一種用于治療中風的中藥組合物及其制備方法和其用途的制作方法

專利名稱：一種用于治療中風的中藥組合物及其制備方法和其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于治療中風的中藥組合物。更具體地說，本發明涉及一種以水蛭為君藥的中藥組合物及其制備方法和其用途。
背景技術：
腦血管疾病是當今世界危害人類健康的重要慢性疾病之一，也是全球人口死亡的三大主要原因之一。世界衛生組織1979年公布的資料表明在世界57個國家中，腦卒中的死亡順序進入前三位的就有40個國家。1995年我國統計資料表明在城市腦卒中居死因首位，在農村居第二位。估計目前有腦卒中病人500～600萬人，其中3/4的存活者有不同程度的殘廢[4]。由于腦卒中發病急、死亡率高、致殘率高，不僅影響人類的生命質量，也給個人、家庭、社會帶來巨大的經濟損失。美國每年腦卒中費用占全部衛生費用的2.6％，約65～112億美元；英國占衛生總費用的2.5％～3％；法國占全國社會擔保預算的2％；我國到2000年僅腦卒中的治療費比1994年增長了10倍多，為所有慢性病中治療費用增長最快的病癥。且流行病學調查表明目前腦血管疾病中出血性中風僅占18％；82％為缺血性中風，其中腦血栓形成約占急性腦血管病的55％，而且多有后遺癥，國家每年因腦血栓造成的各種損失高達40億元以上，給社會及國家帶來沉重的社會問題及經濟負擔。因此，積極尋求治療防治腦血管疾病及其相關疾病的有效方藥，并減輕其后遺癥，具有十分重要的現實意義。
補陽還五湯由清代著名醫學家王清任《醫林改錯·半身不遂》所制，該方由黃芪、當歸尾等藥組成，具有補氣、活血、通絡功能，主治中風后遺癥，并有著很好的治療效果。但隨著經濟的發展，人們社會生活及飲食結構的改變，致使中風病的病機發生了明顯地改變。目前，臨床中風病患者多以血瘀表現為主，以氣虛為主者日少；即使兼有氣虛表現，也多是因瘀致虛，瘀血阻竅在前，元氣漸虧在后；血瘀為本，氣虛為標。因此，目前臨床中風以血瘀為主要表現癥狀，補陽還五湯對目前臨床中風治療中呈現一定的局限性。

發明內容
發明人通過大量的臨床觀察，本著辨證與辨病相結合，對缺血性中風，特別是腦血栓的病因病機有了進一步的認識，認為瘀血阻竅、氣血不暢，進而導致元氣虧虛、臟腑機能衰退是腦血栓及其腦血管病后遺癥期的基本病機。即瘀血阻竅在前，為本；元氣虧虛在后，為標。從而有別于清代王清任補陽還五湯中，元氣虧虛導致瘀血阻滯的傳統認識，變氣虛血瘀為血瘀氣虛，使中醫對中風后遺癥期病因病機的認識有了新的飛躍。據此，發明人進而以中醫理論為基礎，對古代名方補陽還五湯進行加減，并通過臨床實驗篩選、總結和確定新的制劑產品配比，將其定位為適用于缺血性中風血瘀氣虛證的腦血管疾病及其相關疾病的治療，并通過現代工藝技術來大大提高其中活性成分的提取率，并顯著提高了產品的品質和藥效。
發明人通過將補陽還五湯中的君藥黃芪改為破血祛瘀的水蛭，既大幅度減少黃芪在原方中的用量，且以生水蛭入藥，將原方益氣活血劑改為祛瘀活血之劑，使原方活血通絡之功效得到明顯加強，從而更加符合目前中風以血瘀為主要表現的治療需要。同時，發明人對水蛭采用低溫粉碎、膜分離濃縮、冷凍干燥等先進提取工藝，避免了傳統煎煮法使水蛭活性蛋白在高溫下的破壞，使其有效成分得到了最大保留，在制備工藝上有明顯創新。從中藥組合物的藥效學試驗結果和臨床實踐來看，該組合物明顯提高了對腦血栓及其后遺癥的臨床療效，具有良好地開發應用前景。
因此，本發明一是提供一種用于治療中風的中藥組合物，組合物中各組分的重量配比為水蛭飲片0.6-60、川芎0.6-60、黃芪0.4-40、丹參0.4-40，以及適量的藥學上可接受的載體。
優選組合物中各組分的重量配比為水蛭飲片3-12、川芎3-12、黃芪2-8、丹參2-8；最優選組合物中各組分的重量配比為水蛭飲片6、川芎6、黃芪4、丹參4。
本發明組合物中的水蛭飲片還可用鮮水蛭代替。當選用鮮水蛭來制備組合物時，其在組合物中的用量應為水蛭飲片用量的8-12倍，優選10倍。
除非另有說明，本發明涉及的百分比均為重量百分比或重量配比。
本發明的藥物組合物主要通過改造補陽還五湯創制而成。方中以水蛭為君藥，破血通絡，搜剔積血，專化有形之瘀血。以川芎為臣，既能增強水蛭活血通絡之功用，又可上行頭目，引藥直達腦絡，而兼有使藥之長。黃芪、丹參為佐，黃芪益氣以行血滯，氣行則血行，助水蛭活血以通絡；同時，黃芪益氣而能升陽，兼可協同川芎引藥直達病所。丹參活血化瘀、功同“四物”，除加強水蛭活血祛瘀之力外，尚能長養陰血，安心寧神，從而可以兼制水蛭破血散血及川芎辛溫耗陰之弊。四藥全用，共奏祛瘀通絡，益氣活血之功。全方藥味咸、辛、甘、苦相合，行血、益氣、化瘀、安神、行氣開郁并進，藥性有平、微溫、微寒之異，四藥相配，無溫燥、苦寒之弊，不損脾胃，不耗津液，安全有效。上述諸端，正是本方的特色所在，符合繼承創新之旨。
方中水蛭，味咸、苦，性平，有小毒，入肝經。功擅破血逐瘀，歷代醫家均認為水蛭用于活血化瘀，有效專力宏的特點。李時珍《本草綱目》記載其有“逐惡血瘀血，破癥瘕積聚”之功，繆希雍《本草經疏》謂之“咸入血走血……，善破血也”。徐靈胎《本草經百種錄》則曰“水蛭最喜食人之血，而性又遲緩善入，遲緩則生血不傷，善入則堅積易破[6]”。現代藥理研究證實水蛭含水蛭素和多種活性物質，其中水蛭素是目前世界上發現的最強的天然凝血酶抑制劑，有顯著的抗血小板聚集、抗凝、纖溶、抗血拴、擴張血管和降低血粘度等作用，目前已廣泛用于心、腦、血管等疾病的治療[7]。現代實驗研究還發現，水蛭中含有多種生物活性成分，其所含的古今本草專著多謂其屬性猛，有毒，宜炙用，但張錫純則認為水蛭“味咸為水味，色黑為水色，氣腐為水氣，純系水之精華生成，故最宜生用，甚忌火炙[6]”。指出水蛭原于水之精氣所生，炙后則傷水之精氣，破血逐瘀的作用會減弱，現已得到多數臨床醫家的公認和藥理學研究證實，故本方亦取其生用。
川芎味辛，性溫，歸肝、膽經。可活血行氣，祛風止痛。本品辛香行散，溫通血脈，前人稱之為血中氣藥，且其性上行，《本經》認為其“主中風入腦”，《藥性論》還有“治腰腳軟弱，半身不遂[6]”的記載。故本方輔之以增強水蛭的破血逐瘀功能，并引其藥力直達病所——腦絡。現代研究認為該藥所含川芎素可抑制血栓素A2在血小板中的生成，對血小板粘附、聚集均有明顯抑制作用。
黃芪味甘，性微溫，入肺、脾經。炙用可補中益氣，為補氣要藥，尤適用于氣虛血滯導致的肢體麻木、半身不遂或關節痹痛等。故黃芪桂枝五物湯、蠲痹湯、補陽還五湯等方劑均選其與祛風濕、通經絡、活血化瘀藥配伍以治療痹證、中風等病證。《本經逢原》認為其“性雖溫補，而能通調血脈，流引經絡[6]”。本方亦取此意，與破血逐瘀之水蛭相伍，佐其用于缺血性腦血管病的治療，使瘀血得祛，血脈流暢，經絡通利。其主要成分為多糖類和皂甙類物質，現代藥理研究證實其有明顯的增強機體免疫功能，并能改善腦微循環，增加腦血流量，有利于提高腦的血氧和能量供應。
丹參味苦，性微寒，入心、肝經。功可活血祛瘀，養血通脈，適用于多種瘀血為患或血行不暢的病證。《別錄》謂其“專入血分，其功在于活血行血[6]”。現代藥理研究證實其主要成分丹參酮可提高纖維蛋白溶解活性，調節血液流變性，改善血液的“濃、粘、凝、聚”傾向，目前已被廣泛用于治療心、腦、血管疾病的治療。
從文獻及有關藥理研究成果來看，上述四藥中以水蛭活血化瘀力量為最強，川芎、丹參次之，其中目前臨床上單純應用川芎嗪注射液、丹參注射液治療腦血栓后遺癥的報道已屢見不鮮。黃芪為補氣要藥，又有通調血脈之功，除增強機體免疫功能外，并能改善腦微循環，增加腦血流量，有利于提高腦的血氧和能量供應，從而有利于腦血栓后遺癥患者的病情恢復。四藥全用，旨在活血化瘀通絡，適用于瘀血阻于腦絡引起的各種腦血管疾病，藥味不多，卻立法嚴謹，配伍精當。
本發明的組合物具有活血化瘀，益氣通絡之功效，具有較強的溶解血栓的作用，同時具有抑制血小板聚集、抗凝血、抑制血栓形成，明顯改善腦血流量，降低腦血管阻力等作用。因而，主要用于中風的治療，如腦血栓或其后遺癥及其相關疾病，尤其是缺血性中風的治療，特別是以血瘀氣虛證為主要表現的缺血性中風的治療。缺血性中風也叫缺血性腦卒中，是由于血管、血液成分、血液的力學、顱外血管等因素的異常改變，引起腦血管的一過性、部分性或完全性阻塞，造成腦組織缺血、缺氧，形成腦功能異常的一類疾病。包括短暫性腦缺血、腦血拴形成、腦梗塞及腔隙性梗塞等。此外，本發明組合物的急性毒性試驗和長期毒性試驗表明臨床用藥量是安全有效的。臨床樣品通過長期觀察，制劑療效確切、安全有效、質量穩定，能達到臨床使用的要求。
本發明的另一目的在于提供一種制備本發明組合物的方法，該方法包括以下步驟1)取配比量的水蛭藥材粗粉或鮮水蛭，加入4-8倍量的含0.01-0.1w/w％防腐劑水溶液或生理鹽水，于37℃條件下攪拌提取，離心棄去沉淀，上清液經膜過濾，再經超濾濃縮后，將濃縮液進行冷凍干燥，得水蛭凍干粉；1)步中優選的技術方案為所述的防腐劑可為本領域常用的適應藥用或食品用，例如選自苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯或尼泊金丙酯等；水溶液或生理鹽水的用量為6倍；攪拌時間為20小時；攪拌速度為100轉/分；離心時間為30min；離心速度為6000轉/分；膜過濾條件為1um孔徑膜預濾，濾液經0.2μm孔徑膜濾過除菌；濃縮用超濾膜的截留規格為6000-10000道爾頓。
2)取配比量的川芎、丹參、黃芪藥材粗粉，用4-8倍量的65-95v/w％乙醇回流提取，過濾、濃縮回流液得其醇濃縮液；藥渣加入原藥材重量3-5倍量的水，煎煮提取，濾過，濃縮濾液得其水濃縮液；合并醇濃縮液和水濃縮液，噴霧干燥，得川芎混合粉；2)步中的優選技術方案為回流提取的醇溶液用量為6倍；醇溶液的濃度為80v/w％；回流次數為2次；回流時間為2h；提取藥渣的水量為4倍；提取次數為1次；提取時間為1h；優選50℃時醇濃縮液或水濃縮液的相對密度為1.1-1.3，更優選相對密度為1.15-1.2；3)將1)步所得的水蛭凍干粉和2)步所得的川芎混合粉均勻混合，再加入適量藥學上可接受的載體，均勻混合即得。
本發明還提供另一種提取水蛭有效成分的方法，包括如下步驟取配比量的水蛭藥材粗粉或鮮水蛭于-20℃冷凍過夜，粉碎，加4-8倍量水或生理鹽水，在37℃孵育6-24小時，優選孵育12小時，將離心所得的上清液經膜過濾，再經超濾濃縮，將縮液進行冷凍干燥，得水蛭凍干粉。優選所述的膜過濾條件為離心所得的上清液經1um孔徑膜預濾，所得預濾液經0.2μm孔徑膜濾過除菌。
此外，還可采用本領域熟知的濃縮技術來獲得水蛭的濃縮液和川芎等的濃縮液，所述的濃縮方式為薄膜濃縮或減壓濃縮，以實現較短時間、較低溫度條件下完成濃縮，最大程度保留提取液中的活性成分或保證提取物的提取率。
本工藝采用低溫提取、膜分離、膜超濾等現代提取技術，既克服了傳統炮制工藝對水蛭抗凝溶栓活性蛋白等有效成分的破壞等缺陷，且顯著提高了對其活性蛋白的提取率或保留率，以充分發揮水蛭的活血化瘀、抗凝溶栓等作用。并且本工藝采用醇回流和水煎煮的聯合提取工藝，最大程度提取了川芎、黃芪和丹參中的活性成分，為保證和提高組合物的療效奠定了基礎。
本發明的組合物可為本領域熟知的口服劑型，如所述適合于本發明的劑型可以為片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、散劑或滴丸等。可采用本領域熟知的制劑技術手段來制備完成本發明組合物的制備。所述的藥物可接受載體為本領域熟知用于制備口服制劑的常用賦形劑或輔料，包括但不僅限于填充劑或稀釋劑、潤滑劑或助流劑或抗粘著劑、分散劑、濕潤劑或粘合劑等。粘合劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠、纖維素及其衍生物、明膠漿、糖漿、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮，優選的纖維素衍生物為微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、羥丙甲基纖維素；填充劑，例如乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纖維素及其衍生物、無機鈣鹽、山梨醇或甘氨酸，優選無機鈣鹽為硫酸鈣、磷酸鈣、磷酸氫鈣、沉降碳酸鈣；潤滑劑，例如微粉硅膠、硬脂酸鎂、滑石粉、氫氧化鋁、硼酸、氫化植物油、聚乙二醇；崩解劑，例如淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纖維素，優選的淀粉衍生物為羧甲基淀粉鈉、淀粉乙醇酸鈉、預膠化淀粉、改良淀粉、羥丙基淀粉、玉米淀粉；濕潤劑，例如十二烷基硫酸鈉、水或醇等。
另外，還可將活性成分與藥學上可接受的緩控釋載體按其制備要求加以混合，再按照本領域熟知的緩控釋制劑的制備方法，如加入阻滯劑包衣或將活性成分微囊化后再制成微丸，如緩釋微丸或控釋微丸；所述的緩控釋載體包括但不僅限于油脂性摻入劑、親水膠體或包衣阻滯劑等，所述的油脂性摻入劑為單硬脂酸甘油酯、氫化蓖麻油、礦油、聚硅氧烷、二甲基硅氧烷；所述的親水膠體為羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等纖維素衍生物，或PVP、阿拉伯膠、西黃耆膠或卡波普等；所述的包衣阻滯劑為乙基纖維素(EC)、羥丙甲基纖維素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)、丙稀酸類樹脂等。
本發明的還一目的在于提供本發明的組合物在制備與中風或其后遺癥及其相關疾病中藥物中的應用。所述中風的治療包括對腦血栓、腦缺血、腦梗塞或腔隙性梗塞及其后遺癥或其相關疾病的治療，優選中風為缺血性中風，更優選以血瘀氣虛證為主要表現的缺血性中風。
本發明組合物的常用劑量范圍為(每粒/片含生藥量1-10g)每日1-4粒/片，每日三次(膠囊/片)，優選劑量范圍每日2粒/片，每日三次。
具體實施例方式
以下將結合實施例具體說明本發明，本發明的實施例僅用于說明本發明的技術方案，并非限定本發明的實質。
實施例1組合物的配比組成為水蛭600g川芎600g丹參400g黃芪400g淀粉適量微粉硅膠適量共制成 1000粒膠囊(0.25克/粒)制備方法1)取配比量的水蛭藥材粗粉，加入6倍量0.1％苯甲酸鈉水溶液，于37℃條件下攪拌20小時(100轉/分)，離心30min(6000轉/分)，棄去沉淀，上清液經1um孔徑膜預濾，濾液經0.2μm孔徑膜濾過除菌，再經超濾器(截留規格為6000-10000)超濾濃縮約600ml(相對密度1.15，室溫)，濃縮液冷凍干燥成粉，得水蛭凍干粉；2)取配比量的川芎、丹參、黃芪藥材粗粉，用6倍量80v/w％乙醇回流2次，每次2小時，濾過，合并回流液，濃縮至相對密度1.20(50℃測定)；藥渣加入原藥材重量4倍量的水，煎煮1次，時間為1小時，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度1.20(50℃測定)；合并濃縮液，噴霧干燥，得川芎混合粉；3)將1)步所得的水蛭凍干粉和2)步所得的川芎混合粉均勻混合，再加入占總重量10w/w％的淀粉和5w/w％的微粉硅膠，均勻混合，過80目篩后，裝腸溶膠囊即得。
實施例2
組合物的配比組成為水蛭600g川芎600g丹參400g黃芪400g微粉硅膠適量淀粉適量共制成 1000粒膠囊(0.25克/粒)制備方法1)取配比量的水蛭藥材粗粉，加入6倍量生理鹽水于37℃條件下攪拌20小時(100轉/分)，離心30min(6000轉/分)，棄去沉淀，上清液經1um孔徑膜預濾，濾液經0.2μm孔徑膜濾過除菌，再經超濾器(截留規格為6000-10000)超濾濃縮約600ml(相對密度1.15，室溫)，濃縮液冷凍干燥成粉，得水蛭凍干粉；2)取配比量的川芎、丹參、黃芪藥材粗粉，用6倍量80v/w％乙醇回流2次，每次2小時，濾過，合并回流液，濃縮至相對密度1.20(50℃測定)；藥渣加入原藥材重量4倍量的水，煎煮1次，時間為1小時，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度1.20(50℃測定)；合并濃縮液，噴霧干燥，得川芎混合粉；3)將1)步所得的水蛭凍干粉和2)步所得的川芎混合粉均勻混合，再加入占總重量10w/w％的淀粉和5w/w％的微粉硅膠，混合均勻，過80目篩后，裝腸溶膠囊即得。
實施例3組合物的配比組成為鮮水蛭 6000g川芎600g丹參400g黃芪400g微粉硅膠適量淀粉適量共制成 1000片(0.30克片)有效成分的提取方法同實施例1；將1)步所得的水蛭凍干粉和2)步所得的川芎混合粉均勻混合，再加入占總重量20w/w％的淀粉和10w/w％的微粉硅膠，混合均勻，過80目篩后，壓片，包腸溶衣即得。
以下通過藥效試驗例或毒性試驗例來以驗證本發明藥物組合物對中風的治療效果。試驗例所用的藥物為本發明實施例1或3制備得到的組合物干粉，試驗時用蒸餾水配成所需濃度的混懸液供試，其中1g干粉相當于8g生藥。除非另有說明，本發明試驗例的給藥劑量標準均以生藥計。
試驗例1、本發明組合物對大鼠大腦中動脈阻斷的保護作用尼龍栓子制備參考Zealonga方法(Longa EI，Weinstein PR，Carlson S，et al.《Strock》，1989，2084)將一長40mm，直徑為0.2mm的尼龍線一端加熱為光滑球形。用酒精擦干凈并于距球端18.5mm處標記。置于0.9％生理鹽水中備用。
分組及給藥將實驗動物隨機分為假手術組、模型組、高、中、低劑量三個受試物組和陽性對照組。實驗前模型組和假手術組灌胃給予生理鹽水，三個受試物組灌胃給受試物1g/kg，3g/kg，9g/kg，陽性對照組灌胃給尼莫同片20mg/kg，一天一次，連續一周。
SD大鼠用10％水合氯醛麻醉(30mg/100g)仰臥手術臺上，頸正中切開。分離左側頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)，頸內動脈(ICA)。用0#線接扎并剪斷ECA分支。接扎(兩道以利于剪斷)并游離ECA主干一段。沿ECA向下分離并電凝翼顎動脈。動脈夾夾住CCA及ICA。在ECA剪一小口，將制好尼龍線插入ECA，將ECA剪斷后，經CCA分叉處通過ICA入顱至大腦前動脈(ACA)，尼龍線插入深度約為18mm。6h后再灌注時外拉尼龍線使其球端回至ECA內即可恢復大腦中動脈的血供。如果動物已蘇醒，需再次麻醉后再灌注。假手術組不插入尼龍線外其余步驟同上。并按照如下方法檢測下述指標A.神經病學評分(1)提鼠尾離地面約一尺，觀察牽制情況。正常大鼠兩前肢對稱地伸向地面。有左肩內旋，左前肢內收者評為4分，否則0分。
(2)將鼠置于平滑地面上，分別推左/右肩向對側移動，檢查抵抗推動的阻力。正常大鼠對側阻力明顯對稱。右肩向左側移動時，發現阻力下降者，根據下降程度的不同，評為1-3分。
(3)將動物兩前肢置一金屬網上，觀察兩前肢的肌張力。正常大鼠兩前肢肌張力明顯對稱。發生左前肢肌張力明顯下降者，根據下降的輕重，評1-3分。根據以上標準評分，滿分10分。分數越高，說明動物的行為障礙越嚴重。評分采用單盲法。
B.TTC染色測量腦梗塞面積和梗塞百分率
MCAO后24小時斷頭取腦，將腦置于冰凍的生理鹽水中10分鐘。去除嗅球、小腦和低位腦干后，冠狀切四刀成五片。第一刀在前極與視交叉連線中間；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。忽然迅速將腦片置于5ml含有1％TTC的磷酸緩沖液中避光溫孵30分鐘(溫度為37℃)。其中每隔7-8分鐘翻動一次。經染色后正常組織呈玫瑰紅色，而梗塞組織呈白色，且界限分明。溫孵完畢后，將腦片照相。分別稱腦片照片的重量和其中梗塞部分的重量，計算梗塞占全腦的百分率，以此評價藥效。
本發明組合物對神經病學評分結果見表1，對大腦中動脈阻斷大鼠梗塞率的影響結果參見表2。
表1 神經病學評分(n＝8，X±SD)

注和模型組相比**P＜0.01由表1得知模型組大鼠手術后全部出現異常神經癥狀，本發明組合物的中劑量組3g/kg和高劑量組9g/kg具有明顯減輕大鼠大腦中動脈阻斷導致缺血性腦梗塞而引起的異常神經癥狀，與模型組相比具有明顯差異(P＜0.01)。
表2 本發明組合物對大腦中動脈阻斷大鼠梗塞率的影響(n＝8，X±SD)

注和模型組相比**P＜0.01；*P＜0.05由表2得知本發明組合物降低腦梗塞面積的作用具有劑量依賴性，其三個劑量組與模型組相比均有統計學差異。
試驗例2、本發明組合物對大鼠動脈血栓形成的影響體重150-250g為SD大鼠50只，雌雄兼用，隨機分為5組。空白對照組灌胃給予等體積的生理鹽水，藥物的低劑量組為0.125g干粉/Kg、中劑量組為0.375g干粉/Kg，高劑量組1.125g干粉/Kg；陽性對照組為腦血栓片組，給藥劑量為0.3g干粉/Kg。每組每日以0.5ml/100g體重灌胃給藥連續6天，于末次給藥后1h用氯胺酮(0.5ml/100g體重)麻醉，仰位固定。分離右頸總動脈和左頸外靜脈，將放有長6cm，重約9mg的4號手術線的聚乙烯管一端插入左頸外靜脈，另一端插入右頸總動脈，管內肝素抗凝，開放血流15min后中斷血流，取出手術線稱濕重，于60℃恒溫干燥24h至恒重，稱干重，干重、濕重分別減去手術線重為血栓干重和濕重。實驗結果見表3。
表3 本發明組合物對大鼠動脈血栓形成的影響(X±SD，n＝10)

注和空白對照組相比**P＜0.01；*P＜0.05由表3得知本發明組合物3g/kg以上能明顯減少動脈血栓的濕重，而在1g/kg以上能減少血栓干重。表明本發明組合物能明顯抑制動脈血栓的形成。
試驗例3、本發明組合物對大鼠凝血時間的影響體重為80-220g的SD大鼠100只，雌雄兼用。每組每日以0.5ml/100g體重灌胃給藥6天，于末次給藥1h后，用剪刀距尾端約0.2cm處剪去尾尖，即有血流出，于載玻片上滴1滴血，血液直徑約5mm，立即用秒表記時。每隔30s用細針能過血滴并挑血滴1次，仔細觀察，如見針尖挑起纖維蛋白絲，停表記時。實驗結果見表4。
表4 本發明組合物對大鼠凝血時間的影響(X±SD，n＝20)

注和空白對照組相比**P＜0.01
由表4得知本發明組合物1g/kg以上能明顯延長大鼠的凝血時間，表現良好的抗凝作用。
試驗例4、本發明組合物對大鼠血液流變學的影響體重為200-300g的SD大鼠48只，雌雄兼用，隨機分為6組，每組每日以0.5ml/100g體重灌胃連續給藥6天，于給藥第7天造急性血瘀模型皮下注射腎上腺素(Adr10μg/ml)0.08ml/100g體重2次，兩次間隔4h。在二次注射Adr之間(距前后各2h)將大鼠浸入冰水內5min，處置后停食，次晨眼眶取血抗凝，用LBY-N6A自清洗旋轉式粘度計測定血液粘度。模型組不給任何藥物，第7天和給藥組同時造模。正常對照組不給任何藥物，不造模。實驗結果見表5。
表5 本發明組合物對大鼠血液流變學的影響(X±SD，n＝8)

注和正常對照組相比**P＜0.01；*P＜0.05和模型組相比，##P＜0.01；#P＜0.05由表5得知在高血粘度大鼠模型中，全血比粘度(高、低切變率)和血漿比粘度增高，反映大鼠血液流變性呈粘、凝改變。本發明組合物3g/kg以上劑量能明顯降低血漿和全血粘度，使其基本恢復到正常對照組水平，具有活血作用。
試驗例5、本發明組合物對大鼠凝血酶時間和凝血酶原時間的影響體重為250-300g的雄性SD大鼠40只，隨機分為5組，各組每日以0.5ml/100g體重灌胃連續給藥6天，于未次給藥后1h取血進行如下實驗A.血漿凝血酶時間被測血漿0.1ml，加凝血酶液0.1ml，立即開動秒表，密切觀察。
B.凝血酶原時間在一試管中按需加入等量的兔腦浸出液和0.025mol/LCacl2液，混和后置37℃水浴中預溫(不超過30min)，同時將用枸櫞酸鹽作抗凝劑的血漿亦置于37℃預溫。在浸于37℃水浴的小試管中加入預溫的兔腦浸液—氯化鈣混合液0.2ml，再加入預溫的血漿0.1ml，立即混勻，再浸入37℃水浴中，同時開動秒表。至約8s時，自水浴中取出，仔細觀察，記錄血漿流動慢并出現纖維蛋白絲的時間。試驗結果見表6。
表6 本發明組合物對大鼠凝血酶時間和凝血酶原時間的影響(X±SD，n＝8)

注和空白對照組相比**P＜0.01；*P＜0.05由表6得知1g/kg以上本發明組合物能明顯延長凝血酶原時間，3g/kg以上本發明組合物能顯著延長血漿凝血酶時間，表現良好的抗凝作用。
試驗例6、本發明組合物對小鼠全腦缺血的作用(小鼠斷頭法)體重為18-22g的ICR小鼠，雌雄兼用，隨機分為6組。其中受試物組包括本發明組合物的低、中、高劑量組，其給藥劑量分別為以生藥計，2g/kg、6g/kg、18g/kg；陽性對照組為腦血栓片0.12g/kg；缺血空白對照組給予等體積的蒸餾水；正常空白對照組的小鼠不斷頭，整體投入液氮中，余下操作方法同其他組。
各組每日以0.2ml/10g體重灌胃連續給藥6天，進行以下實驗喘氣次數和時間小鼠不麻醉，用大剪刀在耳下部快速斷頭，記錄喘氣次數和時間。
能量代謝小鼠斷頭后，將頭顱在室溫放30秒后投入液氮快速冷凍。測定時從液氮中取出頭顱，立即用，小刀挖取單側大腦半球，稱取100mg左右腦組織，置乳缽(冰浴)中粉碎，加10％過氯酸5ml提取，冷凍30min后3000r/min離心30min，取上清液，進行下述測定，組織提取液可在-20℃貯存。
(1)ATP含量測定作ATP標準曲線，確定線性濃度范圍。用20mol/L Tris-HCl(PH7.8)稀釋組織提取液900倍，取稀釋液200μl置比色杯中，放入液體閃爍儀中記錄本底，然后注入100μl蟲熒光光素酶-蟲熒光素提取物，1min后記錄發光值，計數時間為6秒，從標準曲線計算每克腦組織中ATP的量(mmol)。
(2)LA(乳酸)含量測定按乳酸測定試劑盒進行操作。


混勻，37℃水浴10min，各管加終止液2ml混勻，530nm 1cm光徑，蒸餾水調零，測各管吸光度。LA含量計算

測定得到的小鼠斷頭后的喘氣次數和時間見表7-1，ATP和LA測定結果見表7-2。
表7-1 本發明組合物對斷頭后小鼠的喘氣時間和次數的影響(X±SD)

注和缺血空白對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05；表7-2 本發明組合物對小鼠ATP和LA的影響

注和缺血空白對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05；和正常空白對照組相比##P＜0.01，#P＜0.05。
由表7-1，7-2得知給本發明組合物2g/kg以上，腦缺血30s后腦組織中ATP含量較缺血對照組明顯增高，而LA含量則明顯降低，中、高劑量組斷頭后的喘氣次數長時間增加，提示本發明組合物可減輕小鼠腦缺血時能量物質ATP的減少和代謝物乳酸LA的增加程度。
試驗例7、本發明組合物對大鼠血小板聚集性的影響SD大鼠禁食12-18h，用氯胺酮(0.5ml/100g體重)腹腔注射麻醉，由頸總動脈取血5ml，以枸櫞酸鈉抗凝。根據文獻(陳奇等，《中藥藥理研究方法學》第一版，人民衛生出版社)，制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。用PRP調記錄儀于10％基線，以PPP調90％基線。在PRP中加磷酸緩沖液(0.2mol/L)10μl，溫育3min后加入凝血酶(50U/ml)10μl，描記10min聚集曲線作為空白對照，以不同濃度的受試藥物代替緩沖液，測定對血小板聚集的影響。在描出的聚集曲線上算出1，3，5，10min聚集強度，最大聚集強度(MA)，達到MA的時間(TMA)和1/2MA的時間(T1/2MA)，并以MA求給藥組的聚集抑制率。結果見表8。
由表8得知對大鼠血漿給予20mg/ml本發明組合物5min后，明顯抑制凝血酶引起的血小板聚集的強度，受試物三個劑量組的抑制率分別為10.18％，22.63％，42.16％，高劑量組達到最大聚集強度的時間(TMA)縮短，而半數時間T1/2MA則沒有明顯改變。
小結本發明組合物3g/kg以上能顯著減輕大鼠大腦中動脈阻斷導致缺血性腦梗塞而引起的異常神經癥狀，具有劑量依賴性降低腦梗塞面積的作用，與模型組相比三個劑量組均有統計學差異(P＜0.05)；并能明顯減少動脈血栓的濕重和干重，顯著延長大鼠的凝血時間，凝血酶原時間和血漿凝血酶時間，其效果優于陽性對照藥。
給予20mg/ml本發明組合物5min后，明顯抑制凝血酶引起的血小板聚集的強度，受試物三個劑量組的抑制率分別為10.18％，22.63％，42.16％，高劑量組達到最大聚集強度的時間(TMA)縮短，而半數時間T1/2MA則沒有明顯改變，表現良好的抗凝血、抗聚集和抗動脈血栓作用。
在高血粘度大鼠模型中，本發明組合物3g/kg以上劑量能明顯降低全血和血漿比粘度，改變模型大鼠血液的粘、凝狀態，使其基本恢復到正常對照組水平，表現較強的活血作用；2g/kg以上本發明組合物能明顯減輕小鼠全腦缺血時能量物質ATP的減少和代謝物乳酸(LA)的增加程度，6g/kg以上能增加斷頭后的喘氣次數和時間，表明本發明組合物能維持神經細胞膜和腦組織功能，減少缺血時腦細胞損傷，對腦缺血或腦卒中有明顯的保護作用。
試驗例8、本發明組合物對狗腦血血流量的影響試驗方法參見文獻(李儀奎主編《中藥藥理試驗方法學》，上海科技出版社，1991129-130)。
取體重10-12kg健康狗30只，雌雄兼用。均分成正常組(等容量蒸餾水)、陽性組(腦血栓片，0.55g/kg，相關于臨床人用量8片2.4g的9倍)、受試組為本發明組合物的小劑量組(0.3g生藥/kg)、中劑量組(0.9g生藥/kg)和大劑量組(2.7g生藥/kg)，分別相當于臨床人用量12g的1、3和9倍。
靜脈注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，仰臥固定于手術臺上，沿頸正中線切開皮膚，分離一側頸總動脈，再分離頸外動脈及枕動脈并結扎，保留頸內動脈；再分離一側股動脈，連接血壓計，用記紋鼓記錄血壓變化；再邊疆心電圖儀描記II導心電圖。選擇合適的電磁流量計傳感器，小心套上頸總動脈，記錄頸內動脈血流量。手術結束約10min，待動物血壓，腦血流量和心電圖穩定后，按劑量灌胃給藥4ml/kg。分別于藥后20、40、60、100、120、140、160、180min觀察并記錄頸內動脈血流量、血壓和心電圖的變化，實驗結束后，開顱取全腦稱重，根據頸內動脈壓、血壓和心電圖按以下公式計算腦血流量、腦血管阻力和心肌張力時間指數(代表心肌耗氧量)等指標。
心肌耗氧量(mmHg.次/min)1/2＝√血壓×心率試驗結果參見表9-表13。
結論本發明組合物按0.3g生藥/kg、0.9g生藥/kg和2.7g生藥/kg給狗灌胃給藥，均能增加其腦血流量。大量組在用藥60min后作用明顯，維持時間到140min；中量組從100min作用明顯，維持時間到140min；而小量組在120min和140min作用明顯；腦血管阻力有所減少，但與正常相比，無明顯差異；用藥后狗血壓、心率及心肌耗氧量無明顯變化。
可見，本發明組合物明顯增加狗的腦血流量，提示對腦卒中有一定的治療作用。
試驗例9.本發明組合物的毒理研究結果1.急性毒性試驗研究結果對小鼠灌胃給予本發明組合物進行如下急性毒性試驗用蒸餾水將藥物組合物溶解成0.5g干粉/ml(4tg生藥/ml)，以最大體積0.8ml/20g體重，一次灌胃體重為19～21g的ICR。小鼠20只，雌雄各半，試驗前禁食12小時，自由飲水。
灌胃給藥后，觀察并記錄給藥7天內動物所出現的毒副反應及死亡情況。可見，給藥10min后，動物活動明顯減少，過4-5h后活動自如，食欲正常，連續觀察七天未見死亡，由此計算得知本發明的藥物組合物的LD50＞160g生藥/kg，相當于人用量(0.025g干粉/kg)的800倍。。
同時進行最大給藥量試驗其余條件同前，在24h內對20只ICR小鼠(雌雄各半)灌胃兩次。觀察并記錄給藥7天內動物所出現的毒副反應及死亡情況。可見，每次給藥10min后，動物活動明顯減少，過4-5h后活動自如，食欲正常，連續觀察七天未見死亡，由此獲得本發明藥物組合物的最大給藥量為320g生藥/kg(40g干粉/kg)，相當于人用量1600倍。
2.長期毒性試驗研究結果本發明組合物所進行的大鼠長期毒性試驗大鼠120只，雌雄各半，分為低劑量組34.53g生藥/kg(相當于人用劑量的15倍)，中劑量組69.03g生藥/kg(相當于人用劑量的30倍)，高劑量組138.1g生藥/kg(相當于人用劑量的60倍)和對照組(等量蒸餾水)。給藥途徑均為灌胃給藥，每周六次，連續六個月，停藥后觀察恢復期兩周，分別于給藥三個月、六個月和停藥兩周后取血剖殺，以正常動物作對照，檢查指標血尿常規，肝腎功能、病理組織學檢查，臟器系數等。結果表明各組動物給藥期間食欲正常，活動自如，生長情況良好，體重正常增長，血尿常規，肝腎功能均在正常范圍內，各組間無統計差異。病理組織學檢查，各劑量組與對照組相比無明顯差異，未見藥物對動物各臟器及組織有明顯毒性病理損傷。
該試驗表明本品對大鼠無明顯毒性作用，對大鼠的無毒劑量在138.1g生藥/kg以上。
試驗例10、本發明組合物的II期臨床研究試驗結果本發明組合物的II期臨床研究試驗結果表明本發明組合物和對照藥物腦安膠囊(主用于血瘀氣虛證患者的治療)對中風的治療具有相同治療效果，在改善中風癥狀方面兩組均有明顯的療效，PP數據集結果表明，試驗組基本痊愈5/115，痊愈率15％，顯效58/116，顯效率50.43％，進步41/115，進步率35.65％，無效11/115，無效率9.57％，痊顯率為54.78％；總有效率為90.43％；對照組基本痊愈2/110，痊愈率1.82％，顯效46/110，顯效率41.82％，進步47/110，進步率42.73％，無效15/110，無效率13.64％，痊顯率為43.64％；總有效率為86.37％。經采用CMH檢驗，以中心為分層因素進行兩組之間比較，結果表明，兩組療效差別比較無統計學意義，但P值已接近0.05(P＝0.069)。中心間療效比較無統計學意義。經對FAS數據集CMH檢驗，結果表明兩組療效差別比較有統計學意義(P＝0.026)。
可見，本發明組合物和腦安膠囊在改善中風癥狀方面均有明顯的療效，以神經功能缺損程度評分為主要指標比較兩組療效時，試驗組優于對照組(結論為優效)，如將神經功能缺損程度評分轉化為療效頻數時，兩組療效基本一致(結論為等效)。說明兩組療效有一定的差別，但反映在臨床上尚不十分明顯。
此外，本次II期臨床研究試驗結果表明，本發明組合物和腦安膠囊治療中風在改善中醫證候療效方面兩組均有明顯的療效試驗組痊愈4/115，痊愈率3.48％，顯效27/115，顯效率23.48％，有效76/115，有效率66.09％，無效8/115，無效率13.91％，痊顯率為26.96％；總有效率為93.05％；對照組痊愈1/110，痊愈率0.91％，顯效19/110，顯效率17.27％，有效79/110，有效率71.82％，無效11/110，無效率10.00％，痊顯率為18.18％；總有效率為90.00％；兩組療效差別比較無統計學意義，FAS數據集和PP數據集結果一致。
另外，本發明組合物和腦安膠囊在改善證候方面兩組經治療后證候計分均明顯下降，經對兩組之間比較，采用一般線性模型，重復測量方差分析，考慮中心效應、時間點效應，進行試驗組和對照組的比較。結果表明，時間點效應、中心效應和組間效應均有統計學意義。為排除治療前證候積分對治療后積分的影響，采用協方差分析模型，以治療前積分為協變量，考慮中心效應，對治療后兩組積分進行比較，結果表明兩組之間差異有統計學意義(p＝0.026)，另外，兩組積分的修正均數之差的可信區間也表明為優效性結果(可信區間不含0)，試驗組優于對照組。各中心之間差異有統計學意義。
經對治療前后證候計分改變差值和下降率組間比較，改變差值無統計學意義，下降率有統計學意義。將下降率轉換為療效頻數后，兩組療效差異無統計學意義。
小結本發明組合物和腦安膠囊均可用于治療中風。在改善中醫證候方面兩組均有明顯的療效；以中醫證候積分為主要指標比較兩組療效時，試驗組優于對照組(結論為優效)，如將中醫證候積分轉化為療效頻數時，兩組療效基本一致(結論為等效)。說明兩組中醫證候療效有一定的差別，但反映在臨床上尚不十分明顯。
表8 本發明組合物對大鼠血小板聚集性的影響(X±SD，n＝8)

注和空白對照組相比**P＜0.01；*P＜0.05表9 本發明組合物對狗的腦血流量的影響(X±S，n＝6)

與正常組比*P＜0.05**P＜0.01
表10 本發明組合物對狗的腦血管阻力的影響(X±S，n＝6)

表11 本發明組合物對狗的心率的影響(X±S，n＝6)

表12 本發明組合物對狗的血壓的影響(X±S，n＝6)

填表注意事項一、申請發明專利或實用新型專利必須提交說明書，一式兩份(原件及復印件各一份)。
二、說明書應當打字或者印刷，字跡應該整齊清晰，黑色，符合制版要求，字高在0.35厘米至0.45厘米之間，行距在0.25厘米至0.35厘米之間。說明書首頁用此頁，續頁可用同樣大小和質量相當的白紙續寫。紙張縱向使用，只限使用正面，四周應當留有空白左側和頂部各2.5厘米，右側和底部各1.5厘米。
三、郵寄申請文件不得折疊。
四、說明書第一頁第一行應當寫明發明名稱，該名稱應當與請求書中的一致，并左右居中。發明名稱與說明書正文之間應空一行。說明書格式上應包括下列五個部分，并且在每一部分第一行第一字起寫明小標題，小標題后空兩格或另起一行起正文。例技術領域(正文內容)背景技術(正文內容)發明內容(正文內容)


(正文內容)具體實施方式
(正文內容)說明書如無附圖，說明書文字部分就不包括

及其與其相應的小標題。
五、說明書文字部分可以有化學式，數學式和表格，但不得有插圖，也不得有宣傳用語。
六、涉及核苷酸或氨基酸的申請，應當將該序列表作為說明書的一個單獨部分，申請人應當在申請的同時，提交與該序列表相一致的光盤或軟盤，該光盤或軟盤應符合專利局的有關規定。
七、說明書在兩頁以上的應當在每頁下框線居中順序編寫頁碼。
權利要求
1.一種用于治療中風的中藥組合物，組合物中各組分的重量配比為水蛭飲片0.6-60、川芎0.6-60、黃芪0.4-40、丹參0.4-40，以及適量的藥學上可接受的載體。
2.如權利要求1所述的中藥組合物，組合物中各組分的重量配比為水蛭飲片3-12、川芎3-12、黃芪2-8、丹參2-8。
3.如權利要求2所述的中藥組合物，組合物中各組分的重量配比為水蛭飲片6、川芎6、黃芪4、丹參4。
4.如權利要求1-3任一所述的中藥組合物，組合物中的水蛭飲片可用鮮水蛭代替，則鮮水蛭在組合物中的用量為水蛭飲片用量的8-12倍，優選10倍。
5.如權利要求4所述的中藥組合物，該組合物可為常用的口服劑型。
6.如權利要求5所述的中藥組合物，所述的口服劑型選自片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、散劑或滴丸或其相應的緩控釋劑型。
7.如權利要求1-6任一所述的中藥組合物，所述的中風為缺血性中風及其后遺癥或其相關疾病，優選為以血瘀氣虛為主要表現癥狀的缺血性中風及其后遺癥或其相關疾病；所述的相關疾病選自短暫性腦缺血、腦血拴、腦梗塞或腔隙性梗塞。
8.權利要求1-7任一所述的中藥組合物在制備用于治療中風藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，所述的中風為缺血性中風及其后遺癥或其相關疾病，優選為以血瘀氣虛為主要表現癥狀的缺血性中風及其后遺癥或其相關疾病；所述的相關疾病選自短暫性腦缺血、腦血拴、腦梗塞或腔隙性梗塞。
10.一種制備權利要求1-7任一所述中藥組合物的方法，包括如下步驟1)取配比量的水蛭藥材粗粉或鮮水蛭，加入4-8倍量的0.01-0.1w/w％苯甲酸鈉水溶液或生理鹽水，于37℃條件下攪拌提取，離心棄去沉淀，上清液經膜過濾，再經超濾濃縮后，將濃縮液進行冷凍干燥，得水蛭凍干粉；2)取配比量的川芎、丹參、黃芪藥材粗粉，用4-8倍量的65-95v/w％乙醇回流提取，過濾、濃縮回流液得其醇濃縮液；藥渣加入原藥材重量3-5倍量的水，煎煮提取，濾過，濃縮濾液得其水濃縮液；合并醇濃縮液和水濃縮液，噴霧干燥，得川芎混合粉；3)將1)步所得的水蛭凍干粉和2)步所得的川芎混合粉均勻混合，再加入適量藥學上可接受的載體，均勻混合即得。
11.如權利要求10所述的方法，優選1)步中的技術方案為所述的防腐劑可選自苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯或尼泊金丙酯；水溶液或生理鹽水的用量為6倍；攪拌時間為20小時；攪拌速度為100轉/分；離心時間為30min；離心速度為6000轉/分；膜過濾條件為1um孔徑膜預濾，濾液經0.2μm孔徑膜濾過除菌；超濾膜的截留規格為6000-10000。
12.如權利要求10所述的方法，優選2)步中的技術方案為回流提取的醇溶液用量為6倍；醇溶液的濃度為80v/w％；回流次數為2次；回流時間為2h；提取藥渣的水量為4倍；提取次數為1次；提取時間為1h；優選50℃時醇濃縮液或水濃縮液的相對密度為1.1-1.3，更優選相對密度為1.15-1.2。
13.如權利要求10所述的方法，還可以用下述方法提取水蛭中的有效成分取配比量的水蛭藥材粗粉或鮮水蛭于-20℃冷凍過夜，粉碎，加4-8倍量水或生理鹽水，在37℃孵育6-24小時，優選孵育12小時，將離心所得的上清液經膜過濾，再經超濾濃縮，將縮液進行冷凍干燥，得水蛭凍干粉。
14.如權利要求13所述的方法，所述的膜過濾條件為離心所得的上清液經1um孔徑膜預濾，所得預濾液經0.2μm孔徑膜濾過除菌。
全文摘要
本發明涉及一種用于治療中風的中藥組合物及其制備方法和其用途。該組合物以水蛭為君藥，對中風、特別是缺血性中風、尤其是以血瘀氣虛為主要表現癥狀的缺血性中風具有很好的預防或治療效果。本發明的組合物毒理作用研究表明本發明組合物療效確切、安全無毒，對以血瘀氣虛為主要表現癥狀的缺血性中風具有很好的預防或治療效果。
文檔編號A61P9/10GK1810271SQ20051004112
公開日2006年8月2日 申請日期2005年7月21日 優先權日2005年7月21日
發明者朱學東, 顧偉偉, 夏培源, 刁勇 申請人:南京藍本科技有限公司