一種sars冠狀病毒藥物靶點及其應用的制作方法

專利名稱：一種sars冠狀病毒藥物靶點及其應用的制作方法
背景技術：
非典型肺炎(SARS)是由一種新發現的冠狀病毒(severe acuterespiratory syndrome associated coronavirus，Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2 species)所引起。病毒的基因組由一條單鏈RNA組成，其中包含有14個開放式閱讀框(ORF)。目前已知病毒編碼的蛋白質包括脂雙層膜及其上的棒狀膜蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M、以及膜內部衣殼蛋白N，以及一些蛋白酶和復制酶，然而大多數的ORF是否編碼蛋白質，以及他們的功能都不清楚(Rota PA，Oberste MS，The genome sequence ofthe ARS-associated coronavirus.Science.2003 May 30；300(5624)1399-404)。
ORF3a最近研究比較集中的SARS病毒基因之一。ORF3a編碼了一個全長274個氨基酸的全新病毒蛋白，已有研究人員通過免疫印跡和蛋白質質譜的方法證明了這一病毒蛋白的存在，并推測其很可能是病毒的結構蛋白。通過生物信息學分析，該蛋白具有3個跨膜區，與其他已知蛋白的同源性很低(吳家睿，曾嶸等，申請號200310108604.X)。雖然通過很多不同的實驗方法都證明了3a蛋白的存在，但是關于這一蛋白功能的研究還很少，而現有的文獻都沒有能夠闡明該蛋白在病毒周期中的作用。(Naoto Ito，Eric C.Mossel，Krishna Narayanan，Vsevolod L.Popov，et al.，Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 3a protein is a viral structural protein，2005，J.Virol.79，3182-3186)。同時，也未見有利用其全蛋白或者部分多肽序列作為抗原免疫動物的報道。
目前通常使用的SARS冠狀病毒的藥物多為中草藥制劑和部分類型的干擾素，對SARS病毒的抑制效果不甚理想，且由于是通過藥物篩選方法獲得，其作用機制和作用的具體靶點不甚明了，為預防和治療帶來了不確定性。

發明內容
所要解決的技術問題本發明需要解決的技術問題為了克服上述缺陷，提供一種SARS冠狀病毒藥物靶點、該藥物靶點的單克隆抗體和多克隆抗體及其制備方法、以及一種病毒的抑制劑。
技術方案本發明的技術方案之一是提供一種SARS冠狀病毒藥物靶點，該藥物靶點為ORF3a病毒基因所編碼的蛋白質，具有離子通道特性。
上述的SARS冠狀病毒藥物靶點的一種優選方式為，所說的ORF3a病毒基因與序列表SEQ ID NO1的堿基序列相同或同源。
上述的SARS冠狀病毒藥物靶點另一種優選方式為，所說的離子通道的活性可以被鋇離子抑制。進一步來說，該離子通道具有單價陽離子強通透的特性。特別的例子是，所說的單價陽離子為鉀離子。
上述的SARS冠狀病毒藥物靶點再一種優選方式為，所說的蛋白質在細胞內通過二硫鍵的方式形成四聚體。
本發明的技術方案之二為提供一種抗SARS冠狀病毒抗體，該抗體特異性地與技術方案之一所說的SARS冠狀病毒藥物靶點結合。
上述SARS冠狀病毒藥物靶點的抗體的一種優選方案為，該抗體是SARS冠狀病毒藥物靶點的多克隆抗體，且由下列制備方法所制備，步驟包括(1)提供氨基酸序列為SEQ ID NO3的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫動物；(3)取動物的抗血清過抗原偶連的親和層析柱純化，即得到所述的抗體。
氨基酸序列為SEQ ID NO3的多肽，是指來源于SEQ ID NO2即ORF3a基因所編碼的蛋白質序列的一段多肽，具體選擇方法可以為利用Oligo序列分析軟件針對SEQ ID NO2進行抗原性分析，從而選出抗原性最強的一個多肽片段。
上述的這些抗體制備步驟并不是一成不變的，本領域的普通技術人員可以根據實際情況進行合理的修改使之符合應用要求。比如根據要求選擇是否使用載體蛋白進行偶聯，是否與佐劑一起免疫動物，以及是否使用親和純化方法來純化抗體等等。
上述SARS冠狀病毒藥物靶點的抗體的另一種優選方案為，該抗體是SARS冠狀病毒藥物靶點的單克隆抗體，且由下列制備方法所制備，步驟包括(1)提供氨基酸序列為SEQ ID NO3的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫小鼠；(3)分離小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞株融合；(4)加入小鼠腹腔飼養細胞與融合細胞共培養，并篩選陽性株；(5)克隆化篩選，即可獲得單克隆抗體細胞株；
(6)將單克隆抗體細胞株植入小鼠體內，分泌所需要的單克隆抗體。
同樣，這些步驟也并不是一成不變的，本領域的普通技術人員可以根據實際情況進行合理的修改使之符合應用要求。比如根據要求選擇是否使用載體蛋白進行偶聯，是否與佐劑一起免疫動物，以及選擇不同的骨髓瘤細胞株等等。
本發明的技術方案之三為提供一種SARS冠狀病毒抑制劑，該抑制劑中包含有鋇離子。
上述的包含有鋇離子的SARS冠狀病毒抑制劑可以有多種的形式，可以是含有鋇離子的化合物，例如硫酸鋇、氯化鋇、硝酸鋇、葡萄糖鋇、檸檬酸鋇等等；也可以是含有鋇離子的組合物，比如與藥學上可接受的載體制成一種制劑，藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑、填充劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、促進吸收劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。另外，還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。所說的各種制劑可以按照藥學領域的常規生產方法制備。
有益效果本發明應用制備的特異性抗體，首次證明了3a蛋白可以形成自身四聚體蛋白復合物，而蛋白四聚體是很多離子通道的必備條件之一。為了驗證3a蛋白是否能夠形成離子通道，本發明采用雙電極電壓鉗的電生理實驗方法，證明了3a具有離子通道的活性。它在細胞膜上可以介導鉀離子的通透，該通道的活性可以被鋇離子阻斷。
病毒的離子通道往往和病毒的感染過程密切相關，例如流感病毒的M2蛋白就是一種離子通道，目前市場上出售的治療流感的藥物，金剛脘胺就是該離子通道的抑制劑。本發明的離子通道抑制劑采用鋇離子或者其化合物、組合物，是一種結構簡單、取得方便、細胞毒性小、經濟有效的抗病毒藥物備選分子。其性質完全不同于現有的SARS冠狀病毒抑制劑如中草藥制劑和部分類型的干擾素，是一類新型的SARS病毒抑制劑。


圖1是3a蛋白cRNA借助非洲爪蟾的卵母細胞進行雙電極電壓鉗檢測的I-V電流電壓曲線結果。
圖2是該通道被不同濃度的鋇離子抑制的效果。
圖3是體外構建3a蛋白真核表達產物的western blot檢測結果。顯示3a蛋白可以形成自身四聚體蛋白復合物。
圖4是使用anti-LH21抗體對SARS-CoV感染FRhK-4細胞進行免疫熒光檢測的顯微鏡結果。
圖5是不同濃度的鋇離子在對病毒釋放的抑制效果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠和Sigma公司。
實施例所用病毒株為SARS coronavirus GZ50；Viruses；ssRNApositive-strand viruses，no DNA stage；Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2 species。GeneBank號為AAS00004。由香港大學鄭伯建教授提供。
實施例1針對3a蛋白特異性抗體的制備利用生物軟件，分析了3a蛋白的抗原性，在蛋白的N段選擇了一條抗原性最高的氨基酸序列，并命名為LH21(Amino acids SEQ ID No.1FMRFFTLGSITAQPVKIDNAS)。采用化學方法合成這一多肽(吉爾生化(上海)有限公司)。將多肽溶解在PBS緩沖液中，通過戊二醛與載體蛋白BSA偶連。化學偶連2個小時后，加入glysin終止反應，并對反應體系透析過夜。使用偶連有載體蛋白的藥物靶點分別免疫兔子。先抗原稀釋到1mg/mL，取1mL抗原與1mL完全弗氏佐劑乳化，對動物皮下，皮內，足掌三點注射，3周后，取同樣劑量的抗原和不完全弗氏佐劑乳化，對動物進行加強免疫，第二次加強免疫后第七天，處死動物，取出抗血清。將抗原偶連到層析柱上，利用親和層析的方法對抗血清進一步的純化。洗脫下來的即為高親和力和特異性的抗3a蛋白的多克隆抗體。
采用相同的抗原免疫小鼠，對小鼠皮下，皮內，足掌三點注射，3周后，取同樣劑量的抗原和不完全弗氏佐劑乳化，對動物進行加強免疫，第二次加強免疫后第七天，處死動物，分離小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞株融合；加入小鼠腹腔飼養細胞與融合細胞共培養，并篩選陽性株；克隆化篩選，即可獲得單克隆抗體細胞株；將單克隆抗體細胞株植入小鼠體內，分泌所需要的單克隆抗體。
實施例2使用anti-LH21抗體特異性地識別病毒感染的細胞中3a蛋白的表達SARS-CoV感染FRhK-4細胞24小時后，將被感染的細胞取出，用5％多聚甲醛固定細胞，半小時后，PBS洗去多余的多聚甲醛，使用anti-LH21多克隆抗體作為一抗(1∶500稀釋)檢測被感染細胞上3a蛋白的表達和定位。一抗處理1個小時后，用PBS緩沖液洗3遍。加入含有FITC標記的anti-rabbit(或者anti-mouse)二抗(1∶100稀釋)，處理半個小時。最后細胞用于免疫激光共聚焦顯微鏡上觀察，可以獲得抗體與病毒感染細胞特異性結合的觀察結果。(圖4)以anti-LH21單克隆抗體作為一抗，按照同樣的方法處理，免疫激光共聚焦顯微鏡上觀察，也可以獲得抗體與病毒感染細胞特異性結合的觀察結果。
實施例33a蛋白形成多聚體體外構建3a蛋白真核蛋白表達質粒，并在3a蛋白的C段連接一段HA的標記。瞬時轉染該質粒進入HEK 293細胞(來自ATCC，USA)中過量表達，48小時后，細胞采用RIPA細胞裂解液，冰上裂解細胞15分鐘后14000g低溫離心15分鐘，取裂解液上清。上清中加入0.5ug的anti-HA單抗，4攝氏度反應1-21小時后，再加入30μL的Protein A/G beads(來自Santa Cruz，CA，USA)，再次反應1個小時。用RIPA裂解液洗beads 4-5次。最后用2×SDS裂解液將beads上偶連的蛋白洗脫下來。做westernblot檢測。結果顯示，除了3a蛋白單體以外，在75KD和150KD附近，還有兩條多聚體條帶，分別對應其二聚體和四聚體的大小。如果在裂解液加入還原劑二硫蘇糖醇，則相應兩條多聚體條帶隨即消失，說明3a蛋白在細胞內通過二硫鍵的方式可以形成四聚體。(圖3)實施例43a蛋白可以形成一種離子通道蛋白形成4聚體是對該蛋白可能具有離子通道特性的重要提示。為了進一步研究3a蛋白是否具有離子通道的特征，本發明采用了雙電極電壓鉗的技術。雙電極電壓鉗是一種應用較為廣泛的電生理手段，常應用于離子通道和轉運蛋白的電生理特性的研究。
本發明首先制備了3a蛋白的cRNA，通過顯微注射的方法將10ng的cRNA注射到非洲爪蟾的卵母細胞中，48-72小時后，在卵母細胞上檢測在不同給定的外在電壓條件下有無電流通過細胞膜，并作出相應的I-V電流電壓曲線。結構證明在注射了3a-cRNA的卵母細胞上可以產生顯著的電流。說明3a蛋白可以形成某種離子通道的結構。
該離子通道沒有很強的選擇性，可以確定的是對單價陽離子，特別是鉀離子的通透性最大，在不同濃度的鉀離子濃度條件下，電流會隨著鉀離子濃度的提高而顯著提高。(圖1)實驗還發現這種離子通道的活性可以被硫酸鋇、氯化鋇、硝酸鋇、葡萄糖鋇、檸檬酸鋇等鋇離子化合物抑制。(圖2)實施例5硫酸鋇、氯化鋇、硝酸鋇、葡萄糖鋇、檸檬酸鋇等鋇離子與病毒共培養將上述各種化合物以鋇離子計5mM，10mM，20mM的終濃度，配置到細胞培養基中，在固體瓊脂培養基表面培養FRhK-4細胞，待細胞長滿后，加入MOI＝10的SARS-CoV病毒，48小時后通過計算病毒的空斑大小，統計病毒的釋放能力，結果如圖5所示。
核苷酸/氨基酸序列表SEQUENCE LISTING<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>一種SARS冠狀病毒藥物靶點及其應用<130>2006052902<160>3<170>Patentln version 3.3<210>1<211>825<212>DNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>結構蛋白基因<222>(1)..(825)<400>1atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt 60gacaatgctt ctcctgcaag tactgctcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca 120ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc 180
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<221>病毒結構蛋白<222>(1)..(274)<400>2
Met Asp Leu Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln15 10 15Pro Val Lys Ile Asp Asn Ala Ser Pro Ala Ser Thr Val His Ala Thr20 25 30Ala Thr Ile Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Val Ile35 4045Gly Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Thr Lys Ile Ile Ala50 55 60Leu Asn Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Tyr Lys Gly Phe Gln Phe Ile65 70 75 80Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Ile Tyr Ser His Leu Leu Leu8590 95Val Ala Ala Gly Met Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Ile100105 110Tyr Phe Leu Gln Cys Ile Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp115 120 125Leu Cys Trp Lys Cys Lys Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn130135 140Tyr Phe Val Cys Trp His Thr His Asn Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr145 150 155 160Asn Ser Val Thr Asp Thr Ile Val Val Thr Glu Gly Asp Gly Ile Ser165 170 175
Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp180 185190Arg His Ser Gly Val Lys Asp Tyr Val Val Val His Gly Tyr Phe Thr195200 205Glu Val Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly210 215 220Ile Glu Asn Ala Thr Phe Phe Ile Phe Asn Lys Leu Val Lys Asp Pro225 230235 240Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Ala Asn245 250 255Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val260 265 270Pro Leu<210>3<211>21<212>PRT<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>多肽抗原<222>(1)..(21)
<400>3Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser IIe Thr Ala Gln Pro Val Lys1 5 10 15Ile Asp Asn Ala Ser20
權利要求
1.一種SARS冠狀病毒藥物靶點，其特征在于，該藥物靶點為ORF3a病毒基因所編碼的蛋白質，具有離子通道特性。
2.根據權利要求1所述的SARS冠狀病毒藥物靶點，其特征在于，所說的ORF3a病毒基因與序列表SEQ ID NO1的堿基序列相同或同源。
3.根據權利要求1所述的SARS冠狀病毒藥物靶點，其特征在于，所說的離子通道的活性可以被鋇離子抑制。
4.根據權利要求1所述的SARS冠狀病毒藥物靶點，其特征在于，所說的蛋白質具有單價陽離子強通透的離子通道特性。
5.根據權利要求4所述的SARS冠狀病毒藥物靶點，其特征在于，所說的單價陽離子為鉀離子。
6.根據權利要求1所述的SARS冠狀病毒藥物靶點，其特征在于，所說的蛋白質在細胞內通過二硫鍵的方式形成四聚體。
7.一種SARS冠狀病毒抗體，其特征在于，所說的抗體特異性地與權利要求1所說的SARS冠狀病毒藥物靶點結合。
8.根據權利要求7所述的SARS冠狀病毒抗體，其特征在于，是SARS冠狀病毒藥物靶點的多克隆抗體，且由下列制備方法所制備，步驟包括(1)提供氨基酸序列為SEQ ID NO3的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫動物；(3)取動物的抗血清過抗原偶連的親和層析柱純化，即得到所述的抗體。
9.根據權利要求7所述的SARS冠狀病毒抗體，其特征在于，是SARS冠狀病毒藥物靶點的單克隆抗體，且由下列制備方法所制備，步驟包括(1)提供氨基酸序列為SEQ ID NO3的多肽；(2)將多肽與載體蛋白偶連，并與佐劑一起免疫小鼠；(3)分離小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞株融合；(4)加入小鼠腹腔飼養細胞與融合細胞共培養，并篩選陽性株；(5)克隆化篩選，即可獲得單克隆抗體細胞株；(6)將單克隆抗體細胞株植入小鼠體內，分泌所需要的單克隆抗體。
10.一種SARS冠狀病毒抑制劑，其特征在于，該抑制劑中包含有鋇離子。
全文摘要
本發明涉及一種SARS冠狀病毒藥物靶點及其應用，該藥物靶點為ORF3a病毒基因所編碼的蛋白質，具有離子通道特性，其氨基酸序列為SEQID NO1或者其衍生序列。本發明還提供該藥物靶點的單克隆抗體和多克隆抗體及其制備方法，以及一種病毒的抑制劑，具有藥物開發的前景。
文檔編號A61K33/04GK101085811SQ20061002747
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月8日 優先權日2006年6月8日
發明者孫兵, 鄭伯健, 呂偉, 徐可 申請人:中國科學院上海生命科學研究院