天然蝎毒多肽制備方法及其在骨髓造血功能保護的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種天然蠟毒多膚、及其制備方法和應用。具體設及一種從東亞錯蠟 (Buthus martensii Karsch)的蠟毒中分離得到一種新的天然多膚，及其在制備骨髓造血 功能保護作用藥物中的應用。 技術背景
[0002] 全世界蠟目分6科，70屬，約800余種，中國境內主要為東亞錯蠟，后者在歷史上一 直作為我國傳統、名貴中藥之一的"全蠟"而享譽海內外。蠟毒為蠟尾節毒囊中排泌出來的 一種有毒分泌物，是全蠟治療疾病的主要有效部位，其對腫瘤、疼痛、屯、血管疾病的療效較 全蠟強數倍。蠟毒W毒攻毒的藥理作用是建立在全蠟及蠟尾千百年來大量臨床應用的基礎 之上，具有鮮明的民族特色。
[0003] 蠟毒是一個巨大的生物資源寶庫，其中大部分是具有藥理學活性的多膚類。目前， 蠟毒中已分離出的蠟毒素大約有30種左右，主要是由35~70個氨基酸所組成的短膚，分 子量約在4000~9000D之間，抑變化對蠟毒素的毒性影響不大，在加熱至100°C并持續 15~30min后，毒性依然較強。國外在蠟毒方面的研究始于十九世紀末，自上個世紀九十年 代W來，蠟毒作為研究離子通道的工具及制作抗毒血清的原料而成為國際上研究的重點。 從LQS蠟毒中分離出的氯毒素及charybdotoxin，對惡性神經膠質瘤細胞膜上的離子通道 有特異的親和作用，細胞的惡性度越高，氯毒素對它們的親和作用越強。氯毒素與同位素結 合后，其對膠質瘤的定向殺傷作用更為顯著。此外，蠟毒素能夠阻滯細胞膜的K+通道，同時 導致Ca"的內流減少，使腫瘤細胞的生長延緩。
[0004] 我國在蠟毒方面的研究雖然起步晚，但在中醫臨床驗證及理論體系（攻毒散結、 通經活絡、平肝焰風）的指導下，在抗腫瘤、抗痛、抗癒痛、抗凝、抗肝炎、抗風濕等領域均取 得了豐碩的成果。
[0005] 目前，國內外對蠟毒及其毒素（單一成分的純品）抑制細胞生長的細胞生物學效 應及作用機理有較多的研究，而對于其保護骨髓造血功能和防護細胞應激性損傷（福射 等）等方面尚無類似報道。
[0006] 在W往的研究中，我們利用凝膠過濾層析技術，從東亞錯蠟炬Uthusmartensii Karsch,BMK)蠟毒中分離得到了蠟毒多膚（Sco;rpionVenomPolyp巧tide,SVP)，并利用離 子交換層析技術從SVP中進一步分離得到了有效組分一一SVPIV和SVPV。實驗表明，SVPIV 和SVPV對福射后小鼠的骨髓有核細胞數、骨髓粒單系祖細胞集落形成單位（CFU-GM)數 量、骨髓基質細胞集落數、脾結節數、骨髓細胞的增殖指數等均有升高的促進作用。其中， SVPIV促進造血細胞增殖的作用明顯優于SVPV，而且前者應用30分鐘后，還可促進小鼠骨 髓細胞磯酸化STAT3蛋白表達水平明顯升高。經過改進分離方法，將蠟毒分成了S個組分 (SVPI、SVPII和SVPIII)。SVPII對福射后的骨髓造血細胞功能具有顯著的保護作用， 并能導致福射后造血細胞白細胞介素-3受體（比-化ec巧tor,IL-3R)的高表達（參考文獻 1-4)。上述的研究結果已被國外的研究者引用Salman(參考文獻4)。Salman發現，全身福 射后的雄性豚鼠注射了從蠟毒炬uthusoccitanus)中分離的緩激膚激活因子化radykinin potentiatingfactor,BP巧后，血清總蛋白和白蛋白的水平均提高，認為從蠟毒中分離的 BPF能夠促進生長因子和/或生長激素的分泌，進而增加肝臟蛋白質的合成，減輕福射損傷 作用。說明蠟毒多膚在促進細胞增殖和防護細胞應激性損傷（福射等）的藥物開發方面具 有重要的意義。
[0007] 在近期實驗中，申請者觀察到從SVPII中進一步純化出的單一天然蠟毒毒素多膚 純品--蠟毒增殖膚（ScorpionVenomproliferativePeptidefromButhusmartensii Karsch，BmKpp)對骨髓造血功能的保護作用顯著好于SVPII。
【發明內容】
[000引為解決上述技術問題，本發明人經過銳意研究，最終從東亞錯蠟炬uthus martensiiKarsch)蠟毒中分離一種新的蛋白質，并證實了其在骨髓造血功能保護方面的 藥用新用途。詳細言之，本發明提供了：
[0009] (1) 一種多膚，其特征在于：具有SEQNo. 1所示的氨基酸序列。
[0010] (2)如（1)所述的多膚，其中所述多膚是從東亞錯蠟的蠟毒中所分離得到的天然 多膚。
[0011] (3. -種保護骨髓造血功能的藥物組合物，其特征在于含有SEQNo. 1的多膚。 [001引 （4)上述（1)或似所述多膚在制備保護骨髓造血功能的藥物中的應用。
[0013] (5)上述（1)或（2)所述多膚的制備方法，其特征在于包括W下步驟：
[0014] S1通過電刺激法，從東亞錯蠟活體中提取并收集新鮮毒液；
[0015] S2采用分子篩層析凝膠對所述毒液進行分離，并收集分離得到的第II峰處溶液；
[0016] S3通過離子凝膠柱對所述第II峰處溶液進行純化，收集蠟毒組分II;
[0017] S4通過離子凝膠柱對所述蠟毒組分II進行二次純化，收集目標峰處溶液；
[001引 做如妨所述的制備方法，其中，所述S2和S3中所使用的層析柱規格為lOOcmX5. 5畑1，洗脫液為地=6. 4的磯酸鹽緩沖液進行梯度洗脫，A液為0. 05M磯酸鹽緩 沖液（化-2冊04/化畔04)，B液為含0. 3M氯化鋼的A。
【附圖說明】
[0019] 圖1.BmKpp的高效液相色譜圖
[0020] 圖2.質譜分析法（MALDI-T0巧測定BmKpp的分子量為7217. 4Da
[0021] 圖3.BmKpp對TBI后小鼠生存率的影響
[0022] 圖4.BmKpp促進TBI后小鼠骨髓及外周血細胞恢復
[0023] 圖5.BmKpp促進福射后小鼠骨髓細胞造血集落的形成
[0024] 圖6.BmKpp對福射后骨髓細胞CAFC形成的影響
【具體實施方式】
[0025] 本發明將結合附圖通過W下實施例作進一步說明。
[0026]W下的實施例均WBmKpp保護骨髓造血功能為例對本發明進行具體的闡述，但是 本發明的保護范圍并不局限于此，本技術領域的普通技術人員通過W上內容也能實現本發 明的目的。
[0027]本發明的目的在于提供一種天然蠟毒多膚，該天然蠟毒多膚是從東亞錯蠟 炬uthusmartensiiKarsch)蠟毒中分離的一種新的蛋白質。所述東亞錯蠟可W為野生或 是任何一種市售的人工養殖的東亞錯蠟，如烏魯木齊縣東亞錯蠟良種繁育場、徐州新巧市 浩大蠟子養殖場、金華市天道有毒生物科技開發有限公司等市售的東亞錯蠟。
[002引本發明的目的還在于提供一種天然蠟毒多膚的應用，其在骨髓造血功能保護方面 的藥用新用途。
[0029] 本發明的目的還在于提供一種天然蠟毒多膚的制備方法，包括W下步驟：
[0030] (1)東亞錯蠟蠟毒采集
[0031] 本實施方式中成年東亞錯蠟取自東競中科生物制藥有限公司下屬的有毒生物種 養殖基地，利用電刺激法提取新鮮毒液。采毒儀器；采用化-D藥理生理實驗多用儀（上海 益聯科教設備有限公司生產）；儀器參數：連續脈沖25-30HZ，波寬0. 5-0. 7ms，電壓6~8 伏；操作方法；用一電極夾