專利名稱：：一種低溫脂肪酶菌株、低溫脂肪酶及其生產方法
技術領域：
：本發明涉及一種低溫脂肪酶、該酶的產生菌及其制造方法。具體就是，本發明涉及一種由耐低溫微生物菌種產生的、在較低的溫度下具有較高活性的脂肪酶，及其利用該微生物菌種生產低溫脂肪酶的生產方法。技術背景脂肪酶(丄z)^e)是一種在自然界中普遍存在的酶類。按其來源不同，可分為動物脂肪酶、植物脂肪酶及微生物脂肪酶三大類。其中，微生物脂肪酶因其生產容易、易于擴大等特點及其對脂肪類物質特異性的分解特性，使其在洗滌、食品加工、皮革加工、助消化劑、有機合成化工產品、香料、藥物制備、油脂加工等方面得到廣泛應用，成為世界主要工業用酶制劑之一。八十年代以后，脂肪酶在開發應用方面的研究加速，顯示出良好的應用前景。可產生脂肪酶的微生物菌種主要有以細菌和霉甜為主，有些酵母菌也可產脂肪酶。因此菌種特性的差異性，使其產生的脂肪酶在酶學特性上存在差異性，以下為目前脂肪酶研究的主要研究菌種及其產生的脂肪酶的特性。假單胞菌屬菌H-1(尸化Womo"wH-l),其產生的脂肪酶最適反應溫度為47。C以上(Fmfen'cAfon'erave",章克昌從非洲土壤中分離新的產生脂肪酶的細菌無錫輕工大學學才艮2000，19(1):41-44);鏈霉菌Z94-2，其產生的脂肪酶最適酶解條件為37°C、pH9.4~10.2(周曉云，黃建寧，歐志敏，王慧中，王榮偉鏈霉菌Z94-2堿性脂肪酶產生條件及酶學性質微生物學報2000，40(1):75-79);擴展青霉，其產生的脂肪酶最適酶解條件為36°C、pH79(鄭毅，龔福生，施巧琴，吳松剛擴展青霉脂肪酶催化性質的研究藥物生物技術2000，7(2):98誦101);毛霉(Mwcww.)M2菌林，其產生的脂肪酶最適酶解條件為50°C、pH8.0(肖春玲，宋欣毛霉脂肪酶的研究生物學通4艮1998，25(5):274-277);青霉菌林4041,其產生的脂肪酶最適酶解條件為25°C、pH10.0(鄒顯章，李江華洗滌劑用酶的研究與開發一新型堿性脂肪酶無錫輕工業學院學報1994，13(1):201國207);根霉屬(//^op"力脂肪酶產生菌NQ23，其產生的脂肪酶最適酶解條件為50°C、pH7.0(喬紅群，徐虹，付閃雷，歐陽平凱脂肪酶產生菌的篩選及其酶性質南京化工大學學報1998,1:15-19);華根霉(7/2izo/w;sc/z/"e"^CCTCCM201021)其產生的脂肪酶最適酶解溫度為40。C、pH7.5(徐巖一種脂肪酶產生菌及其篩選方法和產業化應用公開號CN1443841A);無花果絲孢酵母(7Hc/zo^7力gw/M)其產生的酶最適酶解條件為40°C、pH8.0(張苓花，王運吉脂肪酶產生菌分離'、鑒定及酶學性質研究生物技術1996,6(1):12-16);異常畢赤酵母(P/c/2/a朋oma/a)1013，其產生的酶最適酶解條件為48°C、pH4.8(章文賢，蔣詠梅，施巧琴，吳松剛異常畢赤酵母產生耐溫酸性脂肪酶的研究福建師范大學學報(自然科學版)2000,9:72-82);南極，支絲酵母菌(CL4wtorc"'ca)DMS-3855,其產生的酶最適酶解條件為70°C、pH8.5(劉均洪，邱龍輝，徐軍偉，張媛媛南極假絲酵母脂肪酶發酵條件優化及酶學性質化學工業與工程技術2005,2:1-4);假單孢菌Bll-l，其產生的脂肪酶最適酶解條件為45°C、pH8.0五"v/ra脂ewto/Mfcra6/o/ogyFe6.79站，必6畫邦7);以為受體構建的基因工程菌林，所產生的脂肪酶最適酶解溫度為6070。C、pH9.0,具有較高的熱穩定性(向華，張健，周堅，田宇清，譚華榮，熱穩定脂肪酶及其編碼基因與應用和專用工程菌公開號CN1552866A);'假單胞菌屬(尸sc"必wowos)菌產生的脂肪酶最佳作用溫度為55~65°C、pH10-12(石田禮子，鈴木雅博，小綠隆司，崎元和范，新領的脂肪酶、產生該脂肪酶的微生物、該脂肪酶的制造方法及用途C12N9/20);j氐溫孩b求菌(^fcracocc^awtorc"cws)T2所產生的j氐溫脂肪酶最適酶解溫度為35。C、pH8.0(劉洪杣，馬延和，薛燕芬，周培謹一種低溫脂肪酶及其編碼基因與生產方法公開號CN1611600A);適冷性海洋酵母(K3Traw/a/i^o/"/ca)5o;w&ea-9145，所產生的l氐溫脂肪酶的最適反應溫度為35。C,在0。C時保存20%的相對酶活力，最適pH8.5、pH4.0~9.0范圍內穩定，熱穩定性差(邵鐵娟，孫謐，鄭家聲，王躍軍，邱秀寶，Bo/^&ea"/"海洋低溫堿性脂肪酶研究微生物學報2004,6:789-792);南大洋深海嗜冷菌22521021,其產生的酶最適酶解條件為35°C、pH7.5;深海適冷假單胞菌(尸"wdowo"ossp.)KB700A產的低溫脂肪酶的最適酶活性溫度也為35°C;方金瑞從深海泥樣分離到的菌林EQ223產的低溫脂肪酶的最適作用溫度為10。C;適冷菌(尸"^owo"wsp.)B1121,產生的冷適應脂肪酶最適作用溫度為45。C(林學政，楊秀霞，邊際，黃曉航，南大洋深海嗜冷菌2-5-10-1及其低溫脂肪酶的研究海洋學報2005,5:154-158);氣單孢菌屬菌(^erawo"msp.)LPB4，所產生的低溫酶最適酶解溫度為10。C(//""-AT/丄eeAf/"扁Jwwgy4/m_Kw<a^5b"gMw^遷3，);假單孢菌i^wdomo"os>ag/，所產生的低溫脂肪酶最適酶解溫度為29°C、pH8,0(C/aw&aj/《w減ZwcaZ)eGVo/a，G7aw/wca5^wtoms叫Zi//a，2)耐冷假單胞菌屬(/^ewifowo"a^BTsl0022，該菌脂肪酶的最適酶解溫度為24。C、10。C可保持35。/。的相對酶活力；pH為8.0,在pH79范圍內具有較高的酶學特性(俞勇，李會榮，陳波，曾胤新，任大民，低溫脂肪酶產生菌的篩選、鑒定及其部分酶學性質高技術通訊2003,10:89-93);嗜冷桿菌屬(尸^c/zra^"ersp.)7195，該菌林所分泌的脂肪酶最適作用溫度為3(TC，最適pH值為9.0,對熱敏感，60。C熱處理10min,剩余酶活為30%,是典型的低溫酶。(張金偉，曾潤穎，南，及產低溫脂肪酶菌抹尸矽c/ra6acfersp.7195的選育、發酵條件及酶學性質研究生物不茲學2006,6(1):6-10);發光桿菌屬(尸/oto6a"en'wm)D2菌林所產脂肪酶的最適作用溫度在35""C左右，證明其脂肪酶為低溫酶，最適pH值為8(林容霞，馬延和，譚天偉，低溫脂肪酶產生菌的篩選及鑒定北京化工大學學報2006,33(1):31-35)。現報道的低溫脂肪酶產生菌主要以細菌為主，兼以少量真菌，而這些菌中有些菌株所產生的低溫脂肪酶由于其最適酶解罕度過低(<20°C)存在中溫條件下不穩定、使用與保藏中同樣需消耗能量而使其應用受到限制；有些菌可產生在室溫下具有較好酶解特性的低溫脂肪酶，但其最適酶解條件主要是在堿性范圍內(pH28.0),在酸性條件下其不能發揮較好的酶解特性，而部分菌^^朱所產生的脂肪酶最適酶解溫度接近于中溫脂肪酶。低溫脂肪酶因其獨特的酶解特性及用途而受到重視。目前，研究的低溫脂肪酶主要由耐冷性微生物菌種產生，可供研究的菌種較少。而每一種微生物菌產生的酶的特性存在差異，如酶的作用pH范圍與最適酶解pH、酶的作用溫度范圍與最適作用溫度，以及酶的熱穩定性等。
發明內容針對目前國內外有關低溫脂肪酶的研究工作剛剛展開，其低溫脂肪酶菌林性能及適合工業化生產方法還沒有健全的技術體系。本發明提供了一種低溫脂肪酶、產生該酶的微生物菌種及生產該低溫脂肪酶的方法。所述的低溫脂肪酶與常溫脂肪酶、高溫脂肪酶比較，在較低的作用溫度下可發揮較高的酶解特性。本發明通過對新疆阿勒泰、富蘊等典型高原低溫地區的環境土壤樣本進行微生物菌種的培養、分離與篩選，獲得一批耐低溫微生物菌林，并從中分離篩選出低溫脂肪酶產生菌抹，編號為GL-l,從而提供了一抹低溫脂肪酶產生菌，其具有生產低溫脂肪酶的優良特性，經;徵生物學分類與鑒定，屬于出芽絲孢酵母菌(7h'c/20^oraw/w〃w/a"s)。同時，本發明還提供了一種低溫脂肪酶，通過利用本發明的菌抹經過本發明確定的具體發酵工藝而獲得。本發明提供了一種低溫脂肪酶菌株，命名為GL-1，其能夠產生低溫脂肪酶。該菌抹已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院;微生物研究所，郵編100080，保藏曰期是2006年4月11日，保藏號是CGMCC.No1674。經微生物學鑒定為出芽絲孢酵母(7Hc/ws/oraw/7"〃w/ara)。該菌林培養溫度5-25°C，最適培養溫度20。C左右；優先生長于MZPG-a取r培養基表面(麥芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂30g、蒸餾水1L)，經20。C、24h培養，菌落呈白色、小米粒狀；培養48h后，菌落開始為酵母樣薄膜生長，隨后在中央出現細毛刺樣菌絲，后生成乳白色菌絲覆蓋，背面呈淡棕色；72h后菌落迅速增大，邊緣呈纖毛狀；細胞橢圓性，大小為(3~5)umx(5~9)um,芽殖；形成節孢子；參照《真菌鑒定手冊》等對GL-1菌林進行形態學測定，確定GL-1菌抹為絲孢酵母屬(Trichosporon)中的成員。依據微生物鑒定有關方法，對該菌株的生理生化特性及26SrDNA序列進行系統發育分析，確定GL-1菌抹為絲孢酵母屬出芽絲孢酵母(7Hc/o^oro"/3w〃w/aws，T/w〃w/am1)。T/w〃w/am1GL畫1可產生寸氏5顯月旨肪酶，在pH38、溫度4-45。C范圍內均有作用，其最適酶解條件為25~30°C、pH6.5。本發明進一步建立菌種保藏、復壯及選育的系統工藝流程技術。本發明的低溫脂肪酶微生物菌種rGL-1，其生物學特性如表1所示表1低溫脂肪酶產生菌rpW/w/mwGL-1生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>一+—本發明的低溫脂肪酶產生菌7:pw/Zw/araGL-1，其'26SrDNA序列如下:1GTTTCAAGACGGGTCGTTTAAAGCCATTATGCCAGCATCCTAAGCACGGACGTGTCCGAA61GACCGACCTACAAGAGGCGTGCTGCGTTCCTCAGTCCCGGGCGATGTATTCGAAAGCGGG121CTATAACACATCCGAGGATGCCACATTCCCGCCAACCTTTTCCACCGCCCAAAACTGATG181CTGGCCTGCAAACCGAGAAGTACACCGGCAGAACCGGCTGAGTCTCGGAAAGCATGACTG241ACTTCAATCGTTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTGTTTAACTCTCTTTCCAAAGTGCT301TTTCATCTTTCCCTCACGGTACTTGTTCGCTATCGGTTTCTCGCCAATATTTAGCTTTAG361ATGGAATTTACCACCCATTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTGAGAGCGCA421TCACAAAGCACTGGAGATCTGTGTCAAGGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGCCGTGTT481CCAACGGACTTGTACACAGGCCAGCACGGAAAACGCTTCTCTAGACTACAACTCGGACGA541TCTGAGACCGCCAGATTTTAAATTTGAGCTCATCCCGCTTCACTCGCCGTTACTAGGGGA601ATCCTTGGTAGTTTCTTTTCCTCCGCTTTTTT將GL-1的26SrDNA序列與Genebank中的同源序列進行對比及進化分析，GL-1的26SrDNA序列與73/^/w/"raAF189861同源性高達98°/0以ii上，且對其同源序列進行進化分析中，7:/w〃M/ara(AF189861)與GL-1分在同一分支，其進化拓樸結構如圖1所示。結合低溫脂肪酶產生菌GL-1的形態結構特性及生理生化特性，確定其為絲孢酵母屬的出芽絲孢酵母(73戸〃wAms)GL國1。作本發明低溫脂肪酶的產生菌種，既可為本發明所保護的菌抹，也可為自然篩選的原始菌抹，或為保護菌抹通過自然變異或人工誘導變異的變異菌抹，通過本發明所述的方法，均可實現本發明所闡述的技術效果。作為上述變異菌林的研制方法，包括物理誘變，如紫外線輻射處理、鈷60輻照處理、離子注入處理、激光輻照等各種射線處理；化學誘變，如亞硝基胍(ATG)、硫酸二乙酯等化學誘變劑處理，用常規脂肪酶產生菌分離篩選培養基及方法優選出生產性能優異的菌株。另外，也可通過分子生物學技術，從原始菌抹或誘導變異菌種中獲取低溫脂肪酶基因，以原菌核微生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等、真核微生物，如酵母等，作為基因受體菌，構建基因工程生產菌林，也可作為本發明的低溫脂肪酶產生菌種。作為本發明的低溫脂肪酶產生菌種rGL-1,可采用如下方法對其進行保存、活化與篩選，及其搖瓶發酵獲得本發明的低溫果膠酶。本發明的低溫脂肪酶產生菌rGL-1采用常規的斜面傳代保存法，此方法是將本發明菌種接種于只要適合于酵母菌生長的斜面培養基表面，15-25。C培養34天，再于4。C下低溫保藏，可存》文3個月左右，或是利用真空冷凍干燥法將本發明菌種制成干粉菌種，低溫或常溫保藏可達1年以上。長期保藏的菌種在使用時按如下方法進行活化、篩選。將長期保藏的本發明菌種接種于M7尸G-agw培養基或其它適合于酵母菌生長的培養基表面，1525。C培養3~4天；本發明優先選用培養基，其MKPG-agw培養基成分如下麥芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂30g、蒸餾水1000mL。再將培養后的菌種接種于脂肪酶篩選培養基上，其篩選培養基如下(NH4)2SO40.1%、K2HPO40.1%、NaC10.05%、MgS04.7H200.05%、FeS04.7H200.001%、酵母膏0.5%、瓊月旨2.5%、每1OOmL培養基中加入12mL橄欖油乳化液(橄欖油:2%的聚乙烯醇(PVA)=1:3)和lmL0.05。/o羅丹明(及/w^7m/"e)B、pH自然。接種菌林經20°C、2-3天培養，在紫外燈下菌落周圍可形成明顯的熒光變色圈。本領域技術人員所熟知，產生熒光變色圈意味著菌4朱可產生脂肪酶，這是一種成熟的技術，在眾多外文及中文文獻中均有報道，本發明挑取變色圈與菌落直徑比最大的菌林作為本發明的實驗菌林。、利用經活化篩選出的本發明的實驗菌抹進行發酵培養實驗，獲得本發明的低溫脂肪酶。在發酵培養過程中，可將斜面菌種直接接種于發酵培養基中，或是將菌種先進行液體增殖培養，再以5%-15%的接種量接種于發酵培養基中進行發酵培養。作為培養基的營養源，可廣泛使用通常用于培養的營養源。只要是可作為碳源同化的碳化合物或者是含有該碳化合物的，微生物菌種可利用的、適合于發酵培養產生菌本發明的低溫脂肪酶的碳源即可，例如，可使用淀粉、玉米粉、葡萄糖、麥芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。其用量依據其它營養源的選擇不同及培養條件的差異而有所不同，本發明中優選葡萄糖為最優碳源，其用量為0.5-1.0%。作為氮源，只要是可作為氮源同化的氮化合物或者是含有該氮化合物的即可，例如，可用銨鹽、硝酸鹽、大豆粉、肉類提取物、玉米浸漬液、玉米漿、酵母膏等。其氮源的選擇和用量，可依據其它營養源的成分和用量的不同而不同，只要選合于本發明的低溫脂肪酶產生菌的培養及酶的產生即可。在本發明中優選玉米漿、豆餅粉作為最佳的氮源，其用量均在0.5-2服作為無機鹽類，可適當添加磷酸氫氨、磷酸二氫鉀等的磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽等的鹽類。培養條件依培養基的組份多少而不同，但只要是適合于菌體培養產的、產生本發明中的脂肪酶的條件即可。作為產酶促進劑，可適量添加7Vee"系的表面活性劑、5DS等，添加量適培養基的不同而定，只要適宜促進培養過程產生本發明的果膠酶即可。通常，可選擇以下的條件進行培養。即，培養溫度為10~25°C,最好為15-25""C的范圍；培養時間約為48小時，只要在本發明的低溫脂肪酶的生產量達到最高時結束培養即可；培養基的pH可在6~8的生產范圍，特別是在7左右更適于本發明的脂肪酶的生產。經如上所述的培養，主要在菌體外(培養液中)產生目的產物的低溫脂肪酶。從如上所得的培養液中采集低溫脂肪酶，可按照通常用于采集細胞外酶的方法，如硫酸銨鹽析、超濾濃縮、冷凍干燥、色譜分離等，由分離、精制而進行。>即，可由下述方法獲得本發明的低溫脂肪酶由過濾法或離心分離法從培養液中分離菌體及培養基固形物，得到上清液或濾液，對該些分離液進行或不進行濃縮，添加可溶性鹽類，^f吏酶沉淀的鹽析法；添加親水性的有機溶劑，使酶或夾雜物沉淀的有機溶劑沉淀法；使用離子交換樹脂等的吸附脫離法；凝膠過濾法；添加穩定輔助劑或不添加穩定輔助劑的噴霧干燥法；單獨或多個組合使用冷凍干燥法等的分離或精制方法。通過本發明如上的闡述，得到后面實施例進一步的驗證，得知本發明低溫脂肪酶的酶學特性。本發明菌抹GL-1產生的低溫脂肪酶最適酶解pH為6.5左右，在pH5~8范圍內可保持較高的酶活性；在545。C范圍內均有酶特性，其最適作用溫度在2530。C;該低溫脂肪酶具有較高的熱穩定性，在30。C下保溫80分鐘，其酶活性仍可保持80%左右；金屬離子對低溫脂肪酶的活性具有一定的影響作用，其中K+對酶具有激活作用，Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Fe^對其活性無顯著影響、Cu2+、Mr々對酶活性具有抑制作用。通過實施本發明具體的技術指標，實現本
發明內容，可以達到以下有益效果。本發明的出芽絲孢酵母菌(7h'c/2o^oraw/"http://"/朋>5)菌林及在微生物分類學上來說與其同等的菌抹及其變異菌抹，可有效地用于產生本發明的低溫脂肪酶。再有，本發明的優點在于，使用所述菌株的制造具有上述性質的{氐溫脂肪酶的方法可有效i也產生所述的^f氐溫脂肪酶。附圖筒要說明圖1所示為基于本發明的出芽絲孢酵母菌GL-1的26SrDNA序列的進化分析拓樸結構圖。圖2所示為以本發明的出芽絲孢酵母菌GL-1產生的低溫脂肪酶反應pH和相對酶活性關系的圖。圖3所示為以本發明的出芽絲孢酵母菌GL-1產生的低溫脂肪酶反應溫度和相對酶活性關系的圖。圖4所示為以本發明的出芽絲孢酵母菌GL-1產生的低溫脂肪酶在各溫度下處理殘余酶活性的圖。圖5所示為以本發明的出芽絲孢酵母菌GL-1產生的低溫脂肪酶在各反應pH下處理殘余酶活性的圖。圖6所示為各種金屬離子對本發明的出芽絲孢酵母菌GL-1產生的低溫脂肪酶酶活性的影響作用。圖7所示為以p-硝基酚為標準品，OD值與p-硝基酚含量之間的關系。下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則％皆指重量百分比。具體實施方式實施例1:低溫脂肪酶產生菌(GL-1)的培養-I將本發明的低溫脂肪酶產生菌GL-1接種于油脂同化平板培養基中，其中(NH4)2SO40.1%;K2HP04(U%;NaC10.05%;MgS04.7H200.05%;FeS04'7H200.001%;酵母膏0.5%;瓊脂2.5%;自然pH;取橄欖油與2。/。的聚乙烯醇(PVA)以1:3的比例混合，10000r/min攪拌乳化5min，0.8kg/cm2滅菌30min后取12ml加入到100ml上述培養基中。20。C左右培養5~7天，則在本發明低溫脂肪酶產生菌的菌落周圍可形成透明圈。實施例2:低溫脂肪酶產生菌(GL-l)的培養-II將羅丹明//zo^wm'"eB配成0.05%的母液，以1.0%的量加入到實施例l的油脂同化培養基中，配制成羅丹明i/zo^m/weB顯色培養基。將本發明的低溫脂肪酶產生菌GL-1接種于上述培養基中，則在本發明低溫脂肪酶產生菌的菌落周圍會出現桔紅色的暈圈，在紫外燈下有紅色熒光圈。實施例3:低溫脂肪酶產生菌(GL-1菌林)的發酵培養將本發明的低溫脂肪酶產生菌接入麥芽汁液體種子培養基中，其中麥芽浸粉0.3;酵母膏0.3;蛋白胨0.5;葡萄糖1.0;1.0kg/cm2蒸汽滅菌15分鐘。20。C培養l2天后，以5%接種量接種于如下發酵培養基中。豆餅粉2.0，玉米漿2.0，葡萄糖1.0,K2HPO40.5，NaNO30.5，pH7.0，250ml三角瓶中，每瓶裝50ml，0.8kg/cm2蒸汽滅菌30分鐘。在20。C、200rpm下振蕩培養48h。培養后，離心分離去除菌體，得到低溫脂肪酶粗酶液，其發酵酶產量可達20U/mL。從如此所得的脂肪酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達到60%，靜置沉淀，得到部分的沉淀物，再以通常的方法溶解脫鹽后，所得的低溫脂肪酶溶液酶活力可達130U/ml。實施例4:^氐溫脂肪醃活性的測量方法依據中溫(是否可去掉)脂肪酶有關的測定方法，釆用比色測定法進行低溫脂肪酶活力的測定。以p-棕櫚酸硝基苯脂(yO-iV尸戶)為作用底物，以單位體積的單酶液在單位時間內其酶解產物p-硝基酚(/-m7rap/^"o/)的生成量進行酶活力的計算。其具體方法如下溶液A:90mgp-棕櫚酸硝基苯脂(/-A^尸)溶于30ml異丙醇中。溶液B:450mlpH7.5的磷酸緩沖液(0.067M)，并含有2g7H/oZ-100和0.5g阿拉伯膠。取2個試管，分別是對照管和樣品管。將兩試管中各加溶液B2.85ml及0.1ml底物溶液A(緩慢混合，新鮮配制而成，該溶液至少可穩定2h),3(TC水浴保溫5min,然后在對照管中加入已滅活的酶液0.05ml，樣品管中加入酶液0.05ml，立即混勻計時，在水浴中準確反應10min后在兩管中力口3ml0.5mol/LNaOH溶液終止反應。410nm分光光度計下測定酶催化產生的譜/的吸收值。酶活力計算以酶反應液OD值處于0.3-3.0的測定值為基礎并計算酶活。脂肪酶1個單位的定義是在pH6.5,30。C條件下，每分鐘釋放lpmolp-硝基酚所需的酶量。標準曲線制作時以p-硝基酚為標準品，見圖7。測定酶活時應對酶液進行適當的稀釋，使OD值在0.2-0.8的線性范圍內。酶活計算公式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>A—樣品酶活(U/ml)，A，一樣品酶液的吸光度OD值，A。""對應酶液的空白吸光度OD值，K—對硝基酚標準曲線的斜率，C。-對硝基酚標準曲線的截距，n—稀釋倍數，Vi—反應液的體積/ml，V2—酶液的體積/ml,t—反應時間/min。實施例5:作用pH對低溫脂肪酶酶活力的影響作用pH和最佳pH測定，以p-NPP為基質，4要前述的活性測試方法進行測定。測定的pH分別為48范圍內的不同的pH值。以測定酶活力最高的pH下酶活^直為對照，i殳定其相對酶活力為iq0%，則作用pH與酶活性的關系如圖2所示。本發明菌林GL-1產生的低溫脂肪酶在3(TC下其最適酶解pH為6.5,在pH58范圍內可保持較高的酶活性。實施例6:作用溫度與低溫脂肪酶酶活力的關系作用溫度及最佳溫度測定，以p-NPP為基質，與前述的活性測定方法相同，在540。C的范圍內的不同的反應溫度下進行測試。以測定酶活力最高的溫度下的酶活力值為對照，設定其相對酶活力為100%，則反應溫度和相對酶活性的關系如圖3所示。在545。C的溫度范圍內，本發明菌抹GL-1產生的低溫脂肪酶均呈現酶活性，其最佳酶,溫度為25~3(TC之間。在1535。C的測定溫度范圍內具有良好的酶學特性，在15。C下可保持80%左右的相對酶活力、10°C下仍可保持20%以上的相對酶活力。實施例7:低溫脂肪酶熱穩定性將實施例3所得到的低溫脂肪酶粗酶液在3(TC、pH6.5下保溫，然后按上述酶活性測定方法每隔20分鐘對其殘余酶活力進行測定。以未進行j呆溫處理的酶活力值為對照，i殳定其相對酶活力為100%,則此時的處理溫度和殘余活性的關系如圖4所示。本發明菌株GL-1所產生的低溫脂肪酶在30°C以下具有較好的熱穩定性，30。C保溫80分i中仍可保持80%左右的相對酶活力，具有較高的熱穩定性。實施例8:低溫脂肪酶的pH穩定性將實施例3所得到的低溫脂肪酶粗酶液按1:1的比例分別與pH2~11的緩沖液混合，在4。C下保溫12h，然后將酶液調回到最適作用pH值(pH6.5)，在30。C下測定殘余酶活。以pH6.5下的酶活力測定值為對照，設定其相對酶活力為100%,則此時的處理pH和殘余活性的關系如圖5所示。本發明菌林GL-1所產生的低溫脂肪酶在pH310的范圍內保持穩定。'實施例9:金屬離子對低溫脂肪酶酶活力的影響作用金屬離子對低溫脂肪酶的影響作用按上述酶活性測定法，在pH6.5的磷酸緩沖液中添加Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+，使其終濃度達到O.OIM。按上述測定方法對酶活性進行測定。以未加入金屬離子的為對照，設定其相對酶活力為100%，則金屬離子對酶活力的影響作用如圖6所示。K+對本發明的低溫脂肪酶具有一定的激活作用，Cu2+、Mn2+對酶活性具有不同程度的抑制作用，其余金屬離子對低溫脂肪酶無明顯的激活或抑制作用。'權利要求1、一種具有產生低溫脂肪酶能力的出芽絲孢酵母菌(Trichosporonpullulans)CGMCC.No.1674。2、一種低溫脂肪酶的生產方法，其包括，A:對出芽絲孢酵母菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>CGMCC.No.1674進行菌種活化培養步驟；B:利用步驟A獲得的活化菌種進行發酵步驟。3、如權利要求2所述的生產方法，其特征在于，在發酵培養基中，葡萄糖為最優碳源，其用量為0.5-1.0%;優選玉米漿、豆餅粉作為最佳的氮源，其用量均在O.5-2.0%。4、如權利要求2所述的生產方法，其特征在于，在發酵培養步驟中，菌株培養溫度5-25。C,菌種接種于培養基表面，在15~25°C、pH6~8培養3~4天，再將培養后的菌種接種于脂肪酶篩選培養基上，接種量為5%-15%,接種菌抹經2(TC、2-3天培養，在紫外燈下菌落周圍可形成明顯的熒光變色圈。5、如權利要求3所述的生產方法，其特征在于發酵中，最適發酵培養溫度為15-25。C,最適pH為7。6、一種低溫脂肪酶，其利用權利要求1所述的出芽絲孢酵母菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>CGMCC.No.1674,由權利要求2所述的生產方法制備而成。7、如權利要求6所述的低溫脂肪酶，其特征在于，該低溫脂肪酶在PH5~8、545。C范圍內均有酶特性，其最適酶解溫度在2530。C，酶活達20U/mL-130U/ml并在15。C下可保持80%左右的相對酶活力、10。C下仍可保持20%以上的相對酶活力，在30。C以下具有較好的熱穩定性，30。C保溫80分鐘仍可保持80%左右的相對酶活力，具有較高的熱穩定性。8、如權利要求6所述的低溫脂肪酶，其特征在于，金屬離子對低溫果膠酶的活性有影響作用，其中r對具有激活作用、Cu2+、Mn'+對其酶學活性具有抑制作用。9、如權利要求7所述的低溫脂肪酶，其特征在于，最適酶解pH為6.5左右，最適作用溫度在2530。C。全文摘要本發明公開了一種產生低溫脂肪酶的出芽絲孢酵母(Trichosporonpullulans)和利用此菌株生產低溫脂肪酶的生產方法，同時還提供了低溫脂肪酶。通過利用出芽絲孢酵母(CGMCC.No.1674)，建立菌種保藏、復壯及選育的系統方法，經過培養基配方優化篩選及發酵工藝條件優化控制，確立了穩定的發酵方法，生產的低溫脂肪酶具有良好的低溫活性、高酶活。可廣泛用于洗滌、食品加工、皮革加工、助消化劑、有機合成化工產品、香料、藥物制備、油脂加工等行業，并具有重要意義。文檔編號C12N9/20GK101130757SQ20061010657公開日2008年2月27日申請日期2006年7月14日優先權日2006年7月14日發明者馮懷蓉,唐琦勇,張志東,軍茆,顧美英申請人:新疆農業科學院微生物應用研究所