專利名稱：來自干細胞的血小板的制作方法
相關申請的交叉參考本申請要求2004年11月1日提交的美國臨時專利申請序列號60/623,922和2005年9月7日提交的序列號60/714,578的優先權。
關于聯邦政府資助的研究或開發的聲明待定。
背景技術：
干細胞定義為能夠分化為許多其它分化細胞類型的細胞。胚胎干細胞是來自胚胎的干細胞，能夠分化為成熟機體的大多數(如果不是全部)分化細胞類型。干細胞稱為多潛能，描述了這些細胞分化為許多細胞類型的能力。研究團體非常感興趣的一類多潛能干細胞是人胚胎干細胞，有時寫為hES或人ES細胞，即衍生自人胚胎來源的胚胎干細胞。科學研究對人胚胎干細胞很感興趣，因為這些細胞能夠在培養中無限增殖，并能分化為其它細胞類型，因此能夠(至少在原理上)提供細胞和組織來替代衰竭或缺陷的人組織。培養物的人胚胎干細胞可能提供無限量的有助于人類健康科學研究和各種治療方案的遺傳穩定性人細胞和組織。也考慮到，將來，可使人胚胎干細胞增殖和定向分化為特定譜系細胞，從而發育成為用于治療目的的移植或輸入人體的分化細胞或組織。
血小板是血液凝固所必需的血液組分。血小板是亞細胞血液組分，它沒有細胞核，但有細胞膜、受體、酶、顆粒和其它細胞成分，因此血液中血小板能夠對若干因子起反應而引起血凝塊的形成。當患者在戰場上發生大量外傷性失血、接觸化學品或受到高劑量輻射和發生各種其它醫學狀況，如血小板減少時，尤其是為治療白血病患者而清除骨髓后，需要進行血小板輸入。血小板的儲存壽命短(FDA和AABB規定一般僅5天)導致戰場上和民用衛生系統血小板短缺。
在目前出于醫學目的儲存的所有血液細胞組分中，血小板最脆弱。目前沒有臨床上可應用的方法長期儲存血小板。對于現代衛生機構而言，血小板儲存期為5天，留出測試和運輸時間后，轉換成臨床儲存期為3-4天。許多血庫在保持血小板新鮮和儲存方面有后勤困難。向軍用戰地醫院可靠地提供血小板的困難甚至更大。
在體內，血小板產生自稱為巨核細胞所形成的前體血小板加工。研究表明由成年小鼠和人的造血干細胞分化產生巨核細胞，但此分化的分子機制尚不明了。長期培養成年動物造血干細胞和巨核細胞很困難，這使得幾乎不可能對這些細胞的進行純化和遺傳學操作。不存在天然的人巨核細胞cDNA文庫，沒有可用的正常巨核細胞的遺傳分布狀況。已證明小鼠胚胎干細胞在體外能分化產生血小板，但仍未證明這些血小板具有生物學功能。人和小鼠血小板差異顯著。與人血小板相比，小鼠血小板較小，并顯示有更為顯著的顆粒異質性。人和小鼠巨核細胞釋放血小板的機制似乎顯著不同。
仍然明顯缺乏對血小板形成過程和血小板從巨核細胞出芽過程的理解。接受的論點是，諸因子的聯合作用，包括血漿和內皮結合的膜因子、巨核細胞細胞骨架或細胞器重排和血流造成的剪切力，綜合導致成熟血小板從巨核細胞上形成的前體血小板結構上分離下來。然而，此觀點未得到充分證明，血小板形成和從巨核細胞分離下來仍然是亟待揭示的研究領域。
發明概述本發明小結了產生人血小板的方法，其包括以下步驟在有利于人胚胎干細胞分化為造血譜系細胞的條件下培養人胚胎干細胞；培養造血譜系細胞成為巨核細胞；培養巨核細胞產生血小板；和回收血小板。
本發明也小結了以治療有效量體外產生所需量的人血小板。
本發明特征是體外產生的血小板不會結合人血流中所遭遇的因子。
通過以下說明書可以看出本發明的其它目的、特征和優點。
附圖
簡要說明無。
發明詳述本文考慮的是通過體外培養和從人胚胎干細胞開始分化的方法產生血小板。體外培養誘導人胚胎干細胞(hES細胞)產生巨核細胞，再培養這些巨核細胞產生有生物學功能的人血小板。認為該方法可通過三個主要步驟完成。第一個主要步驟是使人ES細胞定向分化為造血細胞，進而，可以幾種方式完成分化過程。本文詳細描述了使hES細胞分化為造血譜系細胞的兩種方法。在造血分化方法的一種技術中，采用目前已知的技術培養人胚胎干細胞(ES細胞)以形成胚狀體(embryoid body，EB)。培養該胚狀體，使其開始分化為各種分化細胞類型，然后使胚狀體解聚；用巨核細胞前體選擇性培養基配成細胞懸液。借助時程cDNA微陣列分析的幫助，我們確定了最優時機來收獲具有最高造血潛能的明確的造血細胞。已經證明足以產生造血細胞的其它技術要求人ES細胞接觸基質細胞，這種接觸能引起ES細胞優先分化為造血譜系的細胞。這些方法任一的結果是將細胞，主要是ES細胞衍生的造血細胞培養至某種純度。我們特別優選胚狀體方法，不僅因為它沒有各種類型的飼細胞的污染，而且可用成分明確的無血清培養基培養。在該方法的第二主要部分中，然后使這些造血細胞接觸含有生長因子的巨核細胞形成選擇培養基，所述生長因子能特異性促進巨核細胞形成和成熟。最后，使這些成熟的巨核細胞接觸血小板形成培養基，以促進體外血小板生產。在所有這些過程中，可避免采用動物或人的血清和血漿。
血小板是從hES細胞產生人用生物產品的示范性靶點，因為血小板不攜帶染色體遺傳物質。可認為血小板是母體巨核細胞的胞質片段。重要的是，血小板具有可導致粘附、凝集和顆粒分泌的細胞表面因子。由于血小板成熟過程和血小板從巨核細胞上脫落的過程都是了解甚少的過程，還不知道是否可從人ES細胞衍生的體外細胞培養物回收到有生物功能的血小板。本文揭示，可從這些細胞培養物回收有用量的血小板。
重要的是，本文也證明了經體外細胞培養的人巨核細胞能形成血小板并使其脫落。由于對此過程有關的詳細生物學機制的知識不確定，目前還不了解此過程會否或可否在培養物中發生。本文結果證明該過程可發生并確實發生。
該過程從hES細胞開始，hES細胞定義為培養中的未分化細胞。目前證明，可誘導hES細胞分化為主要是造血譜系細胞的細胞培養物。迄今為止的文獻中，已知有兩種不同技術能實現這種定向分化，也考慮了可能有效的其它技術。一種已知技術需要產生胚狀體，該胚狀體是具有三維結構的hES細胞的聚集體，該結構似乎有利于干細胞分化為定型的后代譜系。可用選擇性方案分離這些能產生各種譜系分化細胞的胚狀體中的某譜系細胞，如造血譜系細胞。我們進行的造血過程的詳細時程分析為我們提供了這些造血前體細胞的遺傳分布狀況，同時，我們優化了我們的方案而得到最高產率。其它已知技術包括hES細胞與人或非人基質細胞共同培養。與基質細胞的共同培養似乎也能誘導hES細胞主要產生造血細胞，但可能要對現有技術依據的某些培養條件尋求避免方法。
發現能提高各種造血譜系細胞產率的EB法中的中間步驟是使EB片段化。EB的特征之一是EB可生長得很大，以致于超過培養基通過擴散向中心細胞提供氧氣和營養物的能力。結果可能是EB中心產生壞死區域，這也引起EB細胞生長阻滯。現在發現，通過物理方法將EB切塊使EB片段化，可以重啟EB的生長，產生更多的分化細胞。我們了解，采用這種技術導致整個方法回收的血細胞數量顯著增加。可用各種機械裝置和系統進行EB的片段化或切塊加工。
一旦造血譜系細胞產生后，培養細胞，以優先產生巨核細胞。優先產生巨核細胞的培養條件將提高培養物中巨核細胞相對于其它血液產品前體細胞的比例，但此方法不是絕對需要的。有利于產生未成熟和成熟的巨核細胞的條件包括用血小板生成素(TPO)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)和干細胞因子培養前體細胞培養物。如果存在bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)，則可進一步擴增未成熟的巨核細胞。用此方法獲得的巨核細胞是CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD62P、CD38、弱CD45陽性，但是HLA-DR、CD34、CD117陰性的細胞。正常的成熟巨核細胞這種免疫表型分布恒定。沒有顯著的CD45+細胞群說明，白細胞污染非常少(如果存在)。
然后通過培養使巨核細胞形成和釋放血小板。雖然不完全了解引起血小板體內釋放的確切機制，但可通過細胞培養使母體巨核細胞釋放血小板。有四種因素可能非常重要，即剪切力、巨核細胞-內皮細胞相互作用、血漿因子、最后是巨核細胞中的分子機制。可通過物理操作培養容器例如振蕩、旋轉或類似方法激發對血液的剪切力。血漿蛋白和血小板受體激活的釋放作用可能是通過巨核細胞本身的激活，或者按需單獨添加其它因子。在某些先天性血小板異常如伯-索病和馮維樂布蘭德因子(VWF)病曾報導觀察到大的血小板。我們在一些胚狀體衍生的血小板中觀察到一些相似的大血小板。如果觀察到這種現象，則是因為缺少血漿因子如VWF引起前體血小板無效地收聚血小板，可通過僅加入VWF或加入含有VWF的血漿解決這一問題。假定cGMP可促進從新生巨核細胞形成血小板。cGMP可用一氧化氮激活。我們發現，加入一氧化氮釋放化合物GNSO可在2小時內使巨核細胞快速片段化為小血小板樣顆粒。最后，此過程的副產物是相對純的內皮細胞。我們通過試驗測定，內皮細胞是否能幫助血小板脫落。通過所有這些技術，我們顯著提高血小板形成的效率和規律性。為了理解血小板的生物學機制，我們建立了3D實時熒光顯微術來記錄存在或不存在血漿時血小板的釋放。我們能夠記錄前體血小板的3D圖像，目前我們正在進行時間推移研究，以更好地監測此過程。
然后，收集和包裝血小板。在第12天巨核細胞分化末期，將非粘附性巨核細胞轉移到裝有3μM孔徑濾器的多孔板的上部孔中。在培養箱中孵育，溫和振蕩并加入GNSO。在下室中收集血小板(如果需要存在人血漿或生理濃度的VWF和纖維蛋白原)。依次離心純化從這種體外系統分離得到的血小板，重懸于檸檬酸鹽緩沖液，用作供體血小板。進一步低速離心(3000g 30分鐘)收集的血小板，以分離其它碎片，然后通過合適孔徑的濾器過濾，以去除任何有核細胞。如此產生的含有血小板的產品特征是可將血小板濃縮至任何所需濃度。可進一步純化體外產生的血小板，成為無血清或無血漿的產品，以適合具體的臨床需要。可以并應該對所有容器進行滅菌以降低細菌污染，這是常規來源供體血小板的共同問題。
如此從體外細胞培養產生的血小板不同于目前科學研究或醫療所用的血小板，因為這些血小板不曾接觸過血流。在生物體內產生的血小板不能完全與血漿分離。結果是，目前醫用的包裝血小板常常攜帶少量白細胞和血漿污染物，這些污染物可在一些患者中引起輸血反應。此體外系統從人ES細胞分化產生的血小板將不含白細胞，并且從未接觸過血清或血漿。如果培養或分離過程中加入過纖維蛋白原或VWF，此體外系統產生的血小板僅攜帶纖維蛋白原或VWF。
相關的問題是，一些免疫球蛋白自發性地粘附于血小板。因此，從獻血員分離的血小板不可避免地攜帶該獻血員的免疫球蛋白分子，這是產生副反應的另一個可能的原因。在體外從ES細胞產生的血小板不曾接觸過IgG，因此不含它們。″ABO″血型抗原也出現在血小板上，雖然很弱。仍不了解血小板輸注時偶然發生的ABO血型反應是源自血小板或是源自血清污染物。血小板中不存在Rh因子。因此，此法產生的血小板更適合醫學和科學應用，也不難與常規分離技術產生的血小板相區分。
實施例胚狀體的造血前體細胞胚狀體(EB)形成是用于研究小鼠和人ES細胞的造血分化的一種方法。然而，不像小鼠ES細胞那樣，人ES細胞的單細胞懸液不能有效形成胚狀體。但是，為了由人ES細胞形成胚狀體，用0.5mg/ml分散酶消化小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上培養的人ES細胞的完整集落5分鐘，形成小細胞集落。然后在含血清的干細胞培養基(20％FCS)中使這些細胞集落進一步凝集。容易區分的細胞團塊與不參與形成細胞團塊而凋亡的單個細胞一起培養6天后，開始形成胚狀體。培養12天后，胚狀體組裝成早期卵黃囊胚胎結構。制作該胚狀體的切片隨后用CD34抗體免疫標記該切片顯示有卵黃囊的組織學特征。發現非粘附性造血前體細胞存在于小血管和內皮襯里的內腔中，顯示這些細胞為CD34陽性細胞。然后，用37℃胰蛋白酶消化(0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA)處理胚狀體。將約105含有原代造血前體細胞的胚狀體衍生細胞接種于甲基纖維素培養基(Stem Cell Inc.Canada)培養10-12天。然后通過天然紅色或用單克隆抗-CD41或CD61抗體作免疫標記檢測紅細胞和巨核細胞集落形成單位(CFU)。第12天該明確的造血前體細胞形成了巨噬細胞和粒細胞集落。此活性代表第一波原代和明確的造血過程。我們現在建立了不含動物和人血清的無血清胚狀體培養體系。
胚狀體-衍生的巨核細胞前體的體外擴增形成和培養胚狀體12天后，37℃用膠原酶(1mg/ml)處理30分鐘和用胰蛋白酶(0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA)消化5分鐘得到的細胞培養物制備單細胞懸液。將CD34+細胞與其它EB細胞分離，因為它們可能干擾造血過程。在血小板生成素(TPO)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)和干細胞因子(SCF)的存在下在聚-HEME表面上培養CD34+細胞，選擇的所有因子能特異性促進巨核細胞分化和增殖。每106初始ES細胞獲得106個CD41+巨核細胞的產量(n＝6)。有趣的是，接種于膠原半固體基質時，這些巨核細胞形成極長的突起，其中珠樣結構代表前體血小板。當嘗試用成人造血干細胞或小鼠ES細胞來產生巨核細胞時，沒有報道過這種長結構。檢測到鑒定為釋放的血小板的小CD41陽性細胞片段接近巨核細胞(所產生的)。通過流式細胞術，我們發現這些巨核細胞是CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱)和CD62P陽性，但是CD34、CD117和HLA-DR陰性的細胞。此表型特征與正常的人成熟巨核細胞一致。
在基質層上人ES細胞分化為巨核細胞OP9基質細胞系是由新生顱蓋op/op缺陷型小鼠建立的細胞系，用于支持小鼠造血。op/op小鼠的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)基因的編碼區中有一突變。用OP9系統使人ES細胞分化為造血譜系細胞的結果類似于通過胚狀體形成分化人ES細胞的方法，但基質細胞法通常可產生較高產量的更成熟的前體細胞。簡要說，將人ES細胞接種于匯合的OP9基質細胞，然后用補充有20％胎牛血清(FBS)的α-MEM培養基培養。在六孔板中以每孔105個ES細胞或在10cm2培養皿中以8×105個細胞開始分化。培養6天后，ES細胞分化為造血祖細胞，細胞顯示為CD34+細胞表面標記陽性。為了分化為巨核細胞，在第6天用胰蛋白酶處理細胞(0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDTA，37℃/5％CO2)5分鐘，然后轉移到含10ng/ml TPO的相同培養基中的新鮮匯合OP9細胞上傳代。再培養8天后，目測觀察到開始出現巨核細胞。通過CD41免疫染色確認，培養物上清中約30％細胞是巨核細胞。這些巨核細胞是多核細胞，但沒有胚狀體-衍生巨核細胞中觀察到的顯著的長突起。認為這些巨核細胞是確定的巨核細胞很像成人巨核細胞。有趣的是，在培養期間，沒有血小板形成的跡象，這與鼠系統很不相同。可能OP9細胞可促進和支持巨核細胞的分化和增殖，但不能支持血小板形成。這說明，小鼠和人的血小板形成機制不同，即使巨核細胞分化和增殖的一些機制相似。
巨核細胞增殖、成熟和純化上述方法產生的前體巨核細胞顯示能夠增殖，甚至移植入受者成年小鼠。該方法的下一個步驟是，我們采用bFGF進一步增殖不成熟的巨核細胞，同時阻止巨核細胞成熟。預計各巨核細胞可產生2000個血小板，106個人ES細胞(一個6孔板)會產生106個巨核細胞，隨后產生約2×109個血小板，這代表約1/20個血小板單位(每單位＞5.5×1010個血小板)。因此，以此預計效率，制備1單位人血小板將需要20個T75培養瓶的人ES細胞。此產量在經濟上可能有或沒有吸引力，但這顯然在一個技術人員可以提供的范圍內。
定向分化的其它技術胚狀體系統產生造血干細胞的效率低于所需效率，這是由于大部分細胞是卵黃囊細胞。然而，此系統優于OP9共培養系統，因為胚狀體系統沒有鼠蛋白污染。通過我們的數據，我們相信與用基質細胞的共同培養系統相反，EB系統的造血分化仍最好。為了得到更確定的造血細胞并使該方法更有效率，我們計劃延長EB培養。我們嘗試用機械方法使EB分解或片段化成較小片段，并且繼續培養，希望這種微環境將繼續支持血島分化。我們的初步觀察提示，分解后的EB可以存活并繼續生長。這是第一次嘗試在EB系統中進行分化。即使沒有形成明確的血島，也可實現血島數量的顯著增加。也測試了在EB培養物中加入生長因子如VEGF和SCF。
促進血小板釋放和成熟雖然我們已經在多種系統，包括膠原基質、OP9和聚HEME中觀察到血小板形成，但我們想要更好地理解血小板釋放的機制，以便優化該方法。為了實現血小板形成，我們在TPO、人血漿、人冷沉淀蛋白質和一氧化氮的存在下培養103～104個成熟巨核細胞。用抗-CD41抗體標記血小板，并用流式細胞術計數。通過顯微術包括電子顯微鏡術檢測血小板形狀。真正的血小板應該是扁圓形，無突起或粘附于其它血小板。(出現)較大或連接的血小板說明所用的不是僅支持前體血小板形成的最優條件。據證明，胞外基質如纖維蛋白原和纖連蛋白能促進巨核細胞增殖和成熟。我們采用纖維蛋白原和纖連蛋白包被的平板培養巨核細胞，以測定它們對巨核細胞增殖和分化的影響。
測試血小板血小板在對凝血酶、ADP和膠原反應時發生凝集。用凝集計(Chrono-logCorporation，www.chronolog.com)測定體外產生的血小板對不同刺激反應時凝集的能力。從上清中收獲血小板并計數。用PBS洗滌106/ml個血小板，并重懸于人血漿。加入不同濃度的凝血酶、ADP和膠原，將凝集動力學與天然人血小板作比較。我們測試用0.5U/ml凝血酶可激活所產生的″血小板″和成熟的巨核細胞，它們表面表達α-顆粒釋放的間接標記物CD62P。我們正在通過以下方法測試血小板的功能致密核心顆粒釋放。先用緩沖液A(120mmol/L谷氨酸鈉，5mmol/L谷氨酸鉀，20mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，2.5mmoL EDTA，2.5mmol/L EGTA，3.15mmol/LMgCl2和1mmol/L DTT)配制的[3H]5-HT(5-羥色胺)標記106個培養的人血小板等份。用緩沖液A洗滌血小板，然后用1單位凝血酶活化。將樣品放在冰上4分鐘終止該反應，然后13,000g離心1分鐘。收集上清，進行如下測定。通過閃爍計數測定[3H]5-HT的釋放。也可用能同時測定凝集和致密核心顆粒的ATP分泌的光照凝集計(ChronologCorporation)評價致密核心顆粒釋放的動力學。
α-顆粒分泌通過流式細胞術用藻紅蛋白-偶聯的抗-CD62抗體AC 1.2(BectonDickinson)測定P-選擇素表達監測此試驗。一般將2.5μl固定血小板(109/ml)加入97.5μl抗體溶液中。15分鐘后，用1ml含有0.35％BSA的Tyrode緩沖液稀釋樣品并分析。可計算P-選擇素表達增加的百分數，并與人天然血小板作比較。
溶酶體釋放按照Holmsen和Dangelmaier所述方法測定氨基己糖苷酶。混合5ml檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，pH4.5和2.5ml10mmol/L底物(P-硝基苯基-N-乙酰-D-氨基葡糖苷)，分成等份(100μL)加入96孔板，加入5μL反應上清。37℃孵育18小時后，加入60μL 0.08N NaOH以終止該反應。在裝有405-nm濾光片的ELISA平板閱讀器上讀出吸光值。
用這些測試確立了由人胚胎干細胞產生的血小板的生物學活性。該體外血小板產生系統產生的血小板在功能上類似于人體的正常血小板。然而，體外產生和成熟時，所產生的血小板不難與血液產生的人血小板相區分，因為此方法產生的血小板從未接觸，至少在產生過程中從未接觸過人血。因此，此血小板不會粘附有正常血清因子，如纖維蛋白原、血凝因子V和VWF，而通常情況下，血小板在體內釋放入血流后，會捕獲這些因子。這是假設沒有將顯著量的這些因子加入培養物中，但有的情況下可能加入VWF以促進血小板分離，當然在輸送給患者后，這種血小板會立即從受者血流中捕獲這些因子。
序列表無。
(按照條約第19條的修改)1.一種產生人血小板的方法，所述方法包括以下步驟(a)在有利于人胚胎干細胞分化為造血譜系細胞的條件下培養人胚胎干細胞；(b)將所述造血譜系細胞培養為巨核細胞；(c)培養所述巨核細胞以產生血小板；和(d)回收從所述巨核細胞分離的血小板。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過促進胚狀體的形成、然后從所述胚狀體選擇性回收造血細胞實施步驟(a)。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過將所述人胚胎干細胞與基質細胞共同培養實施步驟(a)。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過用含有血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素11和干細胞因子的培養基培養步驟(a)的細胞實施步驟(b)。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨核細胞對CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱)和CD62P呈陽性，但對CD34、CD117和HLA-DR呈陰性。
6.一種用權利要求1所述方法產生的人血小板。
7.如權利要求8所述的人血小板，其特征在于，所述血小板不含免疫球蛋白分子。
8.一種體外培養產生的人血小板，所述血小板具有啟動凝集的生物活性，所述血小板基本不含血液抗原和血清成分。
9.一種人血小板等分部分，其包含未粘附免疫球蛋白的功能性人血小板。
權利要求
1.一種產生人血小板的方法，所述方法包括以下步驟(a)在有利于人胚胎干細胞分化為造血譜系細胞的條件下培養人胚胎干細胞；(b)將所述造血譜系細胞培養為巨核細胞；(c)培養所述巨核細胞以產生血小板；和(d)回收從所述巨核細胞分離的血小板。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過促進胚狀體的形成、然后從所述胚狀體選擇性回收造血細胞實施步驟(a)。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過將所述人胚胎干細胞與基質細胞共同培養實施步驟(a)。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過用含有血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素11和干細胞因子的培養基培養步驟(a)的細胞實施步驟(b)。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨核細胞對CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD38、CD45(弱)和CD62P呈陽性，但對CD34、CD117和HLA-DR呈陰性。
6.一種用權利要求1所述方法產生的人血小板。
7.如權利要求8所述的人血小板，其特征在于，所述血小板不含免疫球蛋白分子。
8.一種體外培養產生的人血小板，所述血小板具有啟動凝集的生物活性，所述血小板基本不含血液抗原、白細胞和血清成分。
9.一種人血小板等分部分，其包含未粘附免疫球蛋白的功能性人血小板。
全文摘要
誘導人胚胎干細胞先分化為造血譜系細胞，然后分化為巨核細胞產生血小板。適當地體外培養巨核細胞導致血小板產生和脫落。使得可能第一次在體外產生許多患者需要的人血因子。
文檔編號C12N5/06GK101052710SQ200580037818
公開日2007年10月10日 申請日期2005年10月31日 優先權日2004年11月1日
發明者J·A·托馬森, D·陳 申請人:威斯康星校友研究基金會