度，以使該經增殖的細胞為克隆分離物，e)將各克隆分離物進行培養(增殖)，以及選擇具有產生分離骨髓干細胞群的經增殖細胞的孔室。
更特而言的，在所欲為人類細胞的具體實例中，該人類骨髓干細胞(hBMSC)可從年輕男性提供者新鮮未處理的骨髓(BM)細胞獲得。再者，可經市售得到該細胞。該細胞一般藉由離心、溶血和相關的標準步驟從血液細胞分離出。在可接受的緩沖液(例如DPBS)中洗滌該骨髓細胞，并過濾以收集具有尺寸約100微米的細胞，優選為小于約50微米，更優選為約40微米。舉例而言，可使用標準尼龍濾材。一旦分離出該骨髓，即使其在含有生長因子與細胞激素豐富來源以及低含量葡萄糖的完整培養基中生長，優選為胎牛血清(FBS)。細胞是培養(即增殖)小于約2周，優選佳為約1周或1周以下，例如4至6天。接著將使用過的培養基(conditioned media)以新鮮的培養基置換，使貼壁細胞離開培養皿(culture dish)，并再注入新鮮培養基，以選擇可被增殖的細胞。該受選細胞生長至半融合狀態(50％至90％融合度)，再選一次貼壁細胞。然后使該等細胞再接種(reseed)至組織培養瓶(tissue culture flask)的完整培養基中，密度約為104細胞/立方公分。在該細胞達到半融合狀態后，再將該細胞(連續地)再接種至培養瓶中且維持與104細胞/立方公分相同或相近的密度。該培養優選地會傳代得比第一次更多，一般傳代小于5次，優選為約2次，以連續選擇增殖細胞。然后將受選細胞以小于約1細胞/孔室的密度，優選為1/2細胞/孔室的密度，連續稀釋至單一孔室(例如，標準96孔盤)。優選地，以使用過的培養基來培養該細胞，以促進該細胞生長至半融合度(即小于小于50％融合度)。使具有增殖細胞群的孔室進行增殖，有需要時再接種。
特定具體實例中，該方法進一步包括表現下列至少一種標記物的可偵測含量的受選細胞群CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI類受體(MHC class I receptor)、MHC II類受體(MHC class II receptor)或其它如本文所述的細胞標記物。用于進行該選擇的方法，包括如本文所述的任何合適分析法。在需要大量干細胞的具體實例中，通常優選為使用全自動或半自動的方法，例如螢光活化細胞分類法(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)。請參見下文所提供的實施例。
藉由下述實施例1提供產生骨髓干細胞的方法的優選實施例。
本發明亦提供一種用于預防、治療或降低心血管疾病嚴重性的方法，在一具體實例中，是包括投予需要治療的哺乳動物至少一種分離的骨髓干細胞、移植物或本文所揭示的上述兩者。優選地，該等投予足以預防、治療或降低哺乳動物此疾病的嚴重性。在一具體實例中，該方法進一步包括在哺乳動物體內培育該細胞或移植物至少約1周，優選約2至8周。在此范疇從事者將明了此培育時間是為彈性，且可延長或縮短以進行特殊的培育，或有鑒于需治療個體的健康狀況或年齡。骨髓干細胞典型使用的量是依據該或其它經證明的參數而定，包括欲治療的疾病種類與痊愈所需的速度。然而約103至約107個骨髓干細胞間將滿足大部分的應用，典型為約105個該細胞。細胞可藉由任何可接受的途徑投予，包括將該等細胞懸浮于鹽水中來投予，及以針、支架(stent)、導管等裝置來投予。在一具體實例中，從事心肌缺血或梗塞的投予，將以藥丸投射鄰近處或直接在受傷處。
用于心肌缺血后的心肌組織再生的特定方法，是提供于實施例3與4，亦請參見實施例5至6(指出將hBMSC移植至心肌組織)。如上所述，骨髓干細胞的移植提供多種治療效果，包括血管新生因子含量的驟升，以及增加微血管與心肌細胞的密度。
在其它具體實例中，該方法進一步包括投予需治療的哺乳動物至少一種血管新生因子或有絲分裂素(或血管新生因子或有絲分裂素的功能性片段)。優選的血管新生因子與有絲分裂素(及使用方法)是揭示于本文，以及美國專利第5,980,887號與WO 99/45775。或者/再者，該方法可包括投予該哺乳動物能編碼(encoding)至少一種血管新生因子或其功能性片段的至少一種核酸。舉例而言，投予該核酸至該哺乳動物的方法是揭示于美國專利第5,980,887號與WO 99/45775。可在使用骨髓干細胞前、期間或后，以能編碼血管新生因子/有絲分裂素蛋白或核酸者予以治療。
在另一具體實例該方法進一步包括對該哺乳動物投予內皮祖細胞(EPCs)。本發明的具體實例特別發現需使用于良好的血管生長以從事心血管疾病。已揭示產生與使用內皮祖細胞的方法，例如，請參見美國專利第5,980,887號。典型的方法可包括從該哺乳動物身上分離出該內皮祖細胞，以及于活體外使至少一種血管新生因子與/或有絲分裂素與內皮祖細胞接觸。
如上所述，本發明可用于各種心血管疾病的預防與治療，包括充血性心力衰竭(CHF)，缺血性心肌病變(ischemic cardiomyopathy)、心肌缺血與梗塞。若有需要，該方法可進一步包括在尋求治療的哺乳動物體內監控心臟功能，例如，藉由監控超聲心動描記術(echocardiography)、左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、心室短縮分率(fractional shortening，FS)、室壁運動指數(wall motion score index，WMSI)與左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)中的至少一種。本發明涉及預防或治療特定心血管疾病的優選方法，將藉由一或多種該測試的說明來顯示良好的心臟功能。術語「良好」意指相較于未接受本發明組成物的控制組而言(或接受安慰劑者)，有至少10％的進步，優選為至少20％或30％的進步。已知進行該測試的優選方法，且描述于實施例的部分。
本發明是進一步提供用于預防、治療或降低心臟疾病嚴重性的醫藥產品，包括例如下列成分的至少一種骨髓干細胞、尤其是人類骨髓干細胞(hBMSC)，以及視需要用于從哺乳動物體內分離出該細胞的說明書；本文所述的移植物，優選為與hBMSC或其所衍生的細胞或組織，以及視需要用于制備、維持與/或使用該移植物的說明書；此細胞、組織或器官的培養，以及視需要用于制備該等細胞、組織或器官的說明書。在一具體實例中，該產物進一步包括血管新生因子、有絲分裂素的至少一種；或其功能性片段。在另一具體實例中，該產物進一步包含能編碼血管新生因子、有絲分裂素或其功能性片段的至少一種核酸。
亦如上所述，本發明是提供分離的骨髓干細胞，例如藉由本文揭示的方法所產生的hBMSC。該細胞具有的優點，例如所欲的可塑性，與長期繁殖而無培養問題(例如不期望的多倍體和失去多能性)的能力。在一具體實例中，該細胞進一步藉由收集不表現下列至少一種標記物的可偵測含量的細胞CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHC I類受體(MHC class I receptor)、MHC II類受體(MHC class II receptor)或其它如本文所述的細胞標記物。
本揭露尤其顯示本發明可用從單一細胞、骨髓干細胞分離出，特別是從具有非受限多能性增殖能力與分化成三種株系(例如內皮細胞、平滑肌細胞和心肌細胞)能力的hBMSC分離出。將人骨髓干細胞移植至急性梗塞的心肌，俾能藉由重新(de novo)分化成心肌組織以及對毗鄰細胞產生所欲的旁分泌(paracrine)效果，此兩種方式來減弱心肌機能障礙。
更特而言的，本揭露包括實施例是顯示一種已證實位于成人骨髓內的新穎干細胞(SC)株。進一步顯示從單一細胞階段分離出該細胞，以及在140群體倍增(PDs)后的增殖未見明顯的老化現象或失去多能性。此類經由無性生殖的方式增殖的人類骨髓所衍生的多能性干細胞(即hBMSC)，可偵測出CD90和CD117有最小的表現甚至沒有表現。因此，我們分離出的hBMSC不屬于任何已知的骨髓細胞所衍生的干細胞群，例如造血干細胞、間質(mesenchymal)干細胞或多能性成人祖細胞。hBMSC在活體外表現出有分化成全部三種胚層細胞的能力。與新生大鼠的心肌細胞、大鼠主動脈內皮細胞或大鼠平滑肌細胞共培養的hBMSC，是顯示由完全分化與細胞間融合所組成的表現型改變。我們想測試急性梗塞的心肌(Myoc)是否可藉由hBMSC的移植而痊愈。使經除毛的大鼠誘發心肌梗塞后，將hBMSC移植至梗塞周圍區域的心壁。藉由超音波與壓力轉換器來量測大鼠的心肌功能，相較于全部以骨髓細胞移植或以鹽水注射控制28天后的大鼠，以該hBMSC移植的大鼠其心肌功能明顯較好。觀察到表現分化成心肌細胞、內皮細胞與平滑肌細胞的經受體細胞是健康地植入。在hBMSC所移植的心肌細胞中，觀察到多血管新生性的細胞激素(multiple angiogenic cytokines)與主要的心肌轉錄因子受到正調控，而內皮細胞與心肌細胞的增殖速率亦提高。結論一種存在于人類骨髓中的新穎多能性干細胞群，經局部移植后，該hBMSC可藉由重新的血管增生與心肌增生以及擴大增生與保護宿主心肌組織，而改善急性心肌梗塞所造成的結果。首先證明出人類骨髓所衍生的干細胞可在活體內與活體外分化成缺血性心肌再生所需要的所有成分。
如上所述，該揭露顯示一種新穎的成人干細胞群，hBMSC，其不屬于已知的成人干細胞群，是于單一細胞階段初期從已混合的全部骨髓細胞培養中分離出該細胞，在培養中以無性生殖的方式增殖超過140群體倍增(PDs)，且未失去多能性與復制所造成的老化現象。再者，以無性生殖方式所衍生的hBMSC在活體外分化成三種胚層(內胚層、中胚層、神經外胚層)。同樣地，將hBMSC移植至有心肌梗塞的動物模式能減弱心肌梗塞所產生的功能性與病理性的改變。另外，該經改良的心肌功能的機制不只由分化成主要心肌組織(心肌細胞、內皮細胞與平滑肌細胞)者所組成，而且亦涉及該經移植干細胞明顯的旁分泌效果，其能刺激宿主心肌細胞的增生，并預防在梗塞受傷后處于危險狀態的細胞壞死。我們已證實hBMSC為一種獨特的成人骨髓所衍生的多能性干細胞群，其中小于1％的hBMSC表現CD90與CD117。所有定義為造血干細胞(HSC)、骨髓間質細胞(MSC)、多能性成人祖細胞(MAPC)的常見標記對象是不符合hBMSC的特性。hBMSC未表現已知的骨髓間質細胞標記物蛋白，CD105(SH2)和CD73(SH3和SH4)，甚至所用的培養基與該骨髓間質細胞(MSC)培養相類似{Barry，1999；Barry，2001}。如其它成人多能性干細胞所顯示的hBMSC可塑性，事先需要表面分子的最小表現值或不表現[Jiang，2002]{Colter，2001}。由于用于初期培養與克隆分離物/選擇步驟的總骨髓細胞群的用途的不同導致hBMSC獨特的表面表現型。本發明著手進行干細胞生物學的一項重要問題，即是否多能性干細胞可從單一細胞階段經培養而增殖。此處，我們首先證明活體內與活體外分化成中胚層、內胚層與神經外胚層的hBMSC，是來自從單一細胞生長成為純系(clones)時所發生。相較于多能性成人祖細胞(MAPCs)，hBMSC不表現ESCs的基因標記物，例如Oct-4與Rex-1，該基因標記物被認為是MPACs的主要因子。我們的研究暗示該等因子涉及不分化狀態的維持，以及不同于該ESCs的非受限具增殖的多能性成人干細胞。其它不同的事實是大鼠的骨髓干細胞不需要培養增殖用的白血病抑制勝(leukemia inhibitory peptide){Yoon YS，2002}，其為MPAC培養所必需。更確實地說，低細胞密度的維持在多能性維持與hBMSC增殖能力上扮演一個重要的角色。
近來的研究證實用于干細胞可塑性的細胞融合的重要性。本發明活體外的資料指出融合與轉分化有助于hBMSC改成內皮細胞、平滑肌細胞與心肌細胞的表現型變化，此變化的盛行是根據細胞類型。雖然活體內未能進行可靠的研究來定量所觀察到的細胞融合至表現型變化的貢獻，但是活體外的研究暗示融合與轉分化極可能參與其中。無論來自何種成分的貢獻，經移植的hBMSC是有助于缺血性傷害后重建心肌的完整性，只是經融合的肝細胞乃有益于代謝性肝疾。此研究暗示細胞融合不并非治療應用上所必需要的臨界線，至少對于成人干細胞而言。
相較于其它干細胞，本發明的hBMSC提供心臟疾病的再生性治療的優點。顯示改進心臟功能的干細胞有EPC、CD34(+)細胞、血管母細胞(angioblast)，其只在活體內顯示促進血管新生作用(neovascularization)。在缺血性動物模型中測試多能性干細胞，例如骨髓間質細胞(MSCs)、c-kit(+)株系(-)細胞(c-kit positive lineage negativecells)、SP細胞與ESC。在缺血性心臟疾病(IHD)的動物模型中已證實ESC的多能性能分化成心肌細胞，但未顯示能分化成內皮細胞或平滑肌細胞。再者，由于道德問題使得ESCs的用途受阻，而此事早在臨床應用中即被決定至現在。在缺血性心臟疾病中已證實只有老鼠的SP細胞，而非人類的SP細胞，能轉分化成多株系，而且此治療效果尚屬未知。同樣地，老鼠的而非人類的Lin(-)c-kit(+)細胞已顯示多能性與治療效果，然而在循環系統或骨髓中缺乏該干細胞，而且無法經由培養方式來增殖，因而限制該等細胞的治療用途。已顯示人類骨髓間質細胞能轉分化為心肌細胞，然而其形態外觀不同于該已在組織中的心肌細胞，而且內皮細胞與平滑肌細胞的分化尚未證實。相反地，本文所述的hBMSC在活體內與活體外皆具有所需的多能性，以使受損的心肌細胞再生，且在培養方式下有增殖的能力，以及揭示在治療應用上具有功能性的能力。
所有心血管死亡人數中有50％為冠狀動脈性心臟病(coronary heartdisease)，而將近40％為心肌衰竭引起。目前的發現已提供令人注意的證據，即本發明可用于預防、治療或降低各種心臟疾病(包括與梗塞與/或缺血相關的心臟疾病)的嚴重性。更具體地，本發明重新促進血管-肌再生(vasculo-myogenesis)，與擴大血管新生和存在的心肌細胞增殖、降低纖維化的進展，以及改善心肌梗塞嚙齒類動物模型的血管功能。我們相信為首度證實成人人類干細胞在組織缺血而受損的過程中，可促進急性心肌梗塞的成功治療。本發明亦可應用于預防或治療缺血性心臟病(IHD)，尤其是改善缺血性心臟病立即和長期所造成的結果。
下述實施例意圖說明，而非縮限本發明。此處所揭示的所有參考資料是合并于此以資參考。
實施例1hBMSC的培養與特性評估hBMSC的純系性(clonality)、表面抗原決定位置(epitope)、整倍體(euploidy)與增殖性(proliferation)如后。購得來自年輕男性提供者的新鮮未處理過的人類骨髓。使用來自三個不同提供者的三種不同樣品以用于干細胞培養。將存在于塑料皿的17％胎牛血清(FBS)的低(1克)葡萄糖的Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)中的總骨髓細胞經過連續培養(serial culture)后，以紅色螢光染料(DiI)將細胞予以標記。加以限制的稀釋(在96孔盤中每孔有1至2個細胞)后，選出由螢光顯微鏡觀察得到含有單一細胞的孔。經證實含有單一細胞的孔中有6±4％(范圍在2至13％)有存活及增殖的細胞(第1a圖)。當細胞生長至40至50％融合度時，來自各孔(單一純系)的細胞將再接種至6孔盤的孔中，后分別連續地再接種至25cm2組織培養瓶(T25)、T75和T175中，密度為8×103細胞/立方公分。接著，在T175中以4至8×103細胞/立方公分的密度培養細胞，并置換成1∶20至40稀釋倍數。進行再接種三次，在每次培養中選出生長最快速的純系，并以連續培養的方式增殖。從第6代中的各骨髓獲得超過10個純系后，選擇2個純系做連續培養。形態上，相較于骨髓間質細胞，hBMSC有較多的圓形細胞，其細胞尺寸較小(直徑＜15μm)，并且顯示有高的核質比(第1b圖)。此方法所衍生的純系細胞群已經歷超過140群體倍增(PDs)，在第20至80群體倍增間的倍增時間為38±9小時。使用多表面抗原決定位置的FACS分析法證實CD90(第1c圖)與CD117(第1s圖)有最小的表現甚至沒有表現(0至1％)。hBMSC在以培養的方式增殖時，并無法自動分化而維持其表現型。相反地，在克隆分離物前，該經培養的hBMSC表現低含量的CD105、CD90與CD117，然而間葉干細胞卻表現高含量的CD29、CD44、CD73、CD105與CD90(第1b圖)。不表現MHC I類ABC分子與MHC I類DR分子，以及已知的造血干細胞標記物(CD34、CD133、FLK-1、Tie2)(第1s圖)。胚胎干細胞與多能性成人祖細胞(MAPCs)已知的標記物Oct-4與Rex-1，其RT-PCR分析法呈現陰性。該結果顯示hBMSC不屬于已知的造血干細胞(HSCs)、骨髓間質細胞(MSCs)或多能性成人祖細胞(MAPCs)，且免疫上呈現惰性(inert)。培養5群體倍增的hBMSC其平均的端粒 限制片段(TRF)的長度為約17千堿基(kb)；當120群體倍增后再測試其TRF仍舊不變(第1d圖)。DNA套數(ploidy，DNA所復制的套數)為DNA以碘化丙啶(propidium iodide)染色后藉由FACS分析法予以測定。經證實從三個不同純系培養20至140群體倍增的hBMSC，其倍數性沒有增加的跡象，因此推測整倍體在以培養方式增殖時一直維持不變。
第1A圖至第1E圖詳細討論如后a.各孔單一細胞所顯示的相位差影像與螢光影像。b.形態上，許多hBMSC顯示為直徑＜15μm的圓形細胞尺寸。刻度條＝50μm。c.克隆分離物的hBMSC在培養140群體倍增后，以PE或FITC-接合的抗體予以標記，該抗體是相對應于人類CD29、CD44、CD73、CD105、CD90或免疫球蛋白同種型(isotype)對照組。以FACStar流式細胞儀(B-D)分析細胞。藍線代表對照組的免疫球蛋白；紅線表示特定的抗體(Ab)。在克隆分離物前，該經培養的hBMSC表現低含量的CD105、CD90。經克隆分離物后的hBMSC僅顯示CD90沒有表現以至有最小的表現(0至1％)(第1c圖)。相反地，購得的間葉干細胞表現高含量的CD29、CD44、CD73、CD105與CD90。d.培養10群體倍增(線1，kb)與120群體倍增(線2，kb)hBMSC其平均的端粒 限制片段(TRF)的長度并未異于TRF的平均值。e.DNA倍數性分析。以碘化丙啶將克隆分離物前與克隆分離物后的hBMSC染色，并進行FACS分析法。經證實培養20群體倍增(左框)與140群體倍增(右框)的hBMSC，其超過雙倍數的DNA量＜1％。代表性的實施例為＞3。
實施例2hBMSC的可塑性活體外分化藉由采用與修改早期發布有關成人和胚胎干細胞的培養條件來測試hBMSC活體外分化的可能性，此是首先需要特定株系的細胞激素。
為了誘使分化成為內皮細胞，將密度為5×104細胞/立方公分的hBMSC再接種至覆蓋0.1％白明膠(gelatin)或纖維結合蛋白(fibronectin)的玻璃孔室，該孔室內具有2％FBS、10-8地塞米松(dexamethasone)與10奈克/毫升VEGF的DMEM或EBM-2(Clonetics)。培養5天后，hBMSC形成血管狀的結構(第2a圖，左上框)。培養15天后，hBMSC表現出內皮細胞特定的表現型，例如馮威里氏因子(von Willebrand factor，vWF)、Flk1、VE-Cadherin、CD31、人類內皮細胞特定標記物(第一型荊豆凝集素，Ulex europaeus lectin type 1，UAE-1)(第2a圖)。14天后，藉由免疫細胞化學(immunocytochemistry)證實63±8％(VE-Cadherin)至85±12％的hBMSC有內皮細胞表現型。內皮細胞特定基因、VE-Cadherin、CD34、Flk-1、Tie2與CD31的RT-PCR亦證實(分化前的)hBMSC分化成內皮細胞表現型(分化后)(第2b圖)。
為了誘使分化成為平滑肌細胞群系，將密度為1×105細胞/立方公分的hBMSC再接種至未覆蓋或覆蓋纖維結合蛋白(fibronectin)的塑料皿，該塑料皿內有含PDGF-BB(50奈克/毫升，R&D)補充物的1至2％DMEM或EBM-2[Hellstrom，1999；Yamashita，2000]。培養14天后，以α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)與鈣調節蛋白(calponin)染色且呈現陽性的hBMSC分別有89±6％與67±12％，此表示分化為平滑肌細胞的表現型(第2c圖)。RT-PCR證實平滑肌細胞特定基因、αSMA、PDGFβ受體、SM22α與SM1(第2d圖)。
第2a圖至第2d圖詳細討論如后a.在內有DMEM且覆蓋白明膠的玻璃孔室內培養5天后的Hoffman影像(左上角)，hBMSC形成典型的血管狀的結構。在內皮細胞分化培養基中培養14天的hBMSC，經免疫螢光影像證實hBMSC表現出內皮細胞特定蛋白，例如Vwf、Flk-1、VE-Cadherin、CD31與UEA-1。b.使用內皮細胞特定基因、VE-Cadherin、CD34、Flk-1、Tie2與CD31的RT-PCR亦證實(分化前的)hBMSC分化成內皮細胞表現型(分化后)c.以含PDGF-BB(50奈克/毫升，R&D)補充物的2％DMEM培養14天的hBMSC，藉由免疫固定染色(IF staining)證實表現平滑肌細胞特定蛋白、α-SMA與鈣調節蛋白。d.在誘發分化后，RT-PCR分析法顯示僅表現平滑肌細胞特定基因、PDGFβ受體、αSMA、SM22α與SM1。RT-PCR中(第2b圖和第2d圖)，代表分子量標記的濃厚梯狀帶為600bp。
為了誘使神經株系的分化，將密度為4×104細胞/立方公分的hBMSC接種至覆蓋聚-L-鳥胺酸-層粘蛋白的皿或塑料皿，該皿內有含100奈克/毫升bFGF、20奈克/毫升HGF與B27補充物的DMEM/F12[Palmer，1999；Mezey，2000；Brazelton，2000]。10至14天后，hBMSC顯示各種神經株系細胞的形態與表現型特性(第3a圖)。免疫螢光細胞化學(immunofluorescent cytochemistry)顯示星狀細胞(astrocytes)的表現型標記物(神經膠質纖維酸性蛋白，glial fibrillar acidic protein，GFAP)、寡樹突細胞的半乳糖腦酯(oligodendrocytes(galactocerebroside，GalC))與神經元的神經絲200(neurofilament 200，NF200)；β-微管蛋白III亞型(β-tubulin III isoform)；β-微管蛋白III)的表現分別為22±7％、15±6％、57±9％(NF200)。RT-PCRE實各種神經株系特定基因的重新表現，例如GFAP、MBP(髓磷質堿性蛋白，于寡樹突細胞)、MAP2(與微管相關蛋白2，于神經元)、GAD(麩胺酸脫羧(glutamic aciddecarboxylase)，于神經元)與Tau(于神經元)[Sanchez-Ramos，2000]。
為了了解hBMSC是否可分化成內胚層株系，將密度為3至4×104細胞/立方公分的hBMSC接種至有含10-8地塞米松、25奈克/毫升HGF、10奈克/毫升FGF-4以及10毫克/毫升DMSO或0.5毫莫耳濃度丁酸鈉補充物的2％FBS的1％Matrigel[Shen，2000；Hamazaki，2001；Oh，2000；Schwartz，2002]。培養10至14天后，約60％的hBMSC獲得上皮狀的形態。免疫固定組織化學顯示經培養的hBMSC中內胚層/肝細胞基因；HNF 3β與α-FP于第10天；HNF 1α與CK18于第14天的表現(第3g圖至第31圖)。RT-PCR分析法顯示內胚層株系特定基因(CK18、CK19、α-FP與白蛋白)的重新表現(第3m圖)。
第3a圖至第3m圖詳細討論如后a.于神經性分化培養的hBMSC顯示出典型神經細胞外觀的形態特性。刻度條＝50μm。b至e.在誘使hBMSC神經性分化后，經免疫固定染色證實多個神經特定蛋白的表現GFAP(于星狀細胞)、GalC(于寡樹突細胞)、NF200(于神經元)、β-微管蛋白III。f.在誘使神經性分化后，RT-PCR證實神經株系特定基因的重新表現，如GFAP、MBP(于寡樹突細胞)、MAP2(于神經元)、GAD(于神經元)與Tau(于神經元)。g至1.hBMSC分化成內胚層(上皮狀)細胞的表現型特性。在含有HGF、FGF-4與DMSO培養基的Matrigel上，經培養的hBMSC中HNF 3α(FITC)與αFP(Cy3)于第10天(第3g圖至第3i圖)以及CK18(FITC)與HNF 1α(Cy3)于第14天(第3j圖至第31圖)的免疫固定定位。m.在誘使神經性分化后，RT-PCR證實內胚層株系特定基因的重新表現，如CK18、CK19、α-FP與白蛋白。
實施例3
為了誘使心肌分化，將hBMSC與新生大鼠的心肌細胞共培養(NRCM)。將密度為1×105細胞/立方公分的NRCM接種至含10％胎牛血清(FCS)的DMEM(低葡萄糖)中培養。于第3天，將以Dil標記的hBMSC以1∶4的比例加至經培養的NRCM中[Condorelli，2001]，并培養2周。在以抗心肌特定標記物的抗體固定及染色后，獲得免疫螢光影像。經Dil標記的hBMSC(第4b圖、第4f圖、第4j圖)由Dil標記顯示出紅色螢光，有心肌細胞特定蛋白而呈陽性的細胞是出現綠色，此心肌細胞特定蛋白例如心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、心房利鈉多(atrial natriuretic peptide，ANP)、-肌凝蛋白重鏈(-myosin heavy chain，-MHC)(第4c圖、第4g圖、第4k圖)。疊合影像說明有心肌細胞特定蛋白而呈陽性染色且經Dil標記的hBMSC的分率，指出該hBMSC于共培養中顯示出心肌細胞表現型的特性(第4圖)。藉由RT-PCR來提高心肌轉錄因子的mRNA表現(第4m圖)。由于共培養，GATA-4與Nkx2.5在hBMSC(左邊的線)或NRCM(中間的線)培養中不表現。hBMSC與NRCM的共培養(右邊的線)只誘使GATA-4與Nkx2.5的重新表現。GATA-4是為心肌特定轉錄因子，已知能活化數種心肌基因(例如肌凝蛋白輕鏈、TnT、TnI和α-MHC)和ANP的起動子。Nkx2.5為受限于心肌細胞分化初期的轉錄因子[Srivastava，2000；Bruneau，2002]。因此，該發現暗示hBMSC已進入朝向心肌細胞表現型的分化的路。值得注意，當把hBMSC與依NRCM調配好的培養基共培養時，觀察不到hBMSC的心肌細胞分化。
如第4i圖所示，NMCR與hBMSC緊緊地相連在一起，因此藉由上述實驗不排除發生融合的可能性。再者，最新研究報導指出細胞融合的結果，使ESCs與骨髓所衍生干細胞可能發生表現型的變化{Ying，2002}{Terada，2002}。為了測定是否為此機制導致hBMSC分化，使用經CFDASE(羧化螢光素二乙酸酯琥珀醯亞胺酯，carboxyfluoresceindiacetate succiniimidyl ester)-標記的NRCM與經DiI標記的hBMSC共培養，而該化學染料不會轉移至毗鄰細胞。共培養7天后，經培養細胞先以cTnI再以經AMCA接合的二級抗體固定與染色(藍色螢光)(第4p圖)。為了避色細胞重疊，我們選擇影像分析用的單層細胞區域。如第4n圖至第4q圖所示，某些以箭頭指出的經Dil標記的hBMSC，亦同時呈現綠色(NRCM)與藍色(cTnI)螢光的陽性反應，此暗示已發生細胞融合。呈現紅色與藍色螢光陽性反應但綠色螢光為陰性反應的細胞，才是真正經分化的細胞(第4o圖至第4q圖以三角形所示)。該結果顯示在相同共培養的環境中，同時發生分化與融合。從3個不同實驗中計數5000細胞/共培養后，分化與融合的趨勢分別為2.9±1.1％和3.2±0.9％。為了測定hBMSC與內皮細胞/平滑肌細胞間融合的發生率，將大鼠主動脈內皮細胞(RAECs)或大鼠平滑肌細胞(RVSMCs)分別與hBMSC共培養。當RAECs與RVSMCs達到50至60％融合度時，以CFDA-SE(綠色螢光)來標記細胞。2天后，將經Dil標記的hBMSC以1∶4的比例加至RAECs與RVSMCs的培養皿，并培養7天。然后，經培養細胞先以VE-cadherin或α-SMA再以經AMCA接合的二級抗體固定與染色。在螢光顯微鏡四用上述融合與真與分化用的程序，內皮細胞與平滑肌細胞分別的融合趨勢為5.3±1.1％與7.4±0.9％，然而分化的趨勢則各為3.4±0.7％and3.6±0.5％。該結果揭示hBMSC表現型的變化是由融合與分化所組成，因此，免疫組織化學利用株系特定標記物蛋白予以解釋在活體內可能過量估計的真正分化趨勢。必需了解到活體內融合與分化的速率可能不同于活體外所陳述者。
第4a圖至第4m圖詳細說明如后。第4a圖至第4m圖.為了研究心肌性分化，將hBMSC與NRCM共培養。將來自F334大鼠的初級NRCM分離出并于DMEM中培養。于第4天，以1∶4的比例將經Dil標記的hBMSC加至經培養的NRCM，并培養至二周。免疫固定影像顯示共培養的經Dil標記的hBMSC(第4b圖、第4f圖、第4j圖)呈現紅色，而以心肌細胞特定蛋白(cTnI(c)、ANP(g)與α-MHC(k))染色的NRCM則呈現綠色。在疊合影像(d、h、l)中的呈現雙螢光陽性反應的細胞為表現心肌細胞表現型的hBMSC(箭頭指示處)。注意少數hBMSC仍未經轉分化(第4b圖、第4d圖、第4j圖、第41圖中以三角形指示處)。DAPI抗核染色(nuclearcounter-staining)顯示沒有核的重疊，暗示此明顯的轉分化并非起因于單純的hBMSC與NRCMs的重疊。由RT-PCR(第4m圖)評估心肌轉錄因子mRNA的表現。共培養前，hBMSC(線1)和NRCM(線2)培養中未表現心肌轉錄因子(GATA4與Nkx2.5)。共培養(線3)則指出GATA4與Nkx2.5的重新表現。第4n圖至第4q圖。為了研究細胞融合，將預先標記好的hBMSC和NRCM共培養。為了測定此兩種細胞的融合是否造成心肌細胞表現型的改變，我們將以綠色螢光染料(DFCA-SE)標記的NRCMs(第4n圖)與經Dil標記的hBMSC共培養(第4o圖)。在共培養7天后，先以cTnI再以經AMCA接合的二級抗體使細胞染色(藍色螢光)(第4p圖)。在免疫固定影像(第4n圖至第4p圖)中，三種顏色皆呈陽性的細胞(箭頭指示處)為表現cTnI蛋白的融合細胞，紅色和藍色螢光呈陽性但綠色螢光呈陰性代表轉分化成心肌細胞群系的hBMSC(三角形指示處)。第4r圖至第4x圖。為了測定hBMSC融合與分化成內皮細胞(第4r圖至第4u圖)或平滑肌細胞(第4v圖至第4y圖)的表現型改變的分布，是將經CDFA-SE標記的大鼠主動脈內皮細胞(RAECs)或大鼠血管平滑肌細胞(RVSMCs)與經Dil標記的hBMSC以4∶1的比率共培養，并培養7天。固定后，先以VF-Cadherin或α-SMA再以經AMCA接合的二級抗體使細胞染色(藍色螢光)。在第4r圖至第4u圖的箭頭指示處所指為表現VF-Cadherin的hBMSC(紅色)與RAECs(綠色)間的融合。在第4r圖至第4u圖的三角形指示處表示從hBMSC分化成為內皮細胞。在第4v圖至第4x圖的箭頭指示處所指為RVSMCs(綠色)與hBMSC(紅色)間的融合。
實施例4急性缺血性心肌的再生性效果我們測試是否可藉由如下的hBMSC移植使經缺血傷害的心肌再生。
立即將新生大鼠的冠狀動脈結扎后，將8×105hBMSC移植至梗塞周圍區域的心壁。取相同數量的人類總骨髓細胞(TBMC)與相同數量的PBS作為對照組。使15只大鼠經歷外科手術，14只大鼠接受hBMSC而存活，然而在4周研究期間時，TBMC與PBS組中有12只大鼠存活。為了評估心臟功能，在手術前與手術后4周皆進行心臟波音波。接受hBMSC、TBMC或PBS的大鼠的左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、心室短縮分率(fractional shortening，FS)、室壁運動指數(wall motion score index，WMSI)的基線相似(資料未示)。治療4周后，將接受hBMSC的大鼠與以TBMC或PBS治療的大鼠相較其所進行的心臟超音波，顯示LVEDD與LVESD皆明顯地變小(LVEDD，相對于TBMC和PBS各為P＜0.05；LVESD，相對于TBMC和PBS各為P＜0.01)(第5a圖與第5b圖)，因此FS明顯變大(相對于TBMC和PBS各為P＜0.01)(第5c圖)。心壁運動指數(wall motion score index，WMSI)表示出局部心壁運動異常的程度，該指數顯著優選(相對于TBMC和PBS各為P＜0.01)(第5d圖)。LVEDD、LVESD、FS與WMSI在TBMC與PBS所治療的大鼠間并未顯示不同。值得注意，在hBMSC和TBMC與PBS所治療的大鼠中，運動困難的發生率為14％和58％與67％(P＜0.05)。以侵入性血循環動力測量(invasive hemodynamic measurement)證實相較于以TBMC或PBS注射的大鼠，經hBMSC移植的大鼠左心室收縮壓(LVSP)、+dP/dt(壓力上升速率的最大值)及-dP/dt(壓力下降速率的最大值)皆顯著地變大(皆各為P＜0.01)(第5e圖、第5f圖)。同時，該資料顯示hBMSC移植導致功能性回復的增強，以及心肌梗塞后更有利的重建。
第5a圖至第5d圖詳細說明如后。第5a圖至第5d圖。心肌梗塞4周后的心臟超音波與細胞移植顯示相較于以TBMC與PBS治療的大鼠，經hBMSC移植的大鼠有較小的LVEDD、LVESD，以及優選的FS和WMSI，此指出心臟功能的增進。WMSI心壁運動指數。第5e圖、第5f圖。hBMSC移植4周后以米勒(Millar catheter)做侵入性血循環動力測量。相較于對照組，有經移植hBMSC的大鼠其左心室收縮壓(第5e圖)以及+dP/dt和-dP/dt明顯地增大。*P＜0.05，**P＜0.01。
實施例5活體內經移植hBMSC的植入生長與多株系轉分化為了測定經移植hBMSC的植入生長的尺寸與范圍，取4周大心肌部分的冷凍樣品做調查。在螢光顯微鏡下觀察梗塞周圍與梗塞區域中，大部分的經Dil標記的BMSC其植入生長情形(第6a圖、第6b圖)。相反地，從經TBMC移植的心臟顯示出較小部分分散的經Dil標記的細胞，且其大多位于梗塞區域(第6c圖、第6d圖)。免疫表現型特性顯示經移植的經Dil標記的hBMSC(紅色)，對心肌細胞特定蛋白的染色呈現陽性，即cTnI與ANP(綠色)(c-MHC資料未示)，且大多數形態上出現成熟心肌細胞，而無法與原本在梗塞周圍與梗塞區域中的心肌細胞區分(第6e圖至第61圖)，來表示心肌細胞的分化。hBMSC分化成為內皮細胞與平滑肌細胞，亦可藉由經移植hBMSC與呈現ILB4陽性的血管內皮細胞和呈現α-SMA陽性的平滑肌細胞共定位來證實，以暗示分化成為內皮細胞與平滑肌細胞的表現型(第6m圖至第6t圖)。心肌細胞分化只有在經hBMSC移植的大鼠。觀察12至14只存活的經hBMSC移植的大鼠(85％)，藉由與心肌細胞形態上的相似與心肌細胞特定蛋白的表現(cTnI)來定義其是否分化成為心肌細胞。如第6h圖與第8c圖所示，在9至14只大鼠(64％)發現具有有機體構造的再生心肌細胞相似于原本正常的心肌細胞，在其它3只大鼠(21％)僅觀察到分散的細胞分化。然而，在所有經hBMSC治療的大鼠身上觀察到心肌細胞特定蛋白的表現。，藉由所有經調查大鼠的形態與發現陽性標記來定義內皮細胞與平滑肌細胞的分化。同時，該發現暗示經移植hBMSC健康地移植至梗塞/缺血性心肌，并存活一段長時間而造成心肌與血管重新增生。注意，病理上研究顯示經經hBMSC移植的心臟無畸胎瘤(teratoma)、血管瘤(angiomatosis)或骨形成。
第6a圖至第6d圖詳細說明如后。使經Dil標記的hBMSC與TBMC植入生長至梗塞的心肌。移植4周后，使大部分hBMSC(紅色螢光)(第6a圖)植入生長至梗塞與梗塞周圍區域的心肌。相反地，觀察到相當小部分的TBMCs(紅色螢光)，且大多在梗塞區域(第6c圖)。第6b圖與第6d圖為第6a圖與第6d圖的哈福曼影像(Hoffman image)，顯示出植入生長的細胞的定位。第6e圖至第1圖為hBMSC分化成為心肌細胞的免疫表現型特性。以cTnI(第6g圖)與ANP(第6k圖)使4周大的心肌細胞樣品染色(各以經FITC標記的二級抗體來偵測)。此兩種標記物物會使移植的經Dil標記的hBMSC呈現陽性染色，且無法與宿主的心肌細胞區分，來表示心肌細胞的再生。第6m圖至第6p圖是合并hBMSC至內皮細胞。心肌區域以內皮細胞標記物物ILB4染色(第6o圖)，顯示經Dil標記的hBMSC與血管內皮細胞共定位，暗示其轉分化成內皮細胞(第6p圖的箭頭指示處)。第6q圖至第6t圖是合并hBMSC至平滑肌細胞。心肌區域以α-SMA染色(第6s圖)，說明經Dil標記的hBMSC與血管平滑肌細胞共定位，表示其轉分化成平滑肌細胞表現型(第6t圖的箭頭指示處)。
實施例6經移植hBMSC的擴大增殖，與在宿主心肌的存活情形有鑒于hBMSC移植的完全的生理效果不能只藉由一些大鼠的原位多株系分化程度來解釋，我們下一步想要闡明經移植hBMSC是否影響增殖與宿主心肌細胞的存活。為了測定宿主心肌細胞的增殖部分，植入用以持續地輸送5-溴-2’-去氧尿嘧啶(BrdU)的微小滲透壓幫浦4周，以標記所有進入細胞周期的S期的細胞。從經hBMSC移植的心臟區域，大多數增殖細胞皆于宿主心肌細胞與經受體細胞能觀察到(第7a圖至第7d圖)。相反地，在經TBMC或PBS注射的心臟中觀察到相當少數呈現BrdU陽性的細胞(第7e圖、第7f圖)。BrdU指數，即呈現BrdU陽性的核對各區域計數得到的核總數的百分比，相較于對照組，經移植hBMSC的BrdU指數明顯較高(hBMSC與TBMC、PBS；25.8±5.2％與11.2±3.1％、9.5±2.8％，P＜0.001)。雙免疫組織化學(Double IF histochemistry)使用抗BrdU的老鼠抗體與ILB4或cTnI，顯示心肌細胞與內皮細胞呈現BrdU陽性(第7g圖至第7n圖)。內皮細胞與心肌細胞的BrdU指數在經經hBMSC移植的心臟較高(與TBMC，PBS；ECs，8.3±2.7 vs.2.9±1.5，2.4±1.3，P＜0.01；CMCs，2.1±1.2 vs.0.2±0.1，0.2±0.1，P＜0.01)。該結果指出宿主心肌細胞(包括內皮細胞與平滑肌細胞)的經移植hBMSC擴大增殖。
接著，研究經受體細胞是否能影響雕亡過程，該雕亡過程一般被視為對急性心肌梗塞后的心肌退化進展有影響力的主要機制的一。使用1周大的心肌樣品(n＝4)進行TUNEL分析法。雕亡指數，即TUNEL(+)核對各區域所計數得到的核總數的百分比，相較于經hBMSC移植的心臟，該1周大的心肌樣品的TUNEL指數為其1/3(雕亡指數與TBMC，PBS，2.1.0.8與6.6.1.2，7.3.1.1，P＜0.01)(第7o圖至第7q圖)。該相異處尤其在梗塞周圍區域更加明顯。在α-肌小節肌動蛋白(α-sarcomericactin)或ILB4與TUNEL共同染色所獲得的心肌細胞與內皮細胞的雕亡指數，在經hBMSC移植的心臟中明顯減少(與TBMC，PBS；CMCs，0.5±0.1 vs.2.1±0.3，1.9±0.3，P＜0.01；ECs，0.7±0.1 vs.2.5±0.3，2.0±0.2，P＜0.01)(第7r圖至第7u圖)。因此，藉由該研究闡明hBMSC移植的機制可維持心肌功能，以促進受傷害的心肌細胞與內皮細胞的存活。
第7a圖至第7u圖詳細說明如后。第7a圖至第7h圖。藉由BrdU免疫組織化學法來辨識增殖細胞。從經hBMSC移殖的心臟區域中，在宿主心肌細胞與經受體細胞中皆觀察到大多數BrdU陽性細胞(綠色的點)。相反地，在經TBMC(第7e圖)或PBS(第7f圖)注射的大鼠心臟中觀察到較少量BrdU陽性細胞。第7g圖至第7j圖。以抗BrdU(第7h圖)與ILB4(第7i圖)的抗體共同染色證實經hBMSC移殖的心臟的微血管內皮細胞中有BrdU陽性細胞的存在(箭頭指示處)。第7k圖至第7o圖。以抗BrdU(第71圖)與cTnI(第7m圖)的抗體共同染色顯示經hBMSC移殖的心臟的成熟心肌細胞中有BrdU陽性細胞的存在(箭頭指示處)。第7m圖至第7o圖。經hBMSC(第7m圖)、TBMC(第7n圖)或PBS(第7o圖)處理的心肌以抗α-肌小節肌動蛋白的老鼠抗體和TUNEL共同染色，以辨識雕亡心肌細胞(箭頭指示處)。相較于接受TBMC(第7p圖)或PBS(第7q圖)的大鼠，接受hBMSC(第7o圖)的大鼠的梗塞周圍區域顯示有較少的雕亡細胞。放大率×400。第7r圖至第7s圖。以抗α-肌小節肌動蛋白的老鼠抗體(紅色)和TUNEL(綠色)染色后所獲得的代表性影像證實來自經PBS注射的心臟的心肌細胞雕亡(箭頭指示處)。第7t圖至第7u圖。以ILB4(紅色)和TUNEL(綠色)染色后所獲得的代表性影像證實來自經PBS注射的心臟的內皮細胞雕亡(箭頭指示處)。
實施例7經移植的hBMSC的旁分泌效果血管新生細胞激素與心肌轉錄因子的正調控為了辨識對經過心肌傷害的hBMSC治療效果有影響性的可能的旁分泌機制，使用在hBMSC或PBS處理后的14天和28天所得到的心肌樣品，藉由半定量RT-PCR來評估血管新生細胞激素(例如VEGF-A、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)與血管生成素-2(Ang-2)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、堿性纖維母細胞生長因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)、血小板衍生血小板衍生生長因子-B(platelet-derived growth factor-B，PDGF-B)、轉形生長因子-(transforming growth factor-，TGF-))，與心肌轉錄因子(例如Nkx2.5、GATA-4、MEF2c)的mRNA的表現。相較于PBS組，調查經經hBMSC移植的心臟在第2周和第4周的所有血管新生細胞激素的表現皆明顯地受到正調控(P＜0.01)。再者，經經hBMSC移植的心臟在第4周所有血管新生細胞激素仍維持高度表現。該發現暗示經移植的hBMSC可調節多種血管新生細胞激素的表現，同時可能促進血管新生與血管再生(vasculogenesis)。相較于對照組，經經hBMSC移植的心臟中GATA-4，Nkx2.5 and MEF2c的表現皆明顯地受到正調控(第8b圖)，暗示經移植hBMSC可藉由使宿主心肌細胞分化的增殖與/或直接分化成新的心肌細胞來增強心肌再生。正確地說，多種因子的正調控可在某種程度上解釋經移植hBMSC在宿主內皮細胞與心肌細胞上的增生效果。
第8A圖至第8B圖詳細說明如后。藉由半定量RT-PCR來評估hBMSC或PBS處理后第2與4周所獲得的組織樣品的mRNA的表現。RT-PCR產物的代表性凝膠照片(n＝4)(左邊框架)，以及血管新生細胞激素(第8A圖)與心肌轉錄因子(第8B圖)的mRNA表現(右邊框架)的定量(是根據GAPDH表現)。注意在經hBMSC移植的樣品中所有因子的顯著正調控。實驗至少進行三次重復。**P＜0.01，***P＜0.001。
實施例8hBMSC移植增加微血管和心肌細胞的密度及減少心肌纖維化為了量測hBMSC移對梗塞后心肌的病理特性的最終影響，在CD31和HE染色后分別定量微血管和心肌細胞密度，并測量周邊纖維化的百分比。經hBMSC移植的大鼠其微血密度為經TBMC和PBS注射的大鼠的2至2.3倍高(P＜0.01)(第9a圖至第9d圖)。經hBMSC移植的大鼠其心肌細胞的密度亦為經TBMC和PBS注射的大鼠的2.4至2.8倍高(P＜0.01)(第9d圖至第9g圖)。周邊纖維化面積的百分比以麥森氏三色染色區域(Masson’s trichrome-stained sections)證實經hBMSC移植的大鼠有較小纖維化的面積(藍色面積)(P＜0.01與TBMC，PBS)。
第9a圖至第9g圖詳細說明如后。第9a圖至第9d圖。在細胞移植后4周后梗塞心肌中的CD31的代表性免疫組織化學發現顯示經經hBMSC移植的心臟的微血管密度較高。**p＜0.01及TBMC和PBS。第9e圖至第9h圖。以HE染色的塞面積的代表性發現(第9e圖至第9g圖)證實經經hBMSC移植的心臟有顯著的心肌恢復(salvage)與再生。**p＜0.01及TBMC和PBS。第9i圖至第91圖。以麥森氏三色染色的心臟代表圖顯示經經hBMSC移植的心臟明顯地有較小的纖維化百分比面積。**p＜0.01及TBMC和PBS。
下列為進行上述實施例1至實施例8的實驗所需使用的材料與方法。
1.BMSC的分離與培養從Biowhitttaker(Cambrex)(Wakersville，MD)購得來自年輕男性提供者的新鮮未經處理的人類骨髓細胞。使骨髓細胞在1300轉/分鐘(rpm)的轉速下離心10分鐘以獲得細胞沉淀物(cell pellet)。使細胞沉淀物重新懸浮于25毫升含0.5M EDTA(DPBS-E)的DPBS中。以1300rpm離心7分鐘后，使細胞重新懸浮于5毫升DPBS-E和20毫升NH4Cl以誘使溶血(hemolysis)。在離心并以DPBS-E洗滌后，使細胞通過40微米(μm)尼龍(Nylon)濾器而過濾，并將細胞接種至以100微克/毫升(g/ml)的血清纖維結合蛋白(fibronectin)覆蓋的6孔盤的孔中。該細胞在含有17％FBS、100U/ml盤尼西林與100μg/ml的鏈霉素的低(1克)葡萄糖的完整DMEM(Biowhittaker；全選擇用以促進骨髓細胞的增殖)與2mM麩胺酸鹽(glutamate)中于37℃與5％CO2生長4至6天后，該培養基以新鮮培養基置換，此貼壁細胞生長至60％融合度。接著，將該細胞再接種至25cm2組織培養瓶(T25)的完整培養基中，密度為1×104細胞/立方公分。在細胞達到60％融合度后，將該細胞連續地再接種至T75和T175中，且密度仍為1×104細胞/立方公分。在T175培養瓶中培養至少2代后，以CellTrackerTMCM-DiI(Molecular probes)標記該細胞，并接種至96孔盤的孔中，藉由限稀釋法(limiting dilution method)使每孔密度為前孔密度的一半。并以限定稀釋前收集得來的使用過的培養基予以培養，通過0.2微米的濾器來過濾，并儲存于-80℃中。在螢光顯微鏡下，我們排除含有超過1顆細胞的孔(第1a圖)顯示孔中單一細胞的相位差(phasecontrast)與螢光影像。當細胞生長到40至50％融合度時，將來自單一孔的細胞連續地再接種至6孔盤的單一孔中，隨后連續地再接種至T25、T75與T175中，密度為4至8×103細胞/立方公分。然后將細胞培養于T175中，并以1∶10至40的稀釋倍再接種，且生長至4至8×103細胞/立方公分。
2.螢光標記細胞分選技術對經培養的hBMSC進行hBMSC的螢光標記細胞分選技術(Fluorescent-Activated Cell Sorting，FACS)分析。使用至少三種不同選殖株的選殖前與選殖后所分離的細胞，以作為選殖株系用，利用兩祖細胞在5群體倍增(PDs)與在120群體倍增時。FACS染色的程序已于先前描述{Kalka，2000#11}。簡單地說，使總數為2×105的經培養細胞再懸浮于含有10％FBS與0.01％NaN3的200微升Dulbecco’s PBS(Cambrex)中，并直接與經PE-或FITC-結合的單株抗體，或先與未結合的單株抗體再以經FITC-結合的抗老鼠的免子IgG(FITC-conjugated rabbitanti-mouse IgG)(Jackson Immunoresearch)于4℃培育20分鐘。適當的放射線標記免疫球蛋白做為對照組(Beckton-Dickinson，Medford，MA，USA)。染色后，以2％聚甲醛(paraformaldehyde)固定細胞。FACStar流式細胞儀(Beckton-Dickinson)上進行定量FACS。用于FACS分析的抗體為能辨識下列分子的經FITC-或Phycoerythrin(PE)-結合的抗體CD4、CD8、CD11b(Mac-1)、CD13、CD14、CD15、CD29、CD30、CD31、CD34、CD44、CD71、CD73、CD90(Thy1)、CD117(c-kit)、CD146、CD166、HLA-DR、HLA-ABC、來自Beckton Dickson(BD)的2-微球蛋白(2-microglobulin)、來自Miltenyl Biotech(Auburn，CA，USA)的CD133(AC133)與來自Ancell(Bayport，MN，USA)的CD105(Endoglin)，以及能辨識來自Santa-Cruz的Oct4的未結合蛋白。舉例來說，人類間葉干細胞(PT-2501)與培養基(PT-3001)皆購自Cambrex(Poietics)，并用于FACS。
3.DNA套數的分析各細胞的DNA量是藉由將100g/ml核糖(Ribonuclease)處理前的細胞、以碘化丙啶(propidium iodide)染色后，由FACS分析法予以測定。
4.端粒長度分析我們使用TeloTAGGG端粒長度分析套組(Roche，Indianapolis，IN)以測定來自三種不同選殖株在5群體倍增(PDs)與在120群體倍增時的hBMSC的端粒長度。簡單地說，分離(1微克)并消化基因體DNA后，藉由凝膠電泳法將DNA片段分離，并藉由南方墨點法(southern blotting)轉移至尼龍(NyIon)膜。取針對端粒 限制片段(TRF)有特異性且經長葉毛地黃配質(digoxigenin，DIG)標記的探針(probe)與經墨點法處理過的DNA片段雜交(hybridize)，并使的與對DIG有特異性且和堿性磷酸鹽共價結合的抗體培育。最后，藉由堿性磷酸鹽能被代謝成CDP-Star(具高靈敏度的化學冷光受質)的特性使經固定的端粒探針顯像。藉由比較訊號相對于標準分子量來測定TRF的平均長度。
5.hBMSC的活體外分化下述所有活體外研究的進行是使用三種不同選殖株于5與90群體倍增的hBMSC。為了誘發分化成為內皮細胞，將密度為5×104細胞/立方公分的hBMSC再接種至覆蓋0.1％白明膠或體外連接蛋白(vitronectin)于壁上的玻璃孔室，該孔室中具有2至5％FBS、10-8地塞米松(dexamethasone)與10奈克/毫升VEGF(R&D，Minneapolis，MN)的DMEM或EBM-2(Clonetics)培養14天。為了誘發分化成為平滑肌細胞，將密度為1×105細胞/立方公分的hBMSC再接種至未覆蓋或覆蓋纖維結合蛋白(fibronectin)的培養皿，該培養皿內有含PDGF-BB(50奈克/毫升，R&D)補充物的1至2％DMEM或EBM-2[Hellstrom，1999#756；Yamashita，2000#757]，并培養14天。為了誘發神經株系的分化，將密度為4×104細胞/立方公分的hBMSC接種至覆蓋聚-L-鳥胺酸-層粘蛋白的皿(Beckton-Dickinson)或塑料皿，該皿內有含100奈克/毫升bFGF、20奈克/毫升HGF與B27補充物的DMEM/F12[Palmer，1999#764；Mezey，2000#750；Brazelton，2000#749]，并培養14天。為了誘發內胚層株系的分化，將密度為3至5×104細胞/立方公分的hBMSC接種至有含10-8地塞米松、25奈克/毫升HGF、10奈克/毫升FGF-4補充物的2％FBS的1％Matrigel(Beckton-Dickinson)中，并培養7天，隨后添加10毫克/毫升DMSO或0.5毫莫耳濃度丁酸鈉。再培養7天[Shen，2000#761；Hamazaki，2001#762；Oh，2000#763；Schwartz，2002#747]。為了誘發hBMSC的心肌細胞分化，將hBMSC與剛分離的新生大鼠的心肌細胞共培養(NRCM)。將來自F344大鼠的初級NRCM如所述方法分離[De Luca，2000#759]，并以密度為2×105細胞/立方公分予以培養。將經Dil標記的hBMSC以1∶4的比例加至10％胎牛血清(FCS)[Condorelli，2001#758]的DMEM的培養盤中，并培養10天。
6.活體內融合研究將大鼠主動脈內皮細胞(RACEs)培養于含EGM-2 MV SingleQuots(Cambrex)的EBM-2中。將大鼠血管平滑肌細胞(RVSMCs)培養于含15％FBS、2M的L-麩醯胺和抗生素的具有1克/升葡萄糖(Cellgro)的DMEM中。分離出NRCM并如上述培養。當細胞達到50至60％融合度時(3天內)，根據操作手冊以25微莫耳濃度(μM)的Vybrant CFDA SE細胞追蹤套組(Molecular Probes，Engene，OR)將細胞染色。以CFDA SE所標記的細胞在螢光顯微鏡下呈現綠色。兩天后，將經Dil標記的hBMSC(紅色螢光)以1∶4的比例加至RAECs、RVSMCs或NRCM的培養盤，并培養7天。每2至4天更新培養基。為了決定融合與分化的發生率，依據來自三個不同實驗中的共培養計數5000顆細胞。
7.用于免疫螢光細胞化學的抗體為了進行免疫細胞化學，以4％冷的聚甲醛固定細胞7天，并以PBS洗滌兩次。關于內皮細胞標記物，我們使用能辨識下列分子的抗體vWF(山羊多株抗體)(1∶400，Sigma，St Louis，MO)、Flk-1(老鼠單株抗體)(1∶300，Santa-Cruz，Santa-Cruz，CA)、VE-Cadherin(老鼠單株抗體)(1∶100，BD)、CD31(老鼠單株抗體)(1∶100，BD)、UEA-1凝集素(lectin)(1∶200，Vector，Burlingame，CA)、isolectin B4(1∶200，Vector)與Dil乙醯化的LDL(Biomedical Technologies，Stoughton，MA)。關于平滑肌細胞標記物，我們使用能辨識下列分子的抗體-平滑肌肌動蛋白(老鼠單株抗體)(1∶300)、鈣調節蛋白(老鼠單株抗體)(1∶250，DAKO，Carpinteria，CA，USA)。有關神經株系標記物，我們使用能辨識下列分子的抗體NF-200(老鼠單株抗體)(1∶400，Sigma)、-微管蛋白III(老鼠單株抗體)(1∶100，Sigma)、Gal-C(免子多株抗體)(1∶100，Sigma)、GFAP(山羊多株抗體)(1∶200，Santa-Cruz)。關于內胚層(肝細胞或其它內皮)株系標記物，我們使用CK18(老鼠單株抗體，1∶300)(Sigma)、α-胎兒蛋白(α-fetoprotein)(山羊多株抗體，1∶200)(Santa-Cruz)、白蛋白(老鼠單株抗體，1∶400)(Sigma)、HNF3.(山羊多株抗體，1∶100)(Santa-Cruz)、HNF1(免子多株抗體，1∶200)(Santa-Cruz)。有關心肌細胞標記物，使用能辨識下列分子的抗體cTn I(2種型式老鼠單株抗體與免子多株抗體，1∶100)(Chemicon，Temecular，CA)、心室肌凝蛋白重鏈α(α-MHC)(老鼠單株抗體，1∶100)(Chemicon)、α-肌小節肌動蛋白(選殖株EA-53，老鼠單株抗體，1∶200)(Sigma)、ANP(免子多株抗體)(Chemicon)。對照組老鼠、免子或山羊皆購自Sigma。抗老鼠、免子或山羊抗體的二級抗體(AMCA，1∶150，FITC or Cy-2，1∶200；Cy-3，1∶200)是購自JacksonImmunoresearch(West 10 Grove，PA)。
8.活體內實驗的研究設計所有程序是根據Caritas St.Elizabeth’s Institutional Animal Careand Use Committee而進行。替6至7周大的雌性經除毛大鼠(HsdRH-rnu大鼠，15 Harlan，Indianapolis，IN)進行外科手術，使其具急性心肌梗塞，接著立即在梗塞周圍區域的5處(前基位(basal anterior)、前中位(midanterior)、側中位(mid-lateral)、前頂位(apical anterior)、側頂位(apicallateral))給予總量為200微升的8×105hBMSC或8×105人類新鮮總骨髓細胞(TBMC)或PBS。隨意地安排使各群組有15只大鼠。培養前TBMCs的制備如同hBMSC一般。細胞移植中如先前所述，將hBMSC和TBMCs以碳青(carbocyanine)染色[Kalka，2000；Kawamoto，2001]。在隔離大鼠(n＝4，每一組群)的背部皮膚下植入微滲透幫浦(模型2ML4，Alzet，PaloAlto，CA)于手術后注入1.25毫克的BrdU/d(Sigma)(溶于以1∶1(體積/體積)混合的二甲基亞 與0.154莫耳濃度的NaCl)并于4周后犧牲{McEwan，1998}。為了TUNEL分析法與分子學的研究，將其它大鼠進行相似的手術，并于手術后1及2周后犧牲(n＝4，每一時間點)。手術后28天，使大鼠進行心臟超音波(Echo)與侵入性血循環動力測量。然后，將食鹽水灌注至大鼠的主動脈使其犧牲。于尸體解剖時，將大鼠的心臟從頂部至基部切成3個橫切面，以4％聚甲醛、甲醇或冷凍于OCT化合物而固定的，并切成5微米厚。
9.急性心肌梗塞模式如我們實驗室先前所述方法來誘發急性心肌梗塞的發生[Kawamoto，2003；Kawamoto，2001]。接著進行胸腔切開術，以及在心臟周圍切口處安置人造供氧器(模型683，Harvard Apparatus)，在靠近左前降(LAD)冠狀動脈源頭處以6-0 prolene縫線(Ethicon)將此冠狀動脈結扎。
10.心臟功能量測如先前方法{Kawamoto，2003}，以連接SONOS 5500(AgilentTechnologies，Andover，MA，USA)的6.0至15.0MHz超頻寬線型換能器進行經胸前超聲心動描記術、測量左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、心室短縮分率(FS)。所有測量值皆為至少3個連續心循環的平均值。利用心壁運動指數(WMSI)來評估局部的心壁運動異常{Oh JK，1999}。左心室心壁運動分析是根據個體部分的收縮階段。在此指數系統中，指數愈高代表心壁運動異常愈嚴重(1正常；2運動減退(hypokinesis)3運動不能(akinesis)；4運動困難(dyskinesis)；5動脈瘤(aneurismal))。將心壁運動指數的總合除以可見部分的總數得到WMSI；此WMSI代表局部的心壁運動異常程度。正常WMSI為1。為了量測血循環動力的變量，經由右頸動脈將1.4法國高保真壓力換能器(French high fidelity pressure transducer)(Micro-tip catheter，MillarInstrument，Houston，TX)導至左心室。待血循環動力穩定后，利用polygraph(模型7P)記錄LVSP、LVEDP、+dP/dt與-dP/dt(Grass Instrument，West Warwick，RI，USA)[Kawamoto，2001]。
11.心肌組織的免疫螢光組織化學以4％聚甲醛(PFA)使OCT嵌入的冷凍部分固定，并用于下述的免疫螢光組織化學。為了辨識內皮細胞，以經生物素連接的異凝集素B4(biotinylated isolectin B4)(1∶200；Vector)做為一級抗體，接著為鏈霉抗生物素-FITC(streptavidin-FITC)[Kawamoto，2001]。平滑肌細胞的辨識是藉由老鼠 -SMC抗體(Sigma，1∶200)接著再用經FITC接合的抗老鼠的山羊IgG(FITC-conjugated goat anti-mouse IgG)。心肌細胞的辨識是藉由抗cTnI與ANP的抗體，接著再用經FITC接合的抗免子的山羊IgG。
12.BrdU免疫組織化學與藉由TUNEL測定雕亡BrdU是以抗-BrdU的綿羊抗體(1∶50；Biodesign)，再用鏈霉抗生物素-FITC(streptavidin-FITC)(1∶100；Vector)予以測定。以DAPI進行抗核染。計數梗塞周圍區域的BrdU陽性細胞，其中該梗塞周圍區域包括可見視野的小于20％的結疤組織(x200放大率)。
如[Fujio，2000]所述，使用原位細胞偵測套組(Roche)以末端由去氧核酸基轉化 (TdT)所媒介的dUTP-生物素的缺口末端標記的方法(terminal deoxynucleotidyltransferase(nick end labeling(TUNEL))進行DNA片段的原位標記。2周后，在心肌區域進行TUNEL染色(n＝4，每次)。簡單地說，由20微克蛋白K所處理的區域。洗滌后，區域培育于與螢光dUTP混合的TdT溶液中。然后以DAPI抗染該區域以定位細胞核。為了測定心肌細胞或內皮細胞的雕亡細胞核的比率，以抗α-肌小節肌動蛋白(α-sarcomeric actin)或抗ILB4的單株抗體抗染該組織。以顯微鏡在x 200放大率下檢測該組織區域，在全部8個隨機視野(全總數～10,000細胞核)下檢測梗塞/梗塞周圍區域。此雕亡細胞的比例稱為雕亡指數(apoptotic index)。
13.RT-PCR的分析如先前所述{Yoon，2003}來進行RT-PCR的分析。根據操作手冊使用Rnaqueous套組(Ambion，Austin，Texas，USA)從經培養細胞或從心臟萃取全部的RNA。利用六聚物與Moloney鼠的白血病病毒反轉錄(Superscript II套組，Roche)使1微克的全部RNA進行反轉錄作用。使用Advantage cDNA polymerase mix(Clontech)or Taq聚合(Roche)將該反轉錄產物進行PCR。為了做半定量RT-PCR，根據GAPDH的表現來計算各基因mRNA表現的定量。PCR引子與接合(annealing)溫度的使用如表1所述。藉由代表分子量標記的梯狀帶為100bp的1.5％瓊脂糖(agarose gel)電泳(Life Technologies)來分析RT-PCR的產物，并以UV imagerEagle-Eye II(Stratagene)來定量。
14.心肌組織學與形態學的分析如先前所述{Kawamoto，2003；Kawamoto，2001}，將4周的樣品以抗CD31與抗H&E染的單株抗體染色后，計數微血管的密度與心肌細胞的密度。為了計數，隨機從梗塞/梗塞周圍區域選出清楚可見微血管和心肌細胞剖面的全部8個可見視野，在x 200放大率下計數微血管或心肌細胞的數目(n＝6，每個群組)。為了測定纖維化面積，如先前所述[Kawamoto，2001]，在以Masson’s trichrome(Sigma)染色后，測量所有組織區域的纖維化面積/左心室面積的平均比例。
15.統計上的分析藉由比較兩組群間所用的單方史都華檢定法(unpaired Student’s ttest)予以進行統計上的分析，接著用比較超過兩個以上組群所用的薛費氏檢定法(Scheffe’s post-hoc)進行變異數分析(ANOVA)。。P＜0.05是認為表示統計上的重要性。
16.聚合連鎖反應(PCR)引子下列表1顯示作為此處所揭示的實驗進行所用的寡核酸引子。”產物尺寸”是有關于經放大產物的所預期的尺寸(千堿基)。
表1.RT-PCR引子序列與所預期的產物尺寸


-f前置引子， -r反置引子補充資料第10圖.使用多表面抗原決定位置的FACS分析證實hBMSC中無CD117的表現至有最小的CD117的表現(＜1％)。MHC I類的ABC分子與MHC II類的DR分子為陰性，且而HSC標記物(CD34、CD133、Flk-1、Tie2)未表現。
下述參考資料1至80為全部的實時揭露文件，其內容合并于此以資參考。
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雖然本發明以特定的具體實例做為參考資料來描述，但本發明可在不背離本發明精神前提下進行修改與變化，本發明是以下述申請專利范圍定義。所有參考資料其內容合并于此以資參考。
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<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成引子
<400>62agcccttcca cgatgccaaa gttgt2權利要求
1.一種分離的骨髓干細胞，其通過標準細胞標記檢測分析法予以測定具有下列至少一種無法檢測到的或低水平的細胞標記物及優選為具有所有下列的細胞標記物CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct 4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI類受體和MHCII類受體。
2.如權利要求1所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞通過觀察檢測基本上呈圓形，且具有直徑為小于約25至35微米，優選為小于約15微米。
3.如權利要求1至2中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞具有的端粒限制片段長度(TRF)為小于約30至40千個堿基(kilobase)。
4.如權利要求1至3中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞基本上為整倍體。
5.如權利要求1至4中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞的整倍體在細胞培養中基本上維持至少約10代，優選為介于約20至約200代之間。
6.如權利要求1至5中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞通過標準EC分化分析法予以測定，在與EC促進條件接觸后形成內皮細胞(ECs)。
7.如權利要求6所述的分離的骨髓干細胞，其中該EC促進條件包括與血管內皮生長因子(VEGF)接觸。
8.如權利要求1至7中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞通過標準SMC分化分析法予以測定，在與SMC促進條件接觸后形成平滑肌細胞(SMCs)。
9.如權利要求8所述的分離的骨髓干細胞，其中該SMC促進條件包括與血小板衍生生長因子(PDGF)接觸。
10.如權利要求1至9中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞通過標準神經細胞分化分析法予以測定，在與神經細胞促進條件接觸后形成神經細胞。
11.如權利要求10所述的分離的骨髓干細胞，其中該神經細胞促進條件包括與肝細胞生長因子(HGF)接觸。
12.如權利要求11所述的分離的骨髓干細胞，其中該神經細胞促進條件進一步包括與成纖維細胞生長因子4(FGF-4)接觸。
13.如權利要求12所述的分離的骨髓干細胞，其中該神經細胞促進條件進一步包括與DMSO或醫藥上可接受的丁酸鹽接觸。
14.如權利要求1至12中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該細胞在與輔助心肌細胞(accessory cardiomyocyte)接觸后形成心肌細胞(cardiomyocyte)。
15.如權利要求14所述的分離的骨髓干細胞，其中該形成的至少一部份是與該細胞與該輔助心肌細胞間的融合相關。
16.如權利要求1至15中任一所述的分離的骨髓干細胞，其中該輔助心肌細胞維持于體外、活體外或活體內。
17.一種移植物，其包括如權利要求1至16中任一所述的至少一種分離的骨髓干細胞。
18.如權利要求17所述的移植物，其中該移植物進一步包括由該分離的骨髓細胞產生的心肌細胞。
19.如權利要求17至18中任一所述的移植物，其中該移植物進一步包括由該分離的骨髓細胞產生的ECs。
20.如權利要求17至19中任一所述的移植物，其中該移植物進一步包括由該分離的骨髓細胞產生的SMCs。
21.如權利要求17至20中任一所述的移植物，該移植物進一步包括來自受體的細胞，其中該受體細胞與該骨髓干細胞是哺乳動物的細胞。
22.如權利要求21所述的移植物，其中該受體細胞與該分離的骨髓干細胞是為同種異體的、自體的或同源的。
23.如權利要求17至22中任一所述的移植物，其中該移植物是維持于活體內或體外。
24.如權利要求18所述的移植物，其中由該骨髓細胞產生的心肌細胞表達CMC特定蛋白(cTnI)。
25.如權利要求19所述的移植物，其中由該骨髓細胞產生的ECs表達ILB-4。
26.如權利要求20所述的移植物，其中由該骨髓細胞產生的SMCs表達α-SMA。
27.一種細胞培養物、組織或器官，其包括如權利要求17至26中任一所述的移植物。
28.一種用于預防、治療或降低心臟疾病嚴重性的方法，該方法包括對需要治療的哺乳動物投予至少一種如權利要求1至16中任一所述的該分離骨髓干細胞與如權利要求17至26中任一所述的該移植物，其中該投予是足以預防、治療或降低哺乳動物該疾病的嚴重性。
29.如權利要求28所述的方法，其中該方法進一步包括在該哺乳動物體內培育該細胞或移植物至少一周。
30.如權利要求29所述的方法，其中在該哺乳動物體內的培育是介于約2周至8周間。
31.如權利要求28至30中任一所述的方法，其中該方法進一步包括對該哺乳動物投予至少一種血管新生因子。
32.如權利要求28至31中任一所述的方法，其中該方法進一步包括投予編碼至少一種血管新生因子或其功能性片段的至少一種核酸。
33.如權利要求28至32中任一所述的方法，其中該方法進一步包括對該哺乳動物投予內皮祖細胞(EPCs)。
34.如權利要求33所述的方法，其中該方法進一步包括從該哺乳動物分離該EPCs，并于活體外使該EPCs接觸至少一種血管新生因子。
35.如權利要求28至34中任一所述的方法，其中該心臟疾病是充血性心力衰竭(CHF)，缺血性心肌病變、心肌缺血或梗塞的一種或多種。
36.如權利要求28至35中任一所述的方法，其中該方法進一步包括監控哺乳動物的心臟功能。
37.如權利要求36所述的方法，其中該監控心臟功能是為超聲心動描記術、左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、心室短縮分率(fractional shortening，FS)、室壁運動指數(wall motion scoreindex，WMSI)與左心室收縮壓ILVSP)的至少一種。
38.一種用于預防、治療或降低心臟疾病嚴重性的醫藥產品，該產品包括下述成分的至少一種如權利要求1至16中任一所述的分離骨髓干細胞以及任選的用于從哺乳動物體內分離該細胞的說明書；如權利要求17至26中任一所述的移植物以及任選的用于制備、維持和/或使用該移植物的說明書；如權利要求24所述的細胞培養物、組織或器官以及任選的用于制備該細胞培養物、組織或器官的說明書。
39.如權利要求38所述的醫藥產品，其中該產品進一步包括至少一種血管新生因子或其功能性片段。
40.如權利要求38至39中任一所述的醫藥產品，其中該產品進一步包括編碼至少一種血管新生因子或其功能性片段的至少一種核酸。
41.一種由下述步驟所獲得的分離的骨髓細胞群a)收集來自哺乳動物的骨髓細胞，其細胞的尺寸小于約100微米，優選為小于約50微米，更優選為約40微米或40微米以下，b)在為貼壁細胞所選擇的條件下，將所收集的細胞于培養基中培養(增殖)，c)選擇貼壁細胞，并于培養基中增殖該細胞至半融合狀態，d)以調配好的培養基將該培養的細胞進行連續稀釋至孔室中，該稀釋足以產生小于約每孔室1個細胞的密度，以制得該增殖的細胞的克隆分離物，e)將各克隆分離物進行培養(增殖)，以及選擇具有產生分離骨髓細胞群的增殖細胞的孔室。
42.如權利要求40所述的分離的骨髓細胞群，其中該步驟進一步包括收集不表達可檢測水平的下列至少一種細胞標記物的細胞CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI類受體和MHCII類受體。
43.一種制備如權利要求1至16中任一所述的分離的骨髓細胞的方法，該方法包括a)收集來自哺乳動物的骨髓細胞，其細胞的尺寸小于約100微米，優選為小于約50微米，更優選為約40微米或40微米以下，b)在為貼壁細胞所選擇的條件下，將所收集的細胞在培養基中培養(增殖)，c)選擇貼壁細胞，并于培養基中增殖該細胞至半融合狀態，d)以調配好的培養基將該培養的細胞進行連續稀釋至孔室中，該稀釋足以產生小于每孔室1個細胞的密度，以制得該增殖的細胞的克隆分離物，e)將各克隆分離物進行培養(增殖)，以及選擇具有生成分離的骨髓細胞群的增殖細胞的孔室。
44.如權利要求43所述的方法，其進一步包括收集不表達可檢測水平的下列至少一種細胞標記物的細胞CD90、CD117、CD34、CD113、FLK-1、tie-2、Oct4，GATA-4、NKx2.5、Rex-1、CD105、CD117、CD133、MHCI類受體和MHCII類受體。
全文摘要
本發明是揭示一種分離的骨髓干細胞(BMSC)，其在包括內皮細胞、神經細胞與平滑肌細胞的該類型的受選細胞中具有無法偵測的含量或低含量，亦揭示包括該細胞的移植醫藥產物。亦提供產生該骨髓干細胞(SCs)的方法。本發明具有廣泛的實用性應用，包括應用于心血管疾病的預防與治療。
文檔編號A61K35/12GK101072867SQ200480039184
公開日2007年11月14日 申請日期2004年10月28日 優先權日2003年10月28日
發明者Y－s·允, D·W·洛索多 申請人:波士頓圣伊麗莎白博愛醫療中心