Ha/rgd雙受體介導多靶點給藥系統的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥品領域，具體涉及一種雙受體介導多靶點給藥系統的制備方法。
【背景技術】
[0002]癌癥是危害人類生命健康的嚴重疾病之一，發病率逐年上升，尋找惡性腫瘤有效的防治方法迫在眉睫。化學藥物治療是當今治療腫瘤的主要手段之一，但化療藥物在作用于靶細胞時往往累及正常細胞，產生免疫功能低下、骨髓抑制、臟器受損等毒副作用，嚴重的副作用和多藥耐藥等問題使其應用受到很大的限制。
[0003]靶向給藥系統是一種新的藥物制劑類型的一種較為理想的給藥方式。利用靶向給藥系統的特性，可以較為精確的控制藥物釋放到特定的組織、器官或細胞，延長藥物的傳遞過程，長時間的保持靶區的藥物濃度，具有毒性小，生物利用度高等優點。但在靶向給藥系統的研發過程中，也遇到了一些需要解決的問題:一是目前開發上市的靶向藥物(包括單克隆抗體)的靶向性仍然不理想;二是靶向給藥系統的穩定性，特別是通過靜脈注射給藥靶向制劑在血液中的穩定性;三是需要繼續發展新的靶向給藥系統的載體材料，使其具有更好的生物相容性，生物可降解性以及更好的緩釋速度。
[0004]透明質酸(HA)，又名玻尿酸，是由雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高級多糖類，廣泛分布在軟結締組織細胞外基質中。HA具有良好的生物相容性、生物降解性和隱形性，是一種理想的生物醫用高分子材料，偶聯有HA組分的納米粒子能有效避免藥物突釋，可用于藥物的緩控釋，在臨床醫學中具有廣泛的應用。研究發現大部分實體腫瘤組織外周的透明質酸增高，同時腫瘤細胞表面的透明質酸受體——CD44表達上調，利用透明質酸/CD44受體介導作用可以提高抗瘤藥物的主動靶向。
[0005]精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽是許多細胞表面某些整合素分子特異性配體之一。一般認為，腫瘤血管生成是腫瘤生長的關鍵過程，研究表明，整合素ανβ3受體在腫瘤血管內皮細胞生成中發揮著關鍵作用，目前已發現25余種不同的整合素受體亞型。近年來，RGD肽與整合素ανβ3受體之間相互作用的研究逐漸成為生物材料研究的熱點，通過在生物材料表面引入RGD肽，有望實現細胞識別，促進信號傳遞，抑制腫瘤新血管生成，提高細胞與生物材料表面的粘連，加速細胞對載體的內吞，達到更有效、精確和安全治療腫瘤的目的。
[0006]苯丁酸氮芥屬氮芥類衍生物，具有雙功能烷化劑作用，可形成不穩定的亞乙基亞胺而發揮其細胞毒作用，干擾DNA和RNA的功能。苯丁酸氮芥抗瘤譜比較廣，對多種腫瘤均有作用，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用，屬于周期非特異性藥物，較大劑量可致各類白細胞減少，造成嚴重的骨髓抑制。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于克服現有技術中藥物靶向性不理想穩定性差的問題，提供一種新型的靶向方案，通過協同治療使藥物在癌細胞內快速積累。
[0008]為達到上述目的，采用技術方案如下:
[0009]HA/RGD雙受體介導多靶點給藥系統的制備方法，包括以下步驟:
[0010]I)透明質酸(HA)的脫乙酰化:將透明質酸和硫酸肼溶解在肼中，在惰性氣體保護60?115 °C反應I?12h，用H13去除殘留肼，用HI去除過量的H13，提純干燥，即得脫乙酰化的HA;
[0011]2)HA-R⑶的制備:將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R⑶)溶解于水，加入乙基(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)溶液活化，調節溶液pH至3.5?6.5，滴加上述脫乙酰化的HA水溶液4?38 °C反應I?12h，透析除去未反應物，干燥得HA-RGD白色固體；
[0012]3) HA-RGD-CLB的制備:將HA-RGD白色固體溶解于水，加入EDC/NHS溶液活化，調節pH至3.5?6.5制得HA-R⑶水溶液;將CLB-ADH的水溶液滴加入所述HA-R⑶水溶液中，攪拌反應I?12h，透析、提純，干燥得到HA/RGD雙受體介導多靶點給藥系統；
[0013]其中，CLB-ADH按以下方法制備而來:
[0014]將苯丁酸氮芥(CLB)與已二酸二酰肼(ADH)均勻分散于去離子水與四氫呋喃的混合溶劑中，調節溶液pH至3.5?6.5，再加入EDC溶液，繼續調節pH保持不變，攪拌反應I?24h;調節溶液的pH至中性，旋蒸除水，再加入丙酮生成沉淀，洗滌、干燥得到白色粉末CLB-ADH0
[0015]按上述方案，步驟I)中透明質酸、硫酸肼、肼與H13的質量的比為1:(0.1?I): (5?25):(0.5?1.5)0
[0016]按上述方案，步驟2)中4?38 °C反應時間I?12h; RGD: EDC: NHS:脫乙酰化的HA質量比為 1: (2?6):(1.5?4): (I ?5)。
[0017]按上述方案，步驟3)中所述的HA-RGD水溶液質量分數為0.25?5 % ; HA-RGD: CLB-ADH:EDC:NHS質量比為I: (0.5?2): (2?7): (I.5?4)。
[0018]按上述方案，CLB-ADH的制備中，水與四氫呋喃的混合溶劑按質量比為1:(0.1?10) ;CLB:ADH:EDC的質量比為1: (I?3): (2?6)。
[0019]HA具有較好的受體介導等生物活性和隱形性，能與CD44受體特異性結合，將藥物主動靶向腫瘤細胞;R⑶具有優異的生物活性且能與血管整合素受體ανβ3特異結合，將藥物主動靶向腫瘤細胞和腫瘤血管。二者合用能更有效地增強藥物與腫瘤細胞的結合，提高在腫瘤部位的有效濃度，增效減毒，同時殺死腫瘤細胞和抑制腫瘤新生血管的生長，發揮“一藥多效”的作用，能有效逆轉腫瘤耐藥性。
[0020]相對于現有技術，本發明的有益效果如下:
[0021]HA/RGD雙受體介導可實現多靶點給藥，提高藥物與腫瘤細胞的結合及抑制腫瘤新生血管的生長。CD44是一種高效內吞HA受體，該系統中的HA可特異識別該受體并與之結合；整合素ανβ3是一種高效內吞RGD肽受體，該系統中的RGD巰基肽可特異識別受體并與之結合，雙受體使藥物高效主動靶向腫瘤細胞與腫瘤血管。
[0022]HA脫乙酰后交聯RGD，不影響HA的活性基團，且可提高產物的載藥量；
[0023]采用化學交聯方法載藥，制備的復合粒子穩定，且具有良好的生物相容性。
【具體實施方式】
[0024]為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。
[0025]實施例1
[0026]1)HA的脫乙酰化
[0027]取0.2g的HA溶于1ml的無水肼中，并向其加入1%的硫酸肼，在60°C下反應lh，整個過程通干燥的氮氣。待反應結束后加入冷的乙醇進行沉淀分離，將沉淀溶解在5%的冰乙酸中并向其加入2ml 0.5mol/L的H13。冰浴(4°C下)2h，添加適量的55?58%的HI溶液去除過量的HI O3。加入乙酸乙酯反復振搖，向水層中加入0.2mo I /L的NaOH直至溶液為中性，最后再加入乙醇分離即得到產品。HA的脫乙酰度達到70%以上。
[0028]2)HA_R⑶的制備
[0029]取0.05g的R⑶溶解并加入0.25g的乙基(3-二甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和0.013g的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (EDC/NHS)進行活化，再取0.05g的脫乙酰化后的HA配成水溶液緩緩滴加，反應Ih，透析除去未反應物，冷凍干燥即得HA-RGD白色絮狀固體。
[0030]3) CLB-ADH的制備
[0031 ] 取0.1g的CLB與0.1g的ADH均勻分散于去離子水與四氫呋喃的混合溶劑(0.1:1)中，用Imo 1/L的鹽酸調節溶液PH值，使其PH值保持在4.0，，再加入0.05g的EDC溶液，繼續滴加HCl使pH保持不變，室溫下快速攪拌，反應Ih。用NaOH調節溶液的PH至中性，旋蒸除水，得到與糖漿類似的產物。加入過量的丙酮使其沉淀，在丙酮中的攪拌過夜。真空干燥收集，得到一種白色粉末。
[0032]4)HA-RGD_CLB 的制備
[0033]取0.1g HA-R⑶溶于99.5mL蒸餾水中，攪拌。放置2d，待完全溶解后，得到質量分數為0.25%的HA-RGD溶液。緩慢滴加HCl溶液將反應體系pH調至4.0，再分別加入0.025g和0.014g的EDC/NHS進行活化，繼續滴加HCl使pH保持不變，室溫下攪拌lh。然后將0.05g的CLB-ADH配成溶液逐滴加入到HA-RGD溶液中，攪拌Ih。停止反應，將所得產物用0.lmol/L的NaCl溶液進行透析，接著用蒸餾水透析(每30min換一次蒸餾水)，提純后將溶液移至培養皿中，于真空干燥箱中38°C干燥。
[0034]實施例2
[0035]1)HA的脫乙酰化
[0036]取0.1g的HA溶于8ml的無水肼中，并向其加入2 %的硫酸肼，在100 °C下反應6h，整個過程通干燥的氖氣。待反應結束后加入冷的乙醇進行沉淀分離，將沉淀溶解在10%的冰乙酸中并向其加入1.5ml 0.5mo 1/L的H13。冰浴(4°C下)2h，添加適量的的5?15%的HI溶液去除過量的H103。加入乙酸乙酯反復振搖，向水層中加入0.lmol/L的NaOH直至溶液為中性，最后再加入乙醇分離即得到產品。
[0037]2)HA_R⑶的制備
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