人臍帶間充質干細胞與羊膜構建細胞移植片的方法

人臍帶間充質干細胞與羊膜構建細胞移植片的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及人臍帶間充質干細胞與羊膜構建細胞移植片 的方法。
【背景技術】
[0002] 干細胞是一類具有不同分化潛能，并在非分化狀態下自我更新的細胞。干細胞治 療是指應用人自體或異體來源的干細胞經體外操作后輸入(或植入)人體，用于疾病治療的 過程。用于細胞治療的干細胞主要包括成體干細胞、胚胎干細胞及誘導的多能性干細胞。目 前國內外已開展了多項干細胞臨床應用研究，涉及多種干細胞類型及多種疾病類型。主要 疾病類型包括骨關節疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應(GVHD)、脊髓損傷及退行性神經系 統疾病、眼表疾病和糖尿病等。其中許多干細胞類型，是從骨髓、脂肪組織、臍帶血、臍帶或 胎盤組織來源的間充質干細胞，它們具有一定的多向分化潛能及抗炎和免疫調控能力等。 羊膜在一百多年前就作為一種敷料應用于外科，上世紀初作為一種供體材料應用于外 科皮膚移植手術中。羊膜是胎盤的最內層，光滑，無血管、神經及淋巴，具有一定的彈性。羊 膜具有減輕炎癥程度、縮短炎癥持續時間、抑制新生血管形成和抑制纖維化、減輕瘢痕形成 的功能。臨床上利用羊膜具有促進上皮粘附生長及增殖、減輕炎癥、抑制新生血管形成、減 少瘢痕增生、抗粘連等特性而把其應用于嚴重急性期或陳舊性眼表燒傷的治療中去，獲得 了很好的臨床效果。
[0003] 目前，干細胞的臨床主要應用途徑有靜脈回輸、病變部位注射、腰椎穿刺注射、導 管介入等，但是對于一些疾病，如角膜緣干細胞缺乏、骨關節疾病、子宮內膜黏連等需要干 細胞在特定位置發揮作用的時候，這些應用途徑效果欠佳。臨床治療這些疾病時需要將干 細胞固定于病變部位使其發揮作用，而且固定干細胞的附著物需不產生排斥反應并能夠自 行降解。本發明就是為解決這一問題而進行研究的。

【發明內容】

[0004] 綜上所述，為了克服現有技術問題的不足，本發明提供了一種使用人臍帶間充質 干細胞與人源羊膜構建細胞移植片的方法。人臍帶間充質干細胞英文名稱是:hUC-MSCs，本 發明將人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)接種于羊膜上，使其能夠在特定部位進行損傷修 復，彌補了單獨使用hUC-MSCs或者羊膜治療的不足，為一些難治性疾病提供了新的治療策 略，也為干細胞的臨床應用開辟了新的治療途徑。
[0005] 為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為： 一種使用人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)和人源羊膜構建細胞移植片的方法，它包括 如下步驟： (1) 取新鮮采集的人羊膜和臍帶，清洗后將臍帶放入生理鹽水中浸泡備用； (2) 羊膜處理:先將清洗干凈的羊膜鈍性分離掉絨毛膜，再使用生理鹽水濕潤紗布將羊 膜擦拭干凈，然后將羊膜浸泡入含青霉素 50~200U/ml和硫酸鏈霉素 50~200U/ml的生理鹽 水中浸泡0.5~1個小時后，放入無菌甘油中在2~8°C脫水，脫水時間不超過12小時，再轉入 無菌甘油中在-20 °C保存備用； (3) 將步驟(1)浸泡好的臍帶剪成1~2cm長度的小段，清洗，然后將臍帶組織轉移至培 養皿中，培養皿中加生理鹽水至淹沒臍帶組織1/2處;將臍帶一端沿靜脈血管平行方向剪 口，用組織鑷沿切口方向靜脈血管邊緣縱向撕開，將1根靜脈血管和兩根動脈血管剖離，用 組織鑷去除羊膜，撕取華通氏膠，置于加有生理鹽水的離心管中； (4) 將華通氏膠，用生理鹽水充分洗滌，然后剪碎至1~3 mm >大小，將剪碎的組織塊 均勻放置到無菌培養皿上，鋪平，沿培養皿邊緣緩慢加入5~10ml培養液，置于37 °C、飽和濕 度、體積分數為5%的C0:2孵箱中培養，每三天更換一次培養液，培養15~20天后，直至觀察 到皿底上形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得原代hUC-MSCs; (5) 將培養液完全移出，向原代hUC-MSCs培養皿中加入質量百分比為0.05~0.25%的 胰酶1~3ml，放入37°C培養箱中消化，當觀察到貼壁細胞圓縮，且已經脫離瓶底后，加入5~ 10ml培養液終止消化，將懸液移至離心管中，離心棄上清，離心管中加入新培養液，反復吹 打至其分散為單個細胞懸液，再把細胞懸液調節成4000~6000個細胞/cm 2體系接種于培養 瓶中置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的孵箱中繼續培養，每3~4天更換培養液一次，至 融合度達80~90%，即得hUC-MSCs，將細胞收獲后凍存備用； (6) 取步驟(2)中凍存的羊膜，放入無菌生理鹽水中水化10~30分鐘，將水化好的羊膜 移至無囷培養皿中備用； (7) 將步驟(6)制備的羊膜平鋪于羊膜載體套環上，然后移入無菌培養皿中，放入37°C 的C0:3孵箱中待用； (8) 將凍存的hUC-MSCs復蘇，將細胞密度調節至4000~6000個細胞/cm2體系接種于用 步驟(6 )的培養皿中，置于37 °C、飽和濕度、體積分數為5 %的C(b孵箱中培養3~5天后，細 胞融合度達80~90 %即得細胞移植片。
[0006] 進一步，所述的步驟（1)中含青霉素50~200U/ml和硫酸鏈霉素50~200U/ml的生 理鹽水是將注射用青霉素、硫酸鏈霉素按照濃度比1:1溶解入0.9%的氯化鈉注射液中得到 的。
[0007] 進一步，所述的步驟(1)、（2)和步驟(3)中的清洗均為0.9%的氯化鈉注射液清洗。 [0008] 進一步，所述的步驟(4)中的培養液為DMEM/F12培養液(購自Gibco公司）加入10~ 20%的胎牛血清所得。
[0009] 本發明的流式表型檢測包括以下步驟： ①取四根流式管，分別標記為分離傳代細胞樣本管1和分離傳代細胞樣本管2;細胞移 植片上消化下來細胞樣本管3和細胞移植片上消化下來細胞樣本管4。
[0010] ②分別將相同量的步驟(5)中分離傳代細胞和步驟(8)細胞移植片上消化下來的 細胞(有核細胞數2_5*105個)加入到相對應標記的各流式管中，不可粘到管壁。
[0011] ③分離傳代細胞樣本管1加入CD34-FITC、CD29-PE、CD45-percp、CD44-APC;分離傳 代細胞樣本管2加入CD105-PE、CD45-percp、HLA_DR-APC;細胞移植片上消化下來細胞樣本 管3加入CD34-FITC、CD29-PE、CD45-percp、CD44-APC ;細胞移植片上消化下來細胞樣本管4 加入 CD 105-PE、CD45-per cp、HLA_DR-APC 各 5u 1，混勻。
[0012] ④室溫避光放置15分鐘，加入2mlPBS/管，1400rpm/min，離心5min。
[0013] ⑤棄上清，將管內細胞彈起，加入0.5mlPBS，混勻，上機檢測。
[0014] ⑥上機檢測結果得:CD29、CD44、CD105表達率大于95%，為陽性；CD34、CD45、HLA-DR表達率小于2%，為陰性。
[0015] ⑦上述說明：按照制備方法分離得到的hUC-MSCs與接種于羊膜后的干細胞滿足 CD29、CD44、CD105表達率大于95%，為陽性；CD34、CD45、HLA-DR表達率小于2%，為陰性的 結果，經鑒定為間充質干細胞。
[0016] 本發明的無菌檢測是取步驟(8)細胞移植片培養皿中的培養液作為供試品，取硫 乙醇酸鹽培養基6支、胰酪大豆胨液體培養基4支(每支培養基量均為15毫升）。6支硫乙醇酸 鹽培養基中4支分別接種lml供試品，剩余兩支1支接種不小于lOOcfu金黃色葡萄球菌做陽 性對照，1支做陰性對照。4支胰酪大豆胨培養基中兩支分別接種lml供試品，剩余兩支1支接 種不小于lOOcfu白色念珠菌，1支做陰性對照。接種供試品的4支硫乙醇酸鹽流體培養基的 容器分兩支置于30~35° C培養，兩支置于20~25° C培養，陽性對照和陰性對照置于30~35° C培養。胰酪大豆胨培養基4支全部置于20~25° C培養。培養時間為14天。培養期間應逐日觀 察并記錄是否有菌生長。陽性對照在24小時內應有菌生長，樣品管沒有細菌及真菌生長。 (無菌檢測中的硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨培養基均按照《中華人民共和國藥典》 2015版配制）。
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