專利名稱：一種用于骨修復的礦化多肽材料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用于骨修復的礦化多肽材料及其制備方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
目前臨床骨修復所用到的自體骨和異體骨存在來源短缺、免疫排斥和感染疾病的危險。生物骨組織的主要成分是膠原和羥基磷灰石。純的羥基磷灰石具有優異的生物相容性、骨傳導性和生物活性，已被廣泛用于整形外科手術和齒科手術。但是純的羥基磷灰石脆性大，韌性差，并且易從植入部位脫落，在臨床上限制了它的使用。在已有技術中，本申請人曾經提出了名稱為“納米相鈣磷鹽/膠原/聚乳酸骨復合多孔材料的制備方法”、申請號為00107493.8、公開號為CN 1272383A的專利申請，該多孔材料對骨缺陷和骨折有良好的醫療效果。但由于目前所用膠原主要來源于動物，存在病毒隱患和免疫反應的風險。
與動物源膠原相比，多肽不僅具有膠原的固有特性，如生物相容性、生物降解性、生物粘附性、促新細胞形成和促上皮細胞形成，而且具有無病毒隱患、可加工性和低排異反應等特點，可被廣泛應用于醫學、美容、保健品和化妝品等多個行業。所以采用基因工程方法生產的多肽制備骨修復材料可以解決以往骨修復材料的病毒隱患和免疫排斥反應問題。
發明內容
本發明的目的是提出一種用于骨修復的礦化多肽材料及其制備方法，用人工合成的多肽材料替代已有技術中的膠原，以避免病毒隱患和免疫反應。
本發明提出的用于骨修復的礦化多肽材料，其微結構為附著鈣磷鹽晶體的多肽纖維的三維網絡，其中的纖維由包裹著納米鈣磷鹽晶體的多肽組成。
上述礦化多肽材料中的多肽的氨基酸序列具有重復的Gly-X-Y結構，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分別為甘氨酸之外的任何一種氨基酸。
上述礦化多肽材料中的納米鈣磷鹽晶體可以為羥基磷灰石、二水合磷酸氫鈣、磷酸氫鈣或磷酸八鈣中的任何一種。
本發明提出的制備上述用于骨修復的礦化多肽材料的方法，包括以下步驟(1)在濃度為1.5×10-4-1.5×10-2g/ml的多肽的酸溶液或水溶液中邊攪拌邊滴加含有鈣離子的溶液，滴加量為每克多肽滴加鈣離子0.003～0.053mol，其中酸為鹽酸、乙酸、硝酸中的一種；(2)在步驟(1)的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含有磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子與鈣離子的摩爾比為Ca∶P＝1-2∶1；(3)在步驟(2)的溶液中邊攪拌邊滴加堿液，調節pH值為7.4-10；(4)將步驟(3)的溶液攪拌后靜置，待沉淀與上清分層后，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水洗滌去除其中的可溶性鹽分，使洗滌液呈中性；(5)將沉淀物放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨，即得所述的礦化多肽材料。
本發明提出的用于骨修復的礦化多肽材料，含有多肽和納米鈣磷鹽，其中的多肽可以替代以往廣泛用于骨修復材料的膠原，由于多肽由人工合成，因此可以大大減小病毒隱患和免疫排斥反應。本發明的礦化多肽材料，成份和結構接近天然骨，其鈣磷鹽晶體為納米尺寸，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可促進骨再生，并隨新骨的生成最終降解。而且本發明解決了以往骨材料存在病毒隱患和免疫反應的問題，在治療骨缺損和骨折等骨修復中可達到自體骨的效果，是一種具有優異的骨誘導性能和廣泛應用前景的新型骨材料。
圖1為本發明方法制備的礦化多肽材料的掃描電鏡(SEM)照片。
圖2為圖1所示的礦化多肽材料的透射電鏡(TEM)和選區電子衍射(SAED)圖。
具體實施例方式
本發明提出的用于骨修復的礦化多肽材料，其微結構為附著鈣磷鹽晶體的多肽纖維的三維網絡，其中的纖維由包裹著納米鈣磷鹽晶體的多肽組成。其中的多肽的氨基酸序列具有重復的Gly-X-Y結構，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分別為甘氨酸之外的任何一種氨基酸。其中的納米鈣磷鹽晶體可以為羥基磷灰石(HA)、二水合磷酸氫鈣(DCPD)、磷酸氫鈣(DCP)、磷酸八鈣(OCP)和其他存在于天然骨中的礦物。
本發明提出的制備上述用于骨修復的礦化多肽材料的方法，包括以下步驟(1)在濃度為1.5×10-4-1.5×10-2g/ml的多肽的酸溶液或水溶液中邊攪拌邊滴加含有鈣離子的溶液，滴加量為每克多肽滴加鈣離子0.003～0.053mol，其中酸為鹽酸、乙酸、硝酸中的一種；(2)在步驟(1)的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含有磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子與鈣離子的摩爾比為Ca∶P＝1-2∶1；(3)在步驟(2)的溶液中邊攪拌邊滴加堿液，調節pH值為7.4-10；(4)將步驟(3)的溶液攪拌后靜置，待沉淀與上清分層后，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水洗滌去除其中的可溶性鹽分，使洗滌液呈中性；(5)將沉淀物放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨，即得所述的礦化多肽材料。
在上述制備方法中，步驟(1)所述的含鈣離子的溶液為氫氧化鈣和鈣鹽中的任何一種，鈣鹽優選為硝酸鈣、氯化鈣；在上述制備方法中，步驟(2)所述的含磷酸根離子的溶液為磷酸和磷酸鹽的任何一種，磷酸鹽優選為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二氨、磷酸二氫氨。
本發明中用到的多肽首選合成多肽，如利用重組DNA技術，通過適合的表達宿主如細菌(例如大腸桿菌)獲得的多肽。
本發明的實施例中所用的多肽為發酵的大腸桿菌中獲得的多肽，這種水溶性的多肽是西安巨子生物技術股份有限公司生產的，其氨基酸序列為HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD HPM GAPGPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GAL GAHGPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAPGPA GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPAGPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAPGAT GLS AGA THG LVT CGL以下介紹
具體實施例方式
實施例11)將60g固含量1％的液態多肽溶于300ml去離子水中，滴加40ml濃度為0.5mol/L的CaCl2溶液后，繼續緩慢加入濃度為0.5mol/L的H3PO4溶液24ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液，直至pH值穩定為7.4。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例21)將70g固含量1％的液態多肽溶于4500ml去離子水中，加入10ml濃度為0.2mol/L的Ca(NO3)2溶液后，繼續緩慢滴加濃度為0.2mol/L的Na2HPO4溶液10ml，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液，直至pH值穩定為10.0。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
實施例31)將1.5g固態多肽溶于100ml去離子水中，加入濃度為2mol/L的Ca(NO)3溶液40ml，繼續緩慢滴加40ml濃度為1mol/L的KH2PO4溶液后，滴加的同時用磁力攪拌器混合均勻。
2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加KOH溶液，直至pH值為8.0。
3)將上述體系攪拌、靜置，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復洗滌去掉其中的鹽分并達到中性后，放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨制得干粉。
圖1為由本發明方法的實施例1制備的礦化多肽材料的掃描電鏡(SEM)照片。圖中的標尺為1微米(1μm，圖中顯示為“um”)。這些纖維大約為30nm寬、500nm長，由覆蓋著納米羥基磷灰石的多肽構成。
圖2顯示了圖1所示的礦化多肽骨材料的透射電鏡(TEM)和選區電子衍射(SAED)圖。從圖中可以看出，礦化的多肽纖維由直徑約6nm長度不等的納米棒組成，這些納米棒排列起來形成圖1所示的纖維。
在選區電子衍射花樣中，環形衍射對應羥基磷灰石的211晶面。兩對弧形衍射分別對應羥基磷灰石的002和004晶面，意味著羥基磷灰石的c軸為擇優取向。礦化多肽的這個特點與天然骨類似。在骨中，羥基磷灰石的c軸大致平行于膠原纖維長軸。
這些圖片證明該材料中的多肽是礦物形核和生長的模板，本發明確實對天然骨的微結構進行了仿生。
序列表<160>1<210>1<211>1071<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1His Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val1 5 10 15Thr Gln Leu Asn Arg His Leu Ala His Ala His Pro Pro Phe Ala Ser20 25 30Asp His Pro Met Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro35 40 45Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly50 55 60Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala65 70 75 80Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala85 90 95
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly100 105 110Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro115 120 125Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala130 135 140Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly145 150 155 160Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala165 170 175Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro180 185 190Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly195 200 205Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala210 215 220Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala225 230 235 240
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly245 250 255Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro260 265 270Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala275 280 285Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His Gly290 295 300Pro Ala Gly Ala Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Pro305 310 315 320Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Ala His Gly Pro Ala325 330 335Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly340 345 350Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala355 360 365Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro370 375 380Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
385 390 395 400Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala405 410 415Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala420 425 430Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly435 440 445Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro450 455 460Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala465 470 475 480Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly485 490 495Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala500 505 5l0Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro515 520 525Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly530 535 540
Pro Pro Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro545 550 555 560Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His565 570 575Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Ala Gly580 585 590Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser595 600 605Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro610 615 620Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly625 630 635 640Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro645 650 655Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro660 665 670Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly675 680 685
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro690 695 700Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro705 710 715 720Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly725 730 735Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser740 745 750Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro755 760 765Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly770 775 780Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His Gly Pro785 790 795 800Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His805 810 815Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly820 825 830
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro835 840 845Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro850 855 860Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly865 870 875 880Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser885 890 895Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro900 905 910Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly915 920 925Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala930 935 940Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala945 950 955 960Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly965 970 975Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro
980 985 990Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala995 1000 1005Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His1010 1015 1020Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu1025 1030 1035Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala Met Gly Ala Pro1040 1045 1050Gly Ala Thr Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr His Gly Leu Val Thr1055 1060 1065Cys Gly Leu1070
權利要求
1.一種用于骨修復的礦化多肽材料，其特征在于該多肽材料的微結構為附著鈣磷鹽晶體的多肽纖維的三維網絡，其中的纖維由包裹著納米鈣磷鹽晶體的多肽組成。
2.如權利要求1所述的礦化多肽材料，其特征在于其中所述的多肽的氨基酸序列具有重復的Gly-X-Y結構，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分別為甘氨酸之外的任何一種氨基酸。
3.如權利要求1所述的礦化多肽材料，其特征在于其中所述的納米鈣磷鹽晶體為羥基磷灰石、二水合磷酸氫鈣或磷酸八鈣中的任何一種。
4.一種制備如權利要求1所述的用于骨修復的礦化多肽材料的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)在濃度為1.5×10-4-1.5×10-2g/ml的多肽的酸溶液或水溶液中邊攪拌邊滴加含有鈣離子的溶液，滴加量為每克多肽滴加鈣離子0.003～0.053mol，其中酸為鹽酸、乙酸、硝酸中的一種；(2)在步驟(1)的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含有磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子與鈣離子的摩爾比為Ca∶P＝1-2∶1；(3)在步驟(2)的溶液中邊攪拌邊滴加堿液，調節pH值為7.4-10；(4)將步驟(3)的溶液攪拌后靜置，待沉淀與上清分層后，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水洗滌去除其中的可溶性鹽分，使洗滌液呈中性；(5)將沉淀物放入凍干機內冷凍干燥，隨后將干燥物研磨，即得所述的礦化多肽材料。
全文摘要
本發明涉及一種用于骨修復的礦化多肽材料，屬于生物工程技術領域。其微結構為附著鈣磷鹽晶體的多肽纖維的三維網絡，其中的纖維由包裹著納米鈣磷鹽晶體的多肽組成。其中多肽的氨基酸序列具有重復的Gly－X－Y結構，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分別為甘氨酸之外的任何一種氨基酸，其中納米鈣磷鹽晶體可以為羥基磷灰石、二水合磷酸氫鈣等。本發明的礦化多肽材料，成份和結構接近天然骨，其鈣磷鹽晶體為納米尺寸，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可促進骨再生，并隨新骨的生成最終降解。本發明解決了以往骨材料存在病毒隱患和免疫反應，在治療骨缺損和骨折等骨修復中可達到自體骨的效果，具有優異的骨誘導性能。
文檔編號A61L27/54GK1958082SQ20061011299
公開日2007年5月9日 申請日期2006年9月14日 優先權日2006年9月14日
發明者崔福齋, 王玉, 胡堃 申請人:清華大學, 北京奧精醫藥科技有限公司