專利名稱：具有多種生物活性的多肽營養劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種活性多肽的制備方法及應用，尤其涉及一種以乳蛋白為原料，制備具有多種生物活性的多肽營養劑的方法及應用。
發明技術背景牛奶中蛋白質經蛋白水解成為多肽后，這些多肽具備多種生物活性，其中與內啡肽作用相似的多肽能夠產生鎮靜作用和抑制食欲的作用，幫助對抗壓力，改善睡眠和控制體重，幫助減肥；其中具有免疫調節功能的多肽，通過刺激免疫細胞增殖和成熟，刺激免疫細胞活性而起到調節人體免疫功能的作用；具有抗微生物功能的多肽，能夠有效抑制人體內微生物的繁殖；抗凝血作用的多肽，能夠抑制血小板凝集，防止血栓形成，預防動脈粥樣硬化；而具有降壓作用的多肽，則通過抑制血管緊張素轉換酶(ACE)的作用，阻止血管緊張素I轉變為血管緊張素II，對抗高血壓；磷酸多肽具有吸附金屬離子在人體小腸下部弱堿性區域形成可溶性金屬鹽，促進鈣、鐵、鋅、鎂等人體微量元素的吸收，并具有防止齲齒作用。乳蛋白活性多肽的上述作用已經被多項動物實驗和人體試驗所證實。
現代研究證實，小分子多肽比等量游離氨基酸具有更高的生物活性和營養價值，按照多肽類的氨基酸的組成不同，其功能和生物學效應也不同，而且，多肽類可以通過腸道全部吸收利用，直接通過血液循環轉運至全身不同的器官和組織，直接發揮生物活性功能，而蛋白質則不能直接吸收利用，必須通過消化才能吸收，利用率也低。
作為人體重要蛋白質來源的牛奶蛋白，盡管營養豐富，但是部份人群對牛奶過敏，尤其嬰幼兒對牛奶蛋白過敏的現象普遍存在，限制了其應用，但是通過蛋白水解過程將蛋白質降解為多肽后，過敏現象明顯改善，既使對牛奶過敏的人群，也能應用經乳蛋白水解后的乳蛋白多肽。
現代研究進一步證實，人體腸道內寄生的乳酸桿菌類細菌，對各種免疫球蛋白和過敏原有對抗作用，經過乳酸桿菌降解的蛋白質致敏性明顯降低，并能同時誘發人體的免疫耐受現象，具有明顯的抗過敏效應。
從人體腸道分離的乳酸桿菌(Lactobacillus GG，美國菌種收集中心編號ATCC53103)在實驗室中已經被證實能夠促進人體免疫球蛋白A對抗飲食中致敏原所致的過敏反應(Isolauri et al.1993)。
目前，乳蛋白水解主要通過蛋白分解酶水解的方法進行蛋白水解過程，中國專利(申請號00813554)公布的技術介紹了應用蛋白水解產物給對牛奶過敏的嬰幼兒，美國專利(5405835)公開的技術介紹了用蛋白分解酶水解乳蛋白的方法，但是上述方法并不具有上述乳酸桿菌分解蛋白產生的抗過敏作用，而且，上述方法制備的多肽并未經過超濾過程，不能控制蛋白水解多肽產品的分子量大小。
本發明所要解決的技術問題是，通過組合多種蛋白分解方法制備具有抗過敏作用及多項生物活性的乳蛋白多肽。
發明內容
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案，其特征是，以牛奶和各種乳蛋白為原料，通過接種乳酸桿菌在乳蛋白溶液內，初步水解乳蛋白，滅菌過濾后，用蛋白水解酶進一步分解蛋白質，在水解過程中，用超濾膜分離過濾已完全水解的小分子多肽，讓大分子量蛋白質持續水解，最后通過超濾膜濃縮后干燥制粉，內含抗過敏及多項生物活性的多肽。
本發明的技術特征是，采用的原料可以是新鮮牛奶、冷凍牛奶、脫脂牛奶、酪蛋白粉、干酪酸鈉、干酪酸鉀、工業干酪素、甜乳清粉、酸乳清粉、濃縮乳清蛋白粉，也可以是制備干酪后的副產品乳清。如果采用新鮮牛奶或冷凍牛奶作為原材料，則需要采用離心方式脫脂，并采用高溫進行巴氏消毒，離心速度為4,000～6,000轉/分，離心時間為20～40分鐘，巴氏消毒在0.2Mpa，130℃溫度，持續5～15分鐘；如果是采用脫脂無糖奶粉、各種乳清蛋白粉、酪蛋白粉作為原料，則應加蒸餾水調配成濃度為10％的蛋白溶液，溶解過程中，可以加熱至50℃幫助溶解過程；如果是以干酪酸鈉或干酪酸鉀為原料，則應用蒸餾溶解后，加酸劑調PH至4.6，加熱至40～50℃凝固酪蛋白，離心后收集凝固的酪蛋白，調PH至6.5～7.5溶解酪蛋白。
本發明的技術特征是，采用乳酸桿菌進行初步蛋白水解過程，以降低過敏性，提高抗過敏作用，選擇的乳酸桿菌是正常寄生于人體胃腸道的乳酸桿菌，這些乳酸桿菌可以通過分泌蛋白分解酶而發揮水解蛋白的作用，選擇的乳酸桿菌在美國菌種收集中心編號為ATCC53103(Strain Lactobacillus GG)，也可以選擇短乳酸桿菌作為蛋白分解的乳酸桿菌菌種。
本發明的技術特征是，在35℃±1℃溫度下接種培養成熟的乳酸桿菌液體菌種，加入量為10±2％(體積/體積百分比)，培養時間為72～96小時，在培養前期3～5小時應在有微量通風且有攪拌的條件下進行，在培養結束后，高溫滅菌，溫度為120～135℃，持續時間為10～20分鐘，滅菌后用分子量為0.1mu.m的微濾膜分離過濾細菌，收集水解的蛋白溶液上清液。
本發明的技術特征是，在被乳酸桿菌蛋白水解的蛋白水解上清液內加入胰蛋白酶，加酶量為0.02～0.6％，調PH值為3～6，在30℃～50℃溫度下酶解2～8小時，水解蛋白質，在酶解過程結束后，迅速升溫至90℃保溫5分鐘，滅活胰蛋白酶，用分子量為8,000～12,000的超濾膜分離過濾蛋白水解溶液，去除未完全水解的大分子蛋白，收集過濾上清液，噴霧干燥或真空干燥成粉。
本發明的技術特征是，為了保證蛋白水解過程更徹底，一種改良的方法可能會產生更好的效果，這種方法的程序是，在用蛋白分解酶進行蛋白水解1小時后，采用交錯切面流體超濾裝置并采用分子量為10,000D的超濾膜，持續對已部份水解的蛋白水解液分離，分子量小于10,000的小分子多肽被收集，而大分子量的未水解蛋白再循環到酶解反應鍋內繼續水解，反復循環，直至水解過程結束。
本發明的技術特征是，本發明方法制備的具有多種生物活性的多肽，具有抗過敏，抗高血壓，促進鈣、磷、鐵、鋅等微量元素吸收，降低膽固醇，改善脂質代謝，抗血栓，防止動脈粥樣硬化，促進大腦及神經發育，提高記憶力，防止微生物繁殖，調節免疫功能，對抗壓力，改善睡眠，抑制食欲，控制體重等多種作用。
本發明的技術特征是，本發明方法制備的活性多肽中，含有VAF、LLF、SPYL、Ala-Arg-Ala-Lys，Leu-Pro-Leu-Arg-Phe等多肽，通過抑制血管緊張素轉換酶(ACE)，產生對抗高血壓和延緩動脈硬化的作用，含有的VEPIPY多肽能夠和免疫球蛋白結合，形成MAbIC3，這種抗體能夠增強人體免疫功能；其中X-酪蛋白、P-酪蛋白和K-酪蛋白水解后產生的YPFPGPI肽，YPFP-NH2肽，RYLGYLE肽，SRYPSY-OME肽具有內啡肽樣作用，除具有鎮靜、鎮痛作用外，還能幫助對抗壓力，改善睡眠，并具有抑制食欲，減少胃腸蠕動而發揮控制體重作用；其中磷酸多肽促進人體吸收鈣、鐵、鋅、鎂等微量元素；其中的AVPYP肽、GLY-His-Lys肽，Lys-His-Gly-NH2肽具有催乳功能；此外，活性多肽還具有促進大腦及神經發育，提高記憶力，抗毒解毒，促進細胞繁殖，增強吞噬細胞功能，激活β淋巴細胞，保護皮膚，防止黑色素沉淀，促進松果體再生等多種作用。
本發明的技術特征是，本發明方法制備的活性多肽中基本不含致敏的蛋白質，并具有抗過敏及誘發免疫耐受作用，而且其中含有多種人類必需氨基酸和非必需氨基酸，適合用于對牛奶過敏的嬰幼兒及其他人群作為營養補充劑。
本發明的技術特征是，本發明方法制備的活性多肽，可以作為食品添加劑或營養強化劑制備活性肽嬰幼兒奶粉、活性肽兒童保健食品、活性肽中老年保健食品、保健飲料、運動員專用增強體能飲料、活性肽康復食品等多種強化功能食品或保健食品，也可以作為生物活性組份，制備具有治療作用的特殊保健食品，包括但不限于降壓保健食品，防治冠心病保健食品，改善睡眠保健食品，減肥保健食品，增強免疫功能的保健食品，防治骨質疏松的保健食品等。
本發明的技術特征是，本發明方法制備的活性多肽，也可以與藥物輔料制備成各種藥劑形式，包括但不限于口服液、片劑、沖劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、水劑、散劑、軟膠囊劑、膜劑等多種劑型，以口服方式施用。
本發明的有益效果是，通過乳酸桿菌和蛋白水解酶的雙重蛋白水解作用，以及超濾分離，獲得的多肽分子量得到很好控制，從而消除過敏性，增加多種活性多肽數量，發揮更強的生物活性。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明實施例1以牛奶為原料制備活性多肽收集新鮮牛奶100升，以離心方式脫脂，離心速度6000轉/分，離心時間20分鐘，脫脂牛奶以130℃高溫持續10分鐘進行巴氏消毒，采用已培養成熟的短乳酸桿菌液體菌種，投料量為10％，投料后充分攪拌并保持微量通風3～5小時，培養時間90小時，以120℃高溫持續15分鐘殺滅乳酸桿菌，以孔徑為0.1mu.m的微濾膜濾除乳酸桿菌，收集過濾上清液，加入0.4％的胰蛋白酶，調節PH值至5.5在50℃溫度下酶解6小時，酶解完成后升溫至90℃維持10分鐘滅活胰蛋白酶，用分子量為10,000D的超濾膜，采用交錯切面流體超濾裝置(美國Pall公司生產的TFF裝置)過濾分離，去除末完全水解的大分子蛋白，收集超濾上清液直接噴霧干燥成粉，內含多種生物活性多肽。
實施例2測試蛋白水解液各項指標采集實施例1制備的干粉進行測試，水解度91％，氨基氮260/ml，TCA可溶性氮350mg/ml，MM＞500＝18.5％，1000＞MM＞500＝16.8％，2000＞MM＞1000＝28.2％，3000＞MM＞2000＝13.8％，5000＞MM＞3000＝17.5％，MM＞5000＝5.2％。
權利要求
1.本發明涉及一種活性多肽的制備方法及應用，尤其涉及一種以乳蛋白為原料，制備具有多種生物活性的多肽營養劑的方法及應用，其特征是，以牛奶和各種乳蛋白為原料，通過接種乳酸桿菌在乳蛋白溶液內，初步水解乳蛋白，滅菌過濾后，用蛋白水解酶進一步分解蛋白質，在水解過程中，用超濾膜分離過濾已完全水解的小分子多肽，讓大分子量蛋白質持續水解，最后通過超濾膜濃縮后干燥制粉，內含抗過敏及多項生物活性的多肽。
2.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，采用的原料可以是新鮮牛奶、冷凍牛奶、脫脂牛奶、酪蛋白粉、干酪酸鈉、干酪酸鉀、工業干酪素、甜乳清粉、酸乳清粉、濃縮乳清蛋白粉，也可以是制備干酪后的副產品乳清，如果采用新鮮牛奶或冷凍牛奶作為原材料，則需要采用離心方式脫脂，并采用高溫進行巴氏消毒，離心速度為4,000～6,000轉/分，離心時間為20～40分鐘，巴氏消毒在0.2Mpa，130℃溫度，持續5～15分鐘；如果是采用脫脂無糖奶粉、各種乳清蛋白粉、酪蛋白粉作為原料，則應加蒸餾水調配成濃度為10％的蛋白溶液，溶解過程中，可以加熱至50℃幫助溶解過程；如果是以干酪酸鈉或干酪酸鉀為原料，則應用蒸餾溶解后，加酸劑調PH至4.6，加熱至40～50℃凝固酪蛋白，離心后收集凝固的酪蛋白，調PH至6.5～7.5溶解酪蛋白。
3.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，采用乳酸桿菌進行初步蛋白水解過程，以降低過敏性，提高抗過敏作用，選擇的乳酸桿菌是正常寄生于人體胃腸道的乳酸桿菌，這些乳酸桿菌可以通過分泌蛋白分解酶而發揮水解蛋白的作用，選擇的乳酸桿菌在美國菌種收集中心編號為ATCC53103(Strain Lactobacillus GG)，也可以選擇短乳酸桿菌作為蛋白分解的乳酸桿菌菌種。
4.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，在35℃±1℃溫度下接種培養成熟的乳酸桿菌液體菌種，加入量為10±2％(體積/體積百分比)，培養時間為72～96小時，在培養前期3～5小時應在有微量通風且有攪拌的條件下進行，在培養結束后，高溫滅菌，溫度為120～135℃，持續時間為10～20分鐘，滅菌后用分子量為0.1mu.m的微濾膜分離過濾細菌，收集水解的蛋白溶液上清液。
5.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，在被乳酸桿菌蛋白水解的蛋白水解上清液內加入胰蛋白酶，加酶量為0.02～0.6％，調PH值為3～6，在30℃～50℃溫度下酶解2～8小時，水解蛋白質，在酶解過程結束后，迅速升溫至90℃保溫5分鐘，滅活胰蛋白酶，用分子量為8,000～12,000的超濾膜分離過濾蛋白水解溶液，去除未完全水解的大分子蛋白，收集過濾上清液，噴霧干燥或真空干燥成粉。
6.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，為了保證蛋白水解過程更徹底，一種改良的方法可能會產生更好的效果，這種方法的程序是，在用蛋白分解酶進行蛋白水解1小時后，采用交錯切面流體超濾裝置并采用分子量為10,000D的超濾膜，持續對已部份水解的蛋白水解液分離，分子量小于10,000的小分子多肽被收集，而大分子量的未水解蛋白再循環到酶解反應鍋內繼續水解，反復循環，直至水解過程結束。
7.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，本發明方法制備的具有多種生物活性的多肽，具有抗過敏，抗高血壓，促進鈣、磷、鐵、鋅等微量元素吸收，降低膽固醇，改善脂質代謝，抗血栓，防止動脈粥樣硬化，促進大腦及神經發育，提高記憶力，防止微生物繁殖，調節免疫功能，對抗壓力，改善睡眠，抑制食欲，控制體重等多種作用。
8.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，本發明方法制備的活性多肽中，含有VAF、LLF、SPYL、Ala-Arg-Ala-Lys，Leu-Pro-Leu-Arg-Phe等多肽，通過抑制血管緊張素轉換酶(ACE)，產生對抗高血壓和延緩動脈硬化的作用，含有的VEPIPY多肽能夠和免疫球蛋白結合，形成MAbIC3，這種抗體能夠增強人體免疫功能；其中X-酪蛋白、P-酪蛋白和K-酪蛋白水解后產生的YPFPGPI肽，YPFP-NH2肽，RYLGYLE肽，SRYPSY-OME肽具有內啡肽樣作用，除具有鎮靜、鎮痛作用外，還能幫助對抗壓力，改善睡眠，并具有抑制食欲，減少胃腸蠕動而發揮控制體重作用；其中磷酸多肽促進人體吸收鈣、鐵、鋅、鎂等微量元素；其中的AVPYP肽、GLY-His-Lys肽，Lys-His-Gly-NH2肽具有催乳功能；此外，活性多肽還具有促進大腦及神經發育，提高記憶力，抗毒解毒，促進細胞繁殖，增強吞噬細胞功能，激活β淋巴細胞，保護皮膚，防止黑色素沉淀，促進松果體再生等多種作用。
9.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，本發明方法制備的活性多肽，可以作為食品添加劑或營養強化劑制備活性肽嬰幼兒奶粉、活性肽兒童保健食品、活性肽中老年保健食品、保健飲料、運動員專用增強體能飲料、活性肽康復食品等多種強化功能食品或保健食品，也可以作為生物活性組份，制備具有治療作用的特殊保健食品，包括但不限于降壓保健食品，防治冠心病保健食品，改善睡眠保健食品，減肥保健食品，增強免疫功能的保健食品，防治骨質疏松的保健食品等。
10.按照權利要求1所述的方法，本發明的技術特征是，本發明方法制備的活性多肽，也可以與藥物輔料制備成各種藥劑形式，包括但不限于口服液、片劑、沖劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、水劑、散劑、軟膠囊劑、膜劑等多種劑型，以口服方式施用。
全文摘要
本發明涉及一種活性多肽的制備方法及應用，尤其涉及一種以乳蛋白為原料，制備具有多種生物活性的多肽營養劑的方法及應用，其特征是，以牛奶和各種乳蛋白為原料，通過接種乳酸桿菌在乳蛋白溶液內，初步水解乳蛋白，滅菌過濾后，用蛋白水解酶進一步分解蛋白質，在水解過程中，用超濾膜分離過濾已完全水解的小分子多肽，讓大分子量蛋白質持續水解，最后通過超濾膜濃縮后干燥制粉，內含抗過敏及多項生物活性的多肽。
文檔編號A61K35/20GK1557476SQ20041001611
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月4日 優先權日2004年2月4日
發明者高春平 申請人:高春平