專利名稱：序列號21的生物活性肽在制備用于防止或治療關節炎的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療關節炎的藥物，尤其是治療類風濕性關節炎的藥物。
背景技術：
類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis，簡稱RA)是一種常見的嚴重危害人類身體健康的自身免疫性疾病，在歐美國家白人的患病率為1％-2％，在我國平均為0.32％-0.34％，以此推斷全國患者數達400萬人。RA是關節的一種慢性炎癥性破壞性疾病，其發病機理至今未明。該病對關節的損傷很大，造成關節的畸形，肢體活動障礙，是我國人群喪失勞動力的主要原因之一。
RA的治療藥物眾多，但臨床效果都不甚滿意。非甾體類抗炎藥物療效有限，改變病情的抗類風濕藥物如環孢素、霉酚酸、糖皮質激素等均有嚴重的不良反應，特別對一些慢性炎癥需長期服用者，其中可導致胃潰瘍、腎功能降低和對骨髓的影響。而近年來研制的一些生物制劑如TNF-α拮抗劑etanercept及infliximab，IL-1受體拮抗劑anakinra在臨床上顯示了一定的效果，但價格昂貴，體內不穩定，且有嚴重的免疫原性。因此，開拓新的領域，尋找新型高效低毒的抗類風濕的藥物是藥物研究的迫切任務。
作為治療用途的小分子多肽越來越受到人們的重視，小分子多肽類藥物的優點是分子量小，無免疫原性，比較安全，結構相對比較簡單，功能較明確，特異性強，副作用小，因而成為新藥研究的理想起點。目前國內外對于小分子多肽治療類風濕性關節炎的研究已取得的一些成就，如利用噬菌體肽庫篩選出來能與TNF-α結合并能阻斷TNF-α生物活性的12肽(劉新平，張曉光，韓炯.噬菌體肽庫展示的小肽序列差異對腫瘤壞死因子α誘導的細胞毒作用的影響.[J]中華風濕病雜志，2001，5(3)142-145)，從峰毒中提取的峰毒多肽BV I-H(朱偉，王本祥，朱訊.蜂毒新多肽部位BV I-2H的分離純化及其生物學活性[J].科技通報，2002，47(3)198-203)、P肽(余曉東.蜂毒P肽對大鼠佐劑性關節炎的抑制作用[J].重慶醫學，2002，31(12)1191-1192)、蜂毒肽(李亞非，時述山，李欣.純化蜂毒肽對兔免疫性關節炎的抑制作用[J].中國風濕病學雜志，2000，4(5)293-295)，腦腸肽八肽膽囊收縮素(趙占勝，金玉懷，徐錦榮et al.八肽膽囊收縮素對大鼠滑膜細胞株RSC-364分泌IL-6的影響[J].基礎醫學與臨床，2003，23(1)85-88)、血管活性腸肽(TajebaY，Suzuki N，Kaneko A et al.Evidence for neural regulation odinflammatory synovial cell function by secreting calcitoningene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patientswith rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum，1999，422418-2428)，及一些抗血管形成、抗粘附的分子模擬肽，T細胞的肽疫苗(Moreland LW，Heck LWJr，Koopman WJ et al.V beta 17 T cell receptor peptide vaccination inrheumatoid arthritisresults of phase I dose escalation study.JRheumatol.1996，231353-62)等。
本發明的申請人在中國專利公開號為1398882、發明名稱為“序列號21的生物活性肽”的專利申請中公開了肽序列為Phe Glu Glu Met的四肽化合物(即序列號21的生物活性肽，以下簡稱CMS030。)，CMS030的前期工作結果顯示其具有免疫抑制作用，但目前仍未見有將CMS030用于制備防止或治療關節炎的藥物應用的報道。
發明內容
本發明的目的是提供序列號21的生物活性肽在制備用于防治或治療關節炎的藥物中的用途。
根據本發明的實施方案(實施例)所建立的抗炎抗類風濕藥物研究的常用模型——AA大鼠動物模型試驗，本發明提供了序列號21的生物活性肽在制備用于防治或治療關節炎的藥物中的用途。
所述關節炎為類風濕性關節炎。
下面通過實施例對本發明作進一步詳細的說明具體實施方式
生物活性肽化合物CMS030對大鼠佐劑性關節炎治療作用
材料與方法1.1材料1.1.1藥物CMS030深圳市康哲藥業有限公司，用生理鹽水稀釋到所需濃度；環孢素A諾華制藥有限公司，批號S15500，用少量無水乙醇溶解后加入橄欖油配成所需的濃度。
1.1.2試劑卡介苗衛生部北京生物制品研究所，批號20030115；羊毛脂、石蠟油天津市化學試劑六廠三分廠；胎牛血清、RPMI-1640、Hanks’液GIBCO公司；MTTSigma公司，批號61K5318；ConASigma公司，批號PR0080-2；LPSSigma公司，批號110K4046；IL-1β檢測試劑盒R&D Systems.Inc，批號213634；TNF-α檢測試劑盒R&D Systems.Inc，批號220346。
1.1.3儀器電子分析天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Olympus CK2型倒置顯微鏡Olympus Optical Co.Ltd.JAPAN；MODEL 302型CO2孵育箱National Appliance Company，USA；ALISEI隨機型全自動酶標板分析儀意大利RAPIM集團。
1.1.4實驗動物Wistar大鼠，雄性，SPF級，體重180±20g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證編號0031841。
1.2方法1.2.1制備弗氏完全佐劑(張麗麗，宋丹青，胡志君et al.新型免疫抑制劑來氟米特藥效學研究[J].中國抗生素雜志，2001，25(3)210-213)將卡介苗干粉于60℃水浴滅活1小時。羊毛脂∶液體石蠟(1∶2)加熱混勻，10磅高壓滅菌15分鐘。將卡介苗溶于生理鹽水中與前者等量研磨混勻，使卡介苗的最終含量為10mg/ml。將研磨后的混合物置于玻璃注射器中，另取一只注射器，中間用膠管連接，來回推拉，充分乳化，至滴入水中不立即散開，置于4℃冰箱保存備用。
1.2.2建立AA大鼠佐劑性關節炎模型除正常對照組11只大鼠外，其余每只大鼠右后足趾皮內注射弗氏完全佐劑0.1ml致炎。
1.2.3實驗動物分組及給藥造模后第十天隨機分組給藥，CMS 030高劑量組(給藥劑量為20μg·kg-1·d-1)，中劑量組(給藥劑量為10μg·kg-1·d-1)，低劑量組(給藥劑量為2μg·kg-1·d-1)，腹腔注射給藥1ml/d，同時灌胃橄欖油1ml/d；環孢素組(給藥劑量10mg·kg-1·d-1)，灌胃給藥，1ml/d，同時腹腔注射生理鹽水，1ml/d；模型對照組、正常對照組均灌胃橄欖油1ml/d，腹腔注射生理鹽水1ml/d，每日一次，連續給藥26天。
1.2.4CMS030對AA大鼠踝關節腫脹程度的作用于給藥當天用游標卡尺開始測量每只鼠左后及右后踝關節的周長，先用線繩環繞關節一周測得一個數值，減去線繩的初長度即為踝關節的周長，每隔三天測量一次。
1.2.5CMS030對AA大鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1β、TNF-α的影響于給藥結束后次日，脫臼處死各組大鼠，用含2％血清的Hanks’液沖洗腹腔巨噬細胞，調細胞數為2×106個/ml，加入到24孔板中，貼壁24h后加入LPS(終濃度為10μg/ml)刺激48h后取上清，用ELISA試劑盒檢測IL-1β、TNF-α。
1.2.6CMS030對AA大鼠T淋巴細胞增殖反應的影響各組大鼠收集腹腔巨噬細胞后無菌分離脾臟，制成脾細胞懸液，調細胞濃度為4×106個/ml，加入到96孔板中，同時加入ConA(終濃度為5μg/ml)，置于37℃5％CO2中孵育68h，離心棄上清后加入MTT(終濃度為0.5mg/ml)，4小時后離心棄上清加入鹽酸異丙醇(1∶300)，490nm測定OD值并計算刺激指數。
1.2.7統計方法用Spss10.0進行分析，組間比較用方差分析，兩兩比較應用Student-Newman-Keuls法。
結果2.1CMS030對AA大鼠原發性病變的影響造模后第10天生理鹽水組右后踝關節腫脹明顯高于正常對照組(P＜0.05)，造模后第14天(即給藥4天后)CMS030各給藥劑量組右后踝關節腫脹均明顯低于生理鹽水組(P＜0.05)，一直持續到給藥結束，結果見表1。
2.2CMS030對AA大鼠繼發性病變的影響造模后第14天生理鹽水組左后踝關節明顯高于正常對照組(P＜0.05)，給藥8天后CMS030各給藥劑量組左后踝關節腫脹均明顯低于生理鹽水組(P＜0.05)，一直持續到給藥結束，結果見表2。
2.3CMS030對AA大鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1β、TNF-α的作用生理鹽水組大鼠腹腔巨噬細胞分泌的IL-1β、TNF-α明顯高于正常對照組(P＜0.05)，CMS030各給藥劑量組均能明顯降低AA大鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1β(P＜0.05)及TNF-α(P＜0.05)，結果見表3。
2.4CMS030對AA大鼠淋巴細胞增殖功能的影響生理鹽水組ConA誘導的T淋巴細胞增殖明顯低于正常對照組(P＜0.05)，CMS030各給藥劑量組均能明顯抑制AA大鼠淋巴細胞增殖功能(P＜0.05)，結果見表4。
結合表1-4CMS030各劑量組均能明顯抑制AA大鼠踝關節的原發性(右后踝關節)及繼發性(左后踝關節)病變，CMS030給藥4天后即能抑制原發性病變，CMS03020μg/kg/d給藥劑量組與環孢素治療組比較無顯著性差異。繼發性病變在造模后第14天開始出現，CMS030給藥8天后能明顯抑制繼發性病變，相比環孢素起效晚，實驗過程中發現CSA治療組大鼠毛色發黃，行動遲緩，狀態不佳，認為是環孢素的副作用的結果，而CMS030各劑量組未見此現象。對AA大鼠細胞免疫功能的研究表明CMS030能抑制脾臟T淋巴細胞增殖，提示其可能通過抑制機體的細胞免疫功能而發揮作用。AA大鼠腹腔巨噬細胞分泌炎癥因子明顯升高。IL-1β及TNF-α是促使RA病理發展的重要細胞因子(Simpson SA，Dalldoref FG，Otteress IG et al.Exacerbation of arthritis byIL-1 in rat joits previously injured by peptidoglycan-polysaccharide.JImmunol，1988，140(9)2946.)，CMS030能降低AA大鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1β及TNF-α，說明它與抑制巨噬細胞活化，降低其產生炎性細胞因子有關。
由于AA是一種免疫性炎癥，較接近人類類風濕性關節炎，建立AA大鼠動物模型是抗炎抗類風濕藥物研究的常用模型之一(Jacobson PB，BorganSJ，Wiliot DM et al.A new spin an old model ub in vivo evaluation of diseaseprogress by magnetic resonace imaging with respect to standard inflammatoryparameters and his eopathology in adjuvant arthritis rats.ArthritisRheum，1999，42(10)2060-73)，該AA大鼠動物模型可用來評判抗炎抗類風濕藥物的效用。
表1CMS030對AA大鼠關節右后踝關節腫脹的抑制作用(cm)
*和生理鹽水組比較P＜0.05；&和正常對照組比較P＜0.05
表2CMS030對佐劑性關節炎大鼠左后踝關節腫脹程度的抑制作用(cm)
*和生理鹽水組比較P＜0.05；&和正常對照組比較P＜0.05
表3CMS030對LPS誘導的AA大鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-1β、TNF-α的影響
注*和生理鹽水組比較P＜0.05；&和正常對照組比較P＜0.05表4CMS030對ConA誘導的AA大鼠T淋巴細胞轉化作用的影響
注*和生理鹽水組比較P＜0.05；&和正常對照組比較P＜0.0權利要求
1.序列號21的生物活性肽在制備用于防治或治療關節炎的藥物中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其特征在于所述關節炎為類風濕性關節炎。
全文摘要
本發明涉及序列號21的生物活性肽在制備用于防治或治療關節炎、特別是類風濕性關節炎的藥物中的用途。
文檔編號A61P19/00GK1799623SQ20051002013
公開日2006年7月12日 申請日期2005年1月5日 優先權日2005年1月5日
發明者王偉明, 林剛 申請人:一泰醫藥研究(深圳)有限公司