AnnexinA3與癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的相關性的制作方法

專利名稱：Annexin A3與癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的相關性的制作方法
技術領域：
本發明一般地涉及化療藥物耐藥性領域，更具體地本發明涉及annexin A3與癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的相關性，涉及通過改變細胞中的annexin A3表達而提高/降低癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的方法、以及可以用于該方法中改變細胞中的annexin A3表達的藥劑、包含該藥劑的藥物組合物和所述藥劑用于制備改變癌癥耐藥性的藥物的用途及所述藥劑的篩選方法。此外，本發明還涉及用于檢測和/或預后癌癥對鉑類化療藥物的耐藥性的檢測或診斷方法、藥劑、藥物組合物及試劑盒。本發明還涉及用于治療癌癥患者的方法。在本發明中，所述癌癥是能夠用鉑類化療藥物治療的癌癥，更優選所述癌癥是卵巢癌。
背景技術：
卵巢癌是婦科腫瘤首位致死性疾病，晚期患者的5年生存率始終徘徊在15％-20％，腫瘤細胞對于化療藥物產生耐藥性是造成這一狀況的主要原因之一。鉑類與DNA結合形成交叉鍵，從而破壞DNA的功能不能再復制，高濃度時也能抑制RNA及蛋白質的合成，是目前最常用的治療卵巢癌的一線化療藥物，也是治療其它實體腫瘤包括乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等的常用藥物。在鉑類治療這些實體腫瘤時，均出現了耐藥現象，即治療初期對于腫瘤控制良好而治療后期便出現復發或治療初期就無反應。臨床就卵巢癌對于鉑類藥物耐藥已有明確的認識和定義，然而，有關順鉑耐藥機制的闡明卻遠遠不足。雖然目前從基因水平對于腫瘤耐藥機制的認識已經相當深入，如MDR-1，LRP-1，MRP-1，GST-pi等已成為眾所周知的耐藥相關基因。但多數研究的結果表明，多種耐藥相關基因在卵巢癌中的表達并不能良好地預測腫瘤的耐藥和預后，mRNA的豐度與其相應的蛋白水平具有不一致性可能是主要原因之一。DNA是遺傳信息的承載者，蛋白質才是功能的執行者。因此，需要在蛋白質水平進行高通量的技術來進一步探討耐藥機制，蛋白質組學技術為耐藥基因的功能研究提供了可能性。
蛋白質組學技術是近年發展起來的一種新興技術，已經廣泛應用于基礎研究的各個領域，總體上看，蛋白質組學研究主要包含以下幾個方面1.表達蛋白質組學；2.功能蛋白質組學；3.結構蛋白質組學。目前蛋白質組學技術在卵巢腫瘤的應用主要集中于惡性腫瘤的早期診斷和篩選腫瘤標志物方面，而至今尚無關于卵巢癌耐藥標志物的研究。從臨床組織入手直接研究鉑類耐藥機制，存在異質性、影響因素復雜、實驗技術水平有限、陽性結果易丟失等諸多困難。因此，以細胞系為研究對象，逐步延伸到臨床，提供了一種科學的研究思路。
Annexin家族(I～XIII)是一群依賴Ca2+的磷脂結合蛋白，具有非EF手型Ca2+結合位點，在調節細胞生長和細胞信號轉導途徑中起到一定的作用。Annexin A3是annexin家族中唯一具有酶活性的成員，具有抑制磷脂酶A2和抗凝的功能，它還可以切斷inositol1，2-cyclic phosphate形成inositol 1-phosphate，在控制細胞增殖方面發揮作用[Ross TS，et al.J Biol Chem.1991，266(14)9086-9092.]。雖然它廣泛存在于動植物的各個組織器官，但在分化的最后階段annexin A3卻在中性粒細胞中優勢表達。在未受到刺激中性粒細胞中，它分布在胞漿，并且含量高達胞漿總蛋白的1％[Ernst JD，et al.J Clin Invest，1990，85(4)1065-1071.]。在一定Ca2+濃度下，annexin A3能夠結合到囊泡的磷脂酰絲氨酸上，介導吞噬體與溶酶體的融合和顆粒消失等膜與膜之間的作用。另外，它能夠促進從人中性粒細胞中分離的特異性顆粒的集聚[Le Cabec V，et al.Biochem J，1994，303(Pt 2)481-487.]。最近，有研究證明annexin A3是一種新的促血管生成因子，它可以通過激活HIF-1導致VEGF的增加，為抗腫瘤生長和血管生成提供了新的作用靶標[Park JE，et al.Biochem Biophys Res Commun.2005，337(4)1283-1287.]。至今，annexin A3與腫瘤化療耐藥的相關性尚無研究報道。
為了克服耐藥相關基因在癌癥中的表達并不能良好地預測腫瘤的耐藥和預后，基礎研究與臨床治療相分離的缺點，本申請的發明人在蛋白質水平首次鑒定了蛋白annexin A3與癌癥(尤其是卵巢癌)的鉑類化療藥物耐藥性相關，并在臨床進一步得到驗證，由此使得可以通過檢測annexin A3的表達量預測臨床癌癥患者的化療耐藥，及早發現耐藥，改變治療方案，提高5年生存率，并使得可以通過改變耐藥的臨床癌癥患者腫瘤的annexin A3的表達量來改變鉑類藥物對此類患者的治療效果。此外，本發明中提出的正、反義annexin A3的真核表達質粒和表達annexin A3融合蛋白的真核表達質粒構建，為研究annexin A3的功能提供了有利的工具。再者，本發明還提供了卵巢癌耐順鉑細胞系SKOV3/CDDP-P的誘導方法，模擬臨床治療卵巢癌的劑量和方式，為進一步研究臨床耐藥提供了良好的細胞模型。

發明內容
因此，本發明一方面涉及，調節癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的方法，包括改變癌癥細胞中annexin A3的表達，其中優選地，所述癌癥是卵巢癌，所述鉑類化療藥物是順鉑或卡鉑。本發明的此方法可以用于體外調節癌細胞的耐藥性或者可以用于體內調節癌癥患者的耐藥性。
在本發明此方法的一個實施方案中，通過提高癌細胞中的annexin A3表達而提高癌細胞對鉑類化療藥物的耐受性，優選地，通過在癌細胞中表達annexin A3基因而提高細胞中的annexin A3表達，再優選地其中通過使用表達正義annexin A3基因的質粒來提高所述細胞中的annexin A3的含量。
因此，本發明也涉及編碼annexin A3蛋白的多核苷酸，包含該多核苷酸的DNA構建體及表達載體，并涉及它們在制備提高癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的藥物中的用途。在本發明中，annexin A3蛋白不僅包括天然的annexin A3蛋白也包括人工合成(例如通過遺傳工程的方法)的annexin A3蛋白，例如含有annexin A3的融合蛋白。
在本發明此方法的另一實施方案中，通過減少和/或抑制癌細胞中的annexin A3表達而降低癌癥對鉑類化療藥物的耐受性，優選地，通過在癌細胞中表達annexin A3的反義核酸和/或特異于annexin A3的核酶而減少和/或抑制細胞中的annexin A3表達，再優選地其中通過使用表達反義annexin A3的DNA構建體或表達載體來降低細胞中的annexin A3的含量。
因此，本發明也涉及減少和/或抑制癌細胞中的annexin A3表達的藥劑，例如抑制annexin A3表達的反義核苷酸和特異切割annexinA3 mRNA的核酶；本發明還涉及這些藥劑在制備降低癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的藥物中的用途。一個實施方案中，根據本發明的反義核苷酸，其包含能夠特異結合annexin A3多核苷酸序列或其互補序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，優選地所述反義核苷酸含有與annexin A3多核苷酸的一或多個部分互補、更優選地基本上互補、甚至更優選地完全互補的序列區域，更優選地，所述反義核苷酸包含與全長annexin A3多核苷酸完全互補的DNA序列，優選地，所述反義核苷酸是DNA或者RNA或者其衍生物，最優選地，所述反義核苷酸包含在能夠表達其的表達質粒，優選真核表達質粒中。一個實施方案中，根據本發明的能夠特異切割annexin A3 mRNA的核酶具有與一或多個annexin A3 RNA區域互補的特異底物結合位點，并且它在該底物結合位點中或周圍具有賦予該分子RNA切割活性的核苷酸序列，優選地所述核酶選自錘頭型核酶、發夾型核酶、丁型肝炎病毒型核酶、I型內含子型核酶或RNaseP RNA型核酶或鏈孢霉屬VS RNA型核酶。
本發明另一方面涉及，通過前述的本發明改變癌癥耐藥性的方法改變了對鉑類化療藥物的耐受性的癌癥細胞，優選地，所述細胞包含表達正義annexin A3或反義annexin A3的表達載體，優選地，所述載體是質粒。
本發明再一方面涉及，一種篩選能夠改變癌癥對鉑類化療藥物的耐藥性的藥劑的方法，其中所述癌癥優選是卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑，所述方法包括步驟提供候選藥劑；使所述候選藥劑與癌細胞接觸；檢測所述癌細胞中的annexin A3的表達；將所檢測到的表達量與預定閾值比較。相應地，本發明也涉及也通過本發明的篩選方法獲得的藥劑。
本發明的一個方面涉及，一種檢測癌細胞對鉑類化療藥物的耐藥性的方法，其中所述癌癥優選是卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑，所述方法包括檢測癌細胞中的annexin A3的表達量，和將所得表達量與預定閾值進行比較，由此指示卵巢癌細胞對鉑類化療藥物的耐藥性。
本發明的又一方面涉及，一種預測或預后鉑類化療藥物在癌癥患者中的治療效果，即，診斷癌癥患者的鉑類化療藥物耐藥性的方法，其中所述癌癥優選是卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑、卡鉑，所述方法包括檢測癌癥患者的腫瘤組織中的annexin A3的表達量，和將所得的量與預定閾值進行比較，由此預測或預后向所述患者施用鉑類化療藥物的治療效果，即，預測患者的鉑類化療藥物耐藥性。
在本發明的上述方法中，用于檢測annexin A3表達量的步驟通過檢測annexin A3的mRNA水平或蛋白質水平；其中，優選地，在蛋白質水平上的檢測，通過抗體或寡核苷酸適配體來實現，優選利用抗體；而在mRNA水平上的檢測，優選通過Northern印跡或PCR方法來實現。
相應地，本發明也涉及能夠檢測annexin A3表達的藥劑。在一個實施方案中，所述檢測藥劑是annexin A3的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，優選其是中和抗體。在另一實施方案中，所述檢測藥劑是特異結合annexin A3蛋白質的寡核苷酸適配體，優選地所述寡核苷酸適配體是DNA，優選地，所述寡核苷酸適配體連接或標記了其它功能基團或分子，例如巰基、氨基、放射性同位素、熒光素、生物素、或酶等。在再一實施方案中，所述檢測藥劑是特異于annexin A3基因的核酸探針或引物或其組合。
本發明還涉及前述能夠檢測annexin A3表達的藥劑在制備用于檢測癌細胞的鉑類化療藥物耐藥性或診斷癌癥患者的鉑類化療藥物耐藥性的檢測或診斷試劑盒中的用途。就本發明的此用途，所述藥劑優選為annexin A3蛋白質的抗體，優選單克隆抗體；或者所述藥劑檢測細胞中annexin A3基因的mRNA水平表達量，優選是特異于annexin A3基因的雜交探針或引物。
本發明再一方面涉及治療癌癥患者的方法，包括步驟a)通過本發明改變癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的方法，降低患者對鉑類化療藥物的耐受性；和b)向所述患者施用鉑類化療藥物，任選地，在步驟(a)之前檢測癌癥患者的鉑類化療藥物耐受性以確定耐藥性患者。
本發明又一方面涉及治療癌癥患者的方法，所述方法包括根據本發明確定患者的鉑類化療藥物耐藥性，和調整患者的鉑類化療藥物給藥方案。在本發明此方面，所述調整包括替換紫杉醇類化療藥物、加大或減少紫杉醇類化療藥物的給藥頻率和/或給藥量，等。
本發明的其它方面還涉及藥物組合物，其包含前述能夠改變本發明的癌癥耐藥性的藥劑或前述能夠檢測annexin A3表達的藥劑。在本發明的一些實施方案中，所述藥物組合物包含表達annexin A3的DNA、annexin A3的反義核苷酸、核酶、抗體和寡核苷酸適配體中的一個或任何組合。在一些實施方案中，本發明藥物組合物用于診斷和/或改變癌癥的鉑類化療藥物耐藥性，其中所述癌癥是卵巢癌。
本發明最后一方面涉及一種建立鉑類化療藥物耐藥性癌癥細胞株的方法，包括以大劑量鉑類化療藥物沖擊來誘導癌癥細胞。
在本發明的所有方面，如果適用的話，優選的是，所述癌癥是能夠用鉑類化療藥物治療的癌癥，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等，優選卵巢癌，在一個實施方案中，優選卵巢上皮癌，包括內膜樣癌、漿乳癌、腺癌、移行細胞癌、子宮內膜癌、透明細胞癌，在另一實施方案中，優選人漿液性卵巢癌。
在本發明的所有方面，如果適用的話，優選的是，所述鉑類化療藥物是順鉑、卡鉑、草酸鉑、奈達鉑、樂鉑等，更優選是順鉑和卡鉑。
附圖簡述

圖1.CDDP大劑量沖擊誘導法示意2.CDDP小劑量間歇誘導法示意3.CDDP對SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的劑量反應曲線圖4.細胞形態學光鏡觀察(×200)a.SKOV3；b.SKOV3/CDDP-P；c.SKOV3/CDDP-80；d，e，f為a，b，c生長至對數生長期的細胞形態圖5.a.從左至右依次為掃描電鏡下SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的細胞形態(×1600)SKOV3細胞成梭形，細胞表面微絨毛豐富，長而纖細，分布均勻，CDDP-P和CDDP-80均可見細胞表面微絨毛較稀疏，分布欠均勻。CDDP-80形態變化顯著，細胞自胞核向兩側延伸，面積較大。b，c.從左至右依次為透射電鏡下SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的細胞形態(b，×8000；c，×22000)可見SKOV3胞漿內含有大量線粒體，CDDP-P和CDDP-80細胞核大形態不規則，畸形核可見，核膜凹陷明顯，有核袋和核突。染色質分布不均，有的凝結成塊，胞漿內線粒體減少，具有大量囊泡樣結構。這些囊泡樣結構部分是空泡，部分可見顆粒樣物。
圖6.SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的生長曲線圖7.RT-PCR測定MDR1、MRP1、LRP1、GST-pi mRNA的表達*P＜0.01與SKOV3相比較**P＜0.01與SKOV3和SKOV3/CDDP-80相比較圖8.不同細胞系中MDR1、MRP1、LRP1、GST-pi mRNA的表達統計圖*P＜0.01與SKOV3相比較**P＜0.01與SKOV3和SKOV3/CDDP-80相比較圖9 Western blot法測定MDR1、MRP1、LRP1、GST-pi蛋白的表達圖10.四種耐藥細胞系的所有差異表達蛋白質點圖11.六種細胞系2-DE圖譜中蛋白質點25(箭頭處)的表達，經MALDI-TOF-MS鑒定為annexin A3圖12.MALDI-TOF-MS鑒定蛋白質點25(annexin A3)的肽質指紋圖譜圖13.六種細胞系2-DE圖譜中蛋白質點67(箭頭處)的表達，經MALDI-TOF-MS鑒定為destrin圖14.六種細胞系2-DE圖譜中蛋白質點7(箭頭處)的表達，經MALDI-TOF-MS鑒定為IDHc圖15.六種細胞系2-DE圖譜中蛋白質點54(箭頭處)的表達，經MALDI-TOF-MS鑒定為GSTO1-1圖16.六種細胞系2-DE圖譜中蛋白質點34(箭頭處)的表達，經MALDI-TOF-MS鑒定為cofilin 1圖17.定量PCR法檢測五種差異表達蛋白在六種細胞系中mRNA的表達圖18.Western blot法檢測四種差異表達蛋白在六種細胞系中的表達圖19.pcDNA3.1/myc-His(-)B質粒圖譜圖20.pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3質粒構建流程示意21.pcDNA3.1(+)質粒圖譜圖22.pcDNA3.1-anx3質粒構建流程示意23.pEGFP-N1質粒圖譜圖24.pEGFP-N1-anx3質粒構建流程示意25.細胞總RNA電泳圖，可見28、16S、5S條帶圖26.RT-PCR法擴增annexin A3(anx 3)lane 1以SKOV3細胞cDNA為模板可見在1000bp處可見一亮條帶圖27.PCR法和酶切法鑒定T重組質粒lane 1以pcDB-sense anx3質粒為模板，1000bp處可見擴增出預期條帶lane 2EcoR I單酶切可切出目的條帶
lane 3未行酶切的T重組質粒圖28.重組T質粒(pGEM-T-anx3)經測序后在Genebank中的比對結果圖29.PCR法和酶切法鑒定pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3質粒lane 1未加上游引物的陰性對照lane 2以pcDB-sense anx3質粒為模板，1000bp處可見擴增出預期條帶lane 3以pcDB-antisense anx3質粒為模板，1000bp處可見擴增出預期條帶lane 4未行酶切的pcDB-antisense anx3質粒lane 5EcoR I單酶切的pcDB-sense anx3質粒，可切出目的條帶lane 6EcoR I單酶切的pcDB-antisense anx3質粒，可切出目的條帶圖30.pcDB-antisense anx3質粒經測序后在Genebank中的比對結果圖31.a.PCR法鑒定pcDNA3.1-anx3質粒lane 1以pcDNA3.1-anx3質粒為模板，1300bp處可見擴增出預期條帶b.酶切法鑒定pcDNA3.1-anx3質粒lane1EcoR I單酶切可切出目的條帶圖32.pcDNA3.1-anx3質粒經測序后在Genebank中的比對結果圖33.PCR法鑒定pEGFP-N1-anx3質粒lane 1pEGFP-N1-anx3質粒為模板，1000bp處可見擴增出預期條帶圖34.酶切法鑒定pEGFP-N1-anx3質粒lane 1BamH I單酶切未見目的條帶lane 2Xho I、BamH I雙酶切可見目的條帶圖35.pEGFP-N1-anx3質粒經測序后在Genebank中的比對結果圖36.pEGFP-N1-anx3質粒分別轉染A2780，SKOV3細胞，熒光顯微鏡下觀察的轉染效率(轉染后24h)a，cpEGFP-N1-anx3質粒對于SKOV3細胞的轉染情況。載體pEGFP-N1-anx3質粒轉染SKOV3細胞的轉染效率約為20-25％(×200)；b，dpEGFP-N1-anx3質粒對于A2780細胞的轉染情況。載體pEGFP-N1-anx3轉染A2780細胞24后的轉染效率約為45-55％(×200)圖37.SKOV3、A2780細胞在篩選穩定轉染過程中的集落形態圖38.穩定轉染細胞克隆的western blot鑒定結果正義annexin A3質粒轉染敏感細胞系SKOV3、A2780，反義annexin A3質粒轉染耐藥細胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBPa.annexin A3；b.beta-actin；C.未經轉染的細胞對照；M.轉染相應空質粒的細胞對照；1-7為轉染相應annexin A3正義或反義質粒的細胞克隆圖39.Annexin A3免疫組化染色結果(×200)a.annexin A3染色陰性b.annexin A3染色陽性，陽性部分為細胞核c，d.annexin A3染色陽性，陽性部分為細胞漿具體實施方式
本說明書就以下幾個方面對本發明作進一步詳細闡述。
Annexin A3蛋白及其編碼核苷酸本發明所指的annexin A3或annexin A3蛋白質包括annexin A3的同源物、等位變體、功能等同物，特別是保守變體，優選指人annexinA3蛋白質。annexin A3蛋白質保守變體包括與本文公開的annexin A3蛋白質相比具有一個或者多個(例如1-20個，1-10個，1-5個)氨基酸的插入、缺失、和/或添加的蛋白質。在本發明中，“多肽”和“蛋白質”可以互換使用，可以表示任何長度的多肽。
本領域技術人員將明了，多核苷酸可以是單鏈的(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈的，而且可以是DNA(基因組DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有內含子并以一對一形式與DNA分子對應的HnRNA分子，和不含內含子的mRNA分子。
多核苷酸可以含有天然序列(即編碼annexin A3蛋白質或其部分的內源性序列)或可以含有該序列的變體、或生物學或功能等同物。多核苷酸變體可以含有一或多個替代、添加、缺失和/或插入，優選地，這些改變是保守性的或者這些改變產生的多核苷酸變體保持編碼本發明蛋白質的能力。
當進行多核苷酸或多肽序列比較時，如果在按下述方法進行最大匹配比對后，兩個序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，則認為這兩個序列是“一致的”。
適合于確定序列一致性和序列相似性百分數的算法的一個優選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如本文所述參數，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分數。執行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術信息中心為公眾所獲得。
因此，本發明包括與本文所公開序列基本一致的多核苷酸和多肽序列，例如當采用本文所述方法(例如采用標準參數的BLAST分析，描述如下)時，與本發明多核苷酸或多肽序列相比含有至少50％序列一致性、優選至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些序列。本領域技術人員將明了，考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀框的定位等，可以對這些值進行適當調整以確定兩個核苷酸序列編碼的蛋白質的相應一致性。
在其它實施方案中，本發明提供含有與本文所公開的一或多個序列一致或互補的各種長度連續序列段的分離多核苷酸和多肽。例如，本發明提供含有本文所公開的一或多個序列的至少約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多個連續核苷酸、以及含有之間的所有居中長度的連續核苷酸的多核苷酸。易于明了的是，“居中長度”在本文中是指這些引用值之間的任何長度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之間的所有整數。
本發明的多核苷酸、或其片段，無論其本身的編碼序列有多長，均可以和其它DNA序列，如啟動子、多腺苷酸化信號、額外的限制性酶位點、多克隆位點、其它的編碼區段等組合，以致它們的整個長度可能出現相當大的變化。因此，預期可以采用幾乎任何長度的核苷酸片段，其總長度優選被限制在易于在期望的重組DNA程序中進行操作和應用的范圍內。例如，預期總長度約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50個堿基對等(包括所有的居中長度)的示例性DNA區段在本發明的許多實施方案中是有用的。
在其它實施方案中，本發明涉及在中等嚴緊條件(優選高嚴緊條件)下與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補序列能夠雜交的多核苷酸。在分子生物學領域中雜交技術是熟知的。
典型地，“雜交條件”根據測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據。例如，“最大嚴緊性”典型地發生在約Tm-5℃(低于探針Tm 5℃)；“高等嚴緊性”發生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴緊性”發生在探針Tm以下約10-20℃；“低嚴緊性”發生在Tm以下約20-25℃。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗滌為依據。例如，6×SSC＝極低嚴緊性；3×SSC＝低至中等嚴緊性；1×SSC＝中等嚴緊性；0.5×SSC＝高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。
對于要求高選擇性的應用，典型地期望采用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，實驗室手冊，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊性在內的雜交條件。
為便于說明，用于檢測本發明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊條件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領域技術人員應當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。
本發明的多核苷酸和多肽可以按照本領域已知的方法制備。參見例如常見實驗室手冊。
表達的改變本發明一方面涉及通過改變癌細胞中的annexin A3表達，來調節癌癥的鉑類化療藥物耐藥性。
在此方面，所述表達的改變包括上調和/或激活表達并由此增加癌癥的鉑類化療藥物耐藥性，也包括下調和/或抑制表達，由此降低癌癥的鉑類化療藥物的耐藥性。本發明對癌癥的耐藥性的調節可以發生在體外施用于癌細胞上以例如獲得耐藥性細胞株或降低原耐藥性細胞的耐藥性。本發明對癌癥的耐藥性的調節也可以發生在體內以患有所述癌癥的患者為施用對象，以改變優選降低患者的鉑類化療藥物耐藥性。
這里所用的“表達的上調”或者“表達的激活”是指增加基因表達的水平和/或活性基因產物的水平和/或基因產物活性的水平。例如，可以通過在癌細胞中表達外源annexin A3、增強癌細胞的內源annexinA3表達等方式實現。在本發明中，外源annexin A3指通過遺傳工程技術引入的annexin A3；而內源annexin A3指細胞中原有的annexinA3。本領域技術人員已知的任何能夠增加目的基因表達的水平和/或活性基因產物的水平和/或基因產物活性的水平的方法均適用于本發明此方面，由此也包括在本發明范圍內。
這里所用的“表達的下調”或者“表達的抑制”是指降低基因表達的水平和/或活性基因產物的水平和/或基因產物活性的水平。如Angell和Baulcombe(1998-WO9836083)，Lowe等，(1989-WO9853083)，Lederer等，(1999-WO9915682)或者Wang等(1999-WO9953050)所述，通過，例如以相對于啟動子序列的有義方向(如果引起共抑制)或者反義方向添加編碼序列或其部分，和通過，例如插入誘變(例如T-DNA插入或轉座子插入)或通過基因沉默策略可以完成表達的降低。目的在于沉默基因表達的基因構建體可以有以相對于啟動子序列有義和/或反義方向包含的所述基因的核苷酸序列(或其一個或多個部分)。另一個下調基因表達的方法包括核酶的應用。
可以通過向細胞、組織、器官或生物體施用或使之暴露于所述本發明化合物或藥劑由此實現調節，包括降低活性基因產物或基因產物活性的水平。
免疫調節是具有下調活性基因產物和/或基因產物活性水平能力的另一種技術的例子，包括施用或暴露所述基因產物的抗體于其中要調節所述基因產物的水平和/或基因產物活性的細胞、組織、器官或生物體，或在這種細胞、組織、器官或生物體中表達所述基因產物的抗體。這種抗體包括單鏈抗體、IgG抗體及其片段。
還可以通過向細胞、組織、器官或生物體施用或使之暴露于所述基因產物或其活性的激動劑/拮抗劑實現調節，包括增強/降低活性基因產物或基因產物活性的水平。這種激動劑/拮抗劑包括按照所述本發明鑒定的蛋白質和化學化合物。
在本發明上下文中設想了annexin A3基因表達的上調/下調。本發明還包括annexin A3活性水平的上調/下調。
此外，可以考慮通過重組來使基因沉默。
“重組酶”意指位點特異性重組酶或轉座酶。“重組位點”意指位點特異性重組位點或轉座子邊界序列。“位點特異性重組事件”意指由一般由3個元件一對DNA序列(位點特異性重組序列或位點)和特異性酶(位點特異性重組酶)組成的系統催化的事件。位點特異性重組酶根據位點特異性重組序列的方向，僅催化兩個位點特異性重組序列間的重組反應。在位點特異性重組酶存在的情況下，當位點特異性重組序列以相互相反方向定向(即，反向重復)時，間插在兩個位點特異性重組位點之間的序列將倒置。如果位點特異性序列以相互相同的方向定向(即，同向重復)，那么一旦與位點特異性重組酶相互作用，任何間插序列將缺失。因此，如果位點特異性重組序列做為同向重復在整合進入真核生物基因組中的外源DNA兩個末端存在，那么所述序列的這種整合隨后可以被位點特異性重組序列與相應的位點特異性重組酶的相互作用所逆轉。
可以利用大量不同的位點特異性重組酶系統，包括但不限于噬菌體P1的Cre/lox系統，酵母的FLP/FRT系統，噬菌體Mu的Gin重組酶，大腸桿菌(E.coli)的Pin重組酶，志賀氏菌屬(Shigella)的PinB，PinD和PinF，和pSR1質粒的R/RS系統。重組酶通常都是整合酶、解離酶或翻轉酶(flippases)。而且，雙特異性重組酶可以與對應雙特異性重組酶的兩個不同位點特異性重組位點的同向重復或不同向重復(indirect repeats)聯合使用(WO99/25840)。兩個優選的位點特異性重組酶系統是噬菌體P1 Cre/lox和酵母FLP/FRT系統。在這些系統中，重組酶(Cre或FLP)與其各自位點特異性重組序列(分別是lox或FRT)相互作用以倒置或切除間插序列。
盡管位點特異性重組序列必須與待切除或待倒置的DNA的末端連接，但是編碼位點特異性重組酶的基因可以定位在其它地方。例如，重組酶基因可以已經存在真核生物DNA中或者可以由后來引入的DNA片段提供，該DNA片段可以通過交換或通過異體授粉或直接引入細胞中。做為可替代方案，例如，可以通過顯微注射或粒子轟擊將基本純化的重組酶蛋白質直接引入真核細胞。典型地，位點特異性重組酶編碼區將可操作地連接調節序列，該調節序列能夠使位點特異性重組酶在真核生物細胞中表達。
在實施本發明時，優選地，例如通過細胞中重組酶蛋白質的表達，該蛋白質接觸遺傳因子的整合位點，并促進其中重組事件，在原始整合位點完整地切除遺傳因子或者可替代地留下“足跡”，通常約20個核苷酸長或更長，來誘導遺傳因子運動。可以通過標準核酸雜交和/或擴增技術以檢測可動遺傳因子或包含其的基因構建體的存在鑒定根據本發明方法產生的這些宿主和宿主部分。做為可替代方案，在可動遺傳因子已經切除的轉化的宿主細胞、組織和宿主的情況下，可以用這種技術檢測切除事件后留下的宿主基因組中足跡。如這里所用術語“足跡”應該理解為指這里所述可動遺傳因子或含該因子的基因構建體的任何衍生物，通過先前所述基因構建體轉化的細胞基因組中可動遺傳因子的切除、缺失或其它去除可以產生它。通常地，足跡包含至少用于促進切除的轉座子或重組位點的單拷貝。然而，足跡可以包含來源于基因構建體的其它序列，例如，如果使用，來源于左邊界序列、右邊界序列、復制起點、重組酶編碼序列或轉座酶編碼序列的核苷酸序列，或其它載體來源的核苷酸序列。因此，根據所用基因構建體重組基因座或轉座子的核苷酸序列，如，例如與lox位點或frt位點對應或互補的核苷酸序列，可鑒定足跡。
本發明還涉及通過使用反義技術在體外和體內抑制annexin A3。可利用反義技術通過三鏈螺旋形成或者通過反義DNA或RNA來控制基因表達，這兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結合。例如，將編碼本發明多肽的多核苷酸的5’編碼部分用于設計長度為大約10-40堿基對的反義RNA核苷酸。設計與基因中參與轉錄的區域互補的DNA核苷酸(三鏈螺旋參閱Lee等人，Nucl.Acids Res.，63073，1979；Cooney等人，Science，241456，1988；和Dervan等人，Science，2511360，1991)，由此防止annexin A3的轉錄和生成。反義RNA核苷酸與mRNA在體內發生雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成annexin A3蛋白(反義參與Okano，J.Neurochem.，56560，1991；《Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors of Gene Expression》(寡核苷酸作為基因表達的反義抑制劑)，CRC出版社，Boca Raton，FL，1988)。
或者，可以通過本領域的流程將上文所述核苷酸投遞至細胞，使得反義RNA或DNA能夠在體內表達，從而以上文所述方式抑制annexinA3的生成。
反義核苷酸遺傳信息流的最終結果是蛋白質的合成。DNA通過聚合酶轉錄為信使RNA，然后在核糖體上經翻譯產生折疊的功能性蛋白質。因此，沿該路徑有幾個在其上可以實現蛋白質合成抑制的步驟。編碼本文所述多肽的天然DNA區段，和所有這樣的哺乳動物DNA鏈一樣，具有通過氫鍵結合在一起的兩條鏈有義鏈和反義鏈。除了DNA中的胸苷被尿苷所替代外，編碼多肽的信使RNA具有與有義DNA鏈相同的核苷酸序列。因此，合成的反義核苷酸序列將與mRNA結合，并抑制由該mRNA編碼的蛋白質的表達。
因此，使反義核苷酸靶向mRNA是關閉蛋白質合成的一個機制，并由此成為一種有力的定向治療方法。例如，多聚半乳糖醛酸酶和2型毒蠅堿性乙酰膽堿受體的合成受到指向它們各自mRNA序列的反義核苷酸的抑制(美國專利5,739,119和美國專利5,759,829，兩份文獻特此完整地并入本文作為參考)。而且，采用細胞周期核蛋白、廣譜抗藥基因(MDG1)、ICAM-1、E-選擇蛋白、STK-1、紋狀體GABAA受體和人EGF(Jaskulski等，1988；Vasanthakumar和Ahmed，1989；Peris等，1998；美國專利5,801,154；美國專利5,789,573；美國專利5,718,709和美國專利5,610,288，所有文獻特此完整地并入本文作為參考)也顯示了反義抑制的例子。
因此，在示例性實施方案中，本發明提供含有能夠特異結合本文所述多核苷酸序列或其互補序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列。在一個實施方案中，該反義核苷酸含有DNA或其衍生物。在另一實施方案中，該核苷酸含有RNA或其衍生物。在第三個實施方案中，該核苷酸是含有硫代磷酸酯修飾的主鏈的修飾DNA。在第四種實施方案中，該核苷酸序列含有肽核酸或其衍生物。在所有的情況下，優選的組合物含有與本文所公開多核苷酸的一個或多個部分互補、更優選地基本上互補、甚至更優選地完全互補的序列區域。所述一個或多個部分可以是約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多個連續核苷酸、以及具有它們之間的所有居中長度的連續核苷酸。易于明了的是，“居中長度”在本文中是指這些引用值之間的任何長度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之間的所有整數。因此，本領域技術人員將理解，本發明的核苷酸可以具有少至約10個、多至約1000個或者更多個核苷酸。
特異于指定基因序列的反義組合物的選擇是基于對所選靶序列(例如，示例性實例中的人序列)的分析、和對二級結構、Tm、結合能、相對穩定性的測定來進行的，并且反義組合物還基于它們相對缺乏形成二聚體、發夾、或其它將降低或妨礙與宿主細胞中靶mRNA特異結合的二級結構的能力來選擇。
mRNA中高度優選的靶區域是那些位于或靠近AUG翻譯起始密碼子的區域，和那些基本上與該mRNA的5’區域互補的序列。對這些二級結構的分析和對靶位點選擇的考慮是采用第4版OLIGO引物分析軟件(Rychlik，1997)和BLASTN 2.0.5算法軟件(Altschul等，1997)來實現的。
本發明人還考慮采用通過稱作MPG(27個殘基)的短肽載體進行的反義遞送方法。MPG肽含有一個來源于HIV gp41融合序列的疏水域和一個來源于SV40 T抗原細胞核定位序列的親水域(Morris等，1997)。已經闡明，幾個MPG肽分子即可包被反義核苷酸，而且它們能夠在不足1小時內以相對高的效率(90％)被遞送至培養的哺乳動物細胞中。而且，與MPG的相互作用極大地增加了該核苷酸對抗核酸酶的穩定性和跨越質膜的能力(Morris等，1997)。
核酶盡管蛋白質傳統上一直被用于核酸的催化反應，但另一類大分子已表現出在此方面是有用的。核酶是以位點特異性方式切割核酸的RNA-蛋白質復合物。核酶具有特異的催化域，該催化域具有內切核酸酶活性(Kim和Cech，1987；Gerlach等，1987；Forster和Symons，1987)。例如，很多核酶以高度的特異性加速磷酸酯轉移反應，常常僅切割寡核苷酸底物的幾個磷酸酯中的一個(Cech等，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。該特異性被歸因于如下必要條件，即該底物在化學反應前通過特異堿基配對相互作用與核酶的內部引導序列(“IGS”)結合。
起初，核酶的催化反應是作為涉及核酸的序列特異性切割/連接反應的部分被觀察到的(Joyce，1989；Cech等1981)。例如，美國專利5,354,855(特此并入本文作為參考)報道，某些核酶能夠起到內切核酸酶的作用，而且其序列特異性高于已知的核糖核酸酶的序列特異性，并接近于DNA限制性酶的序列特異性。因此，序列特異性核酶介導的基因表達抑制可能尤其適于治療應用(Scanlon等，1991；Sarver等，1990)。近來，有報道稱，核酶在其所應用的某些細胞系中引發遺傳改變；這些改變的基因包括癌基因H-ras、c-fos和HIV的基因。該工作的大部分涉及到基于特異核酶切割特異突變密碼子進行的靶mRNA修飾。
目前已知天然存在的酶性RNA的6種基本變體。每一種均能在生理條件下反式催化RNA磷酸二酯鍵的水解(因此能夠切割其它RNA分子)。一般，酶性核酸通過首先與靶RNA的結合來作用。該結合通過酶性核酸的靶結合部分來進行，該部分與該分子中進行靶RNA切割的酶性部分緊靠在一起。因此，該酶性核酸通過互補堿基配對首先識別，然后結合靶RNA，一旦與正確位點結合后，通過酶學作用切開該靶RNA。對該靶RNA的策略性切割將破壞其指導所編碼蛋白合成的能力。在酶性核酸對其RNA靶標實現結合和切割后，它將從該RNA上被釋放出來以尋找另一靶標，并能重復結合和切割新的靶標。
核酶的酶學性質優于許多技術，例如反義技術(在該技術中核酸分子簡單地與核酸靶標結合以阻斷其翻譯)，因為實現治療性處理所必需的核酶濃度比所需的反義寡核苷酸濃度低。此優點反映了核酶通過酶學方式起作用的能力。因此，單一一個核酶分子能夠切割許多靶RNA分子。此外，核酶還是一種高度特異的抑制劑，其抑制特異性不僅依賴于與靶RNA結合的堿基配對機制，還依賴于對靶RNA實行切割的機制。靠近切割位點的單個堿基錯配、或堿基替代可以完全地消除核酶的催化活性。在反義分子中的相似錯配并不妨礙其作用(Woolf等，1992)。因此，核酶作用的特異性比與相同RNA位點結合的反義寡核苷酸的作用特異性高。
在錘頭、發夾、丁型肝炎病毒、I型內含子或RNaseP RNA(與RNA引導序列相關)或鏈孢霉屬(Neurospora)VS RNA的基序中可以形成酶性核酸分子。錘頭基序的例子描述于Rossi等(1992)。發夾基序的例子描述于Hampel等(歐洲專利申請公開文本EP 0360257)、Hampel和Tritz(1989)、Hampel等(1990)和美國專利5,631,359(特此并入本文作為參考)。丁型肝炎病毒基序的例子描述于Perrotta和Been(1992)；RNaseP基序的例子描述于Guerrier-Takada等(1983)；鏈孢霉屬VS RNA的核酶基序描述于Collins(Saville和Collins，1990；Saville和Collins，1991；Collins和Olive，1993)；I型內含子的例子描述于美國專利4,987,071(特此并入本文作為參考)。對于本發明的酶性核酸分子重要的僅是，該分子具有與一或多個靶基因RNA區域互補的特異底物結合位點，并且它在該底物結合位點中或周圍具有賦予該分子RNA切割活性的核苷酸序列。因此，無需將該核酶的結構限定于本文所提及的具體基序。
在某些實施方案中，制備對目的靶標(例如本文所公開的其中一個序列)的RNA表現出高度特異性的酶性切割劑可能是重要的。該酶性核酸分子優選定向于靶mRNA的高度保守序列區。根據需要可以向特定細胞遞送外來的這些酶性核酸分子。或者，可以從遞送至特定細胞的DNA或RNA載體表達核酶。
小的酶性核酸基序(例如錘頭或發夾結構的基序)也可以用于外來遞送。這些分子的簡單結構增加了該酶性核酸侵入mRNA結構的靶區的能力。或者，可以在細胞中從真核啟動子表達催化性RNA分子(例如Scanlon等，1991；Kashani-Sabet等，1992；Dropulic等，1992；Weerasinghe等，1991；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Sarver等，1990)。本領域技術人員明了，任何核酶都可以在真核細胞中從適合的DNA載體上表達。這些核酶的活性可以通過它們借助于第二種核酶自初級轉錄本中釋放而得以提高(國際專利申請公開文本WO93/23569，和國際專利申請公開文本WO 94/02595，兩者均籍此并入本文作為參考；Ohkawa等，1992；Taira等，1991；和Ventura等，1993)。
可以將核酶直接加入靶細胞中，或可以使其與陽離子脂質、脂類復合物混合、或包裝在脂質體中、或以其它方式遞送至靶細胞中。該RNA或RNA復合物可以通過注射、氣霧劑吸入、輸注泵或支架，以摻入或不摻入生物聚合物中的形式，離體或體內局部施用給相關組織。
核酶可按國際專利申請公開文本WO 93/23569和WO 94/02595(均引入本文作為參考)所述設計，并按所述合成用于體外和體內實驗。也可優化這些核酶便于遞送。盡管提供了具體實例，但本領域技術人員將知曉，必要時可采用其它物種的等同RNA靶標。
可以通過計算機折疊(Jaeger等，1989)單獨地對錘頭或發夾核酶進行分析，以評價該核酶序列是否折疊成適當的二級結構。將在結合臂和催化核心之間具有不利分子間相互作用的那些核酶排除在考慮之外。可以選擇不同的結合臂長度以優化活性。一般，每條臂上至少5個左右的堿基能夠結合靶RNA，或以其它方式與靶RNA相互作用。
可以將具有錘頭或發夾基序的核酶設計成與mRNA信息中的各位點退火，并且可以對其進行化學合成。所用的合成方法同Usman等(1987)和Scaringe等(1990)所述的用于正常RNA合成的程序，并且采用通常的核酸保護和偶聯基團，例如5’末端采用二甲氧基三苯甲基，而3’末端采用亞磷酰胺。典型地，平均的逐步偶聯產量大于98％。發夾核酶可以分兩部分合成，然后退火以重新構建活性核酶(Chowrira和Burke，1992)。可以對核酶進行廣泛的修飾，以便通過采用核酸酶抗性基團如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-o-甲基、2’-H增加穩定性(綜述參見例如Usman和Cedergren，1992)。核酶可以采用一般方法通過凝膠電泳或通過高壓液相層析獲得純化，并重懸在水中。
核酶的活性可以通過改變核酶結合臂的長度、或化學合成修飾的核酶來優化，所述修飾有防止該核酶受到血清核糖核酸酶降解的修飾(見例如國際專利申請公開文本WO 92/07065；Perrault等，1990；Pieken等，1991；Usman和Cedergren，1992；國際專利申請公開文本WO 93/15187；國際專利申請公開文本WO 91/03162；歐洲專利申請公開文本92110298.4；美國專利5,334,711；和國際專利申請公開文本WO 94/13688，它們描述了能夠對酶性RNA分子的糖部分進行的各種化學修飾)，增強核酶在細胞中的效力的修飾、以及為了縮短RNA合成時間和減少化學必要條件而進行的莖區II堿基的清除。
Sullivan等(國際專利申請公開文本WO 94/02595)描述了遞送酶性RNA分子的一般方法。核酶可以通過熟悉本領域的人員已知的多種方法施用給細胞。這些方法包括但不限于包裝在脂質體內、離子電滲療法、或摻入其它載體(如水凝膠、環化糊精、生物可降解微型囊(nanocapsule)、和生物粘著微球體)中。對于一些情況，可以在有或沒有上述載體的情況下直接將核酶離體遞送給細胞或組織。或者，可以通過直接吸入、直接注射、或利用導管、輸注泵或支架，進行RNA/載體組合的局部遞送。其它遞送途徑包括，但不限于，血管內、肌肉內、皮下或關節注射，氣霧劑吸入，口服(片劑或丸劑形式)，局部的、系統的、眼、腹膜內和/或鞘內遞送。關于核酶遞送和施用的更為詳細的描述參見國際專利申請公開文本WO 94/02595和國際專利申請公開文本WO 93/23569，所有文獻均特此并入本文作為參考。
在細胞內積聚高濃度核酶的另一方法是將該核酶編碼序列摻入DNA表達載體中。核酶序列的轉錄由針對真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的啟動子驅動。從pol II或pol III啟動子獲得轉錄本將在所有細胞中以高水平表達；在指定細胞類型中指定的pol II啟動子的水平將取決于附近存在的基因調節序列(增加子、沉默子等)的性質。也可以采用原核RNA聚合酶啟動子，只要在適當的細胞中有該原核RNA聚合酶表達即可(Elroy-Stein和Moss，1990；Gao和Huang，1993；Lieber等，1993；Zhou等，1990)。從這些啟動子表達的核酶可以在哺乳動物細胞中發揮功能(例如Kashani-Saber等，1992；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Yu等，1993；L’Huillier等，1992；Lisziewicz等，1993)。可以將這些轉錄單位摻入多種用于導入哺乳動物細胞的載體中，這些載體包括，但不限于，質粒DNA載體、病毒DNA載體(例如腺病毒或腺相關病毒載體)、或病毒RNA載體(例如逆轉錄病毒、無名森林病毒、新培斯病毒載體)。
核酶可以用作診斷工具檢查患病細胞中的遺傳漂變(geneticdrift)和突變。它們還可以用于評價靶RNA分子的水平。核酶活性和靶RNA結構間的緊密關系使得可以在改變了靶RNA堿基配對和三維結構的該分子任何區域中檢測到突變。通過采用多種核酶，可以給在體外、以及細胞和組織內對RNA的結構和功能重要的核苷酸改變進行作圖。可以采用核酶對靶RNA的切割抑制基因表達和(基本上)確定疾病進程中指定基因產物的作用。以此方式，可以將其它遺傳靶標確定為該疾病的重要中介體。這些研究將通過提供綜合治療(例如靶向不同基因的多種核酶、與已知小分子抑制劑偶聯的核酶、或聯合核酶和/或其它化學或生物分子進行的間歇療法)的可能性導致對該疾病進程的更好治療。核酶的其它體外應用是本領域熟知的，包括檢測與IL-5相關疾病有關的mRNA的存在。該RNA通過采用標準方法在以核酶進行處理后測定切割產物的存在來檢測。
結合劑本發明還提供特異地與annexin A3蛋白質結合的藥劑，例如抗體和其抗原結合片段。在本文中，如果抗體或其抗原結合片段與annexinA3蛋白質的反應(在例如ELISA中)處于可檢測到的水平，而在相似條件下與無關蛋白質的反應不能被檢測到時，則被認為與annexin A3蛋白質“特異結合”。本文所用“結合”是指兩個獨立分子之間的非共價聯接以致形成復合物。結合能力可以通過例如測定形成該復合物的結合常數來評價。結合常數是當用各成分的濃度乘積除該復合物的濃度時獲得的值。一般地，在本發明的上下文中，當形成復合物的結合常數大于約103L/mol時，兩個化合物被認為是“相結合的”。該結合常數可以采用本領域熟知的方法測定。
采用本文提供的代表性測定方法，結合劑還能夠區分癌癥患者/癌細胞是否具有耐受鉑類化療藥物的耐受性。換言之，與annexin A3蛋白質結合的抗體或其它結合劑將在至少約20％耐藥性患者/癌細胞中產生指示耐藥性存在的信號，而將在至少約90％敏感患者/癌細胞中產生指示耐藥性不存在的信號。為了確定結合劑是否滿足此要求，可以按本文所述方法測定在來自(用標準臨床檢驗確定的)耐藥和敏感的患者的生物樣品(例如腫瘤活檢組織)中或在耐藥或敏感癌細胞中是否存在與該結合劑結合的多肽。很明顯，分析的耐藥性和敏感樣品的數量應當具有統計學顯著性。每個結合劑都應滿足以上標準；然而，本領域普通技術人員將知道，可以聯合使用多個結合劑以提高靈敏度。
滿足以上要求的任何藥劑都可以是結合劑。例如，結合劑可以是含有或不含有肽成分的核糖體、RNA分子或多肽。在一個優選實施方案中，結合劑是抗體或其抗原結合片段。抗體的制備可以采用本領域普通技術人員已知的多種技術中的任意一種。見例如Harlow和Lane，抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，1988。一般地，可以通過細胞培養技術制備抗體，這些技術包括按本文所述制備單克隆抗體，或通過用抗體基因轉染適合的細菌或哺乳動物細胞宿主，以便使得可以產生重組抗體。在一項技術中，首先給多種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、家兔、綿羊或山羊)中的任一種注射含有本發明多肽的免疫原。在該步驟中，可以將本發明的多肽不經修飾用作免疫原。或者，尤其是對于相對短的多肽，如果將該多肽與載體蛋白質，例如牛血清白蛋白或匙孔血藍蛋白，連接在一起，則可以引起極佳的免疫應答。給該動物宿主注射該免疫原，并優選地根據預先確定的時間表摻入一或多次加強免疫，然后定期采取該動物的血液。然后可以從抗血清中，通過例如采用與適合固相支持物偶聯的該多肽進行親和層析，純化對該多肽具有特異性的多克隆抗體。
對目的抗原多肽具有特異性的單克隆抗體可以采用例如Kohler和Milstein的技術(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，及其改良方法來制備。簡而言之，這些方法涉及制備能夠產生具有期望特異性(即與目的多肽的反應性)的抗體的永生化細胞系。可以從例如獲自按上述方法免疫的動物的脾細胞制備這些細胞系。然后通過例如和骨髓瘤細胞融合伴侶，優選與該免疫動物同基因的骨髓瘤細胞，融合，使該脾細胞永生化。可以采用多種融合技術。例如，可以將該脾細胞和骨髓瘤細胞與非離子去污劑混合幾分鐘，然后以低密度鋪在支持雜種細胞而不支持骨髓瘤細胞生長的選擇培養基上。優選的篩選技術采用了HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)篩選。在足夠長的時間之后，通常為約1-2周，可觀察到雜種集落。選擇單集落，并測試其培養物上清液與本發明多肽的結合活性。優選具有高反應性和特異性的雜交瘤。
可以從培養的雜交瘤集落的上清液中分離單克隆抗體。此外，還可以采用各種技術增加產量，例如將該雜交瘤細胞系注射入適合的脊椎動物宿主例如小鼠的腹腔內。然后可以從腹水或血液中收獲單克隆抗體。可以通過常規技術例如層析、凝膠過濾、沉淀和抽提從這些抗體中除去雜質。本發明多肽可以用于純化方法的例如親和層析步驟中。
在某些實施方案中，可能優選采用抗體的抗原結合片段。這些片段包括Fab片段，它們可以采用標準技術制備。簡而言之，可以通過在A蛋白珠柱上通過親和層析從兔血清中純化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗體實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通過木瓜蛋白酶消化產生Fab和Fc片段。該Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通過親和層析分離。
可以將本發明的單克隆抗體與一或多種治療劑偶聯在一起。在此方面適合的治療劑包括放射性核素、分化誘導劑、藥物、毒素和它們的衍生物。優選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優選的藥物包括氨甲蝶呤、及嘧啶和嘌呤的類似物。優選的分化誘導劑包括佛波酯和丁酸。優選的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、假單孢菌外毒素、志賀氏菌毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
寡核苷酸適配體SELEX技術是近年來發展起來的研究核酸結構、功能及進化等的一種新的組合化學技術，它不僅在基礎研究、生物篩選等方面有很好的應用，而且在臨床診斷方面也顯示廣闊的前景(Brody EN & Gold L，J.Biotechnol.，2000，755-13)。篩選出的寡核苷酸適配子(aptamer)可高親和力和高特異性地識別不同的分子。它的親和力和特異性可與抗體相媲美，被認為是“挑戰”抗體地位的一種新型試劑，在疾病的診斷和治療中發揮越來越重要的作用。SELEX技術一般需要數輪或數十輪才能得到其相應配基。最近，Santa-Coloma TA等報道了用靶標切換技術制備的高特異性“polyclonal oligobody(多克隆寡核苷酸適配體)”、“monoclonal oligobody(單克隆寡核苷酸適配體)”或“synthetic oligobody(合成寡核苷酸適配體)”(BianchiniM et al，J.Immunol.methods，2001，252191-197)可特異性地識別相應的蛋白質，應用于蛋白質印跡、免疫組化、免疫共沉淀等分析實驗中。
調節鉑化療藥物耐藥性的藥劑的篩選本發明此篩選方法中將獲得的或鑒定的化合物可以是能結合本發明任何核酸、肽或蛋白質的化合物。將鑒定的其它目的化合物是調節基因或本發明蛋白質表達的化合物，這樣通過所述化合物的作用增加或降低所述基因或蛋白質的表達。做為替代方案，該化合物可以通過增加或降低任何本發明蛋白質的活性發揮它的作用。
例如在樣品，例如來源于動物的細胞提取物中可以包含所述一種化合物或所述多種化合物。而且，所述化合物可以是本領域已知的，但是迄今為止不知道其具有抑制或激活annexin A3相互作用蛋白質的能力。反應混合物可以是無細胞提取物或可以包含細胞或組織培養物。用于本發明方法的適合設備是本領域技術人員已知的，并且，一般地，在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第3版(1994)，特別是17章中進行了描述。多種化合物可以，例如添加到反應混合物、細胞培養基中或者注射進入細胞中。
如果在本發明方法中鑒定了含有化合物或多種化合物的樣品，那么可以從鑒定含有能起拮抗劑/激動劑作用的化合物的原始樣品分離化合物，或者如果，例如原始樣品由多種不同化合物組成，人們可以進一步細分原始樣品，以降低每個樣品的不同物質的數量，并且利用原始樣品的細分部分重復該方法。根據樣品的復雜性，可以進行上述步驟幾次，優選地，直到根據本發明方法鑒定的樣品僅僅含有有限數量或僅僅含有一種物質為止。優選地，所述樣品含有具有類似化學和/或物理特性的物質，最優選所述物質相同。優選地，根據上述方法鑒定的化合物或其衍生物被進一步制成適于給動物給藥的形式。
作為本發明方法的候選藥劑，可以利用適合的計算機程序可以進行本發明蛋白質結構基序的折疊模擬和計算機再設計(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.1(1995)，675-679)或者可以通過化合物組合文庫篩選獲得。蛋白質折疊的計算機模擬可以用于詳細肽和蛋白質模型的構象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。特別地，通過計算機輔助檢索互補肽序列，適合的程序可以用于annexin A3/磷酸化annexin A3、其配體或其它相互作用蛋白質的相互作用位點的鑒定(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。而且，在背景技術中，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann，N.Y.Acac.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了用于蛋白質和肽設計的適合的計算機系統。從上述計算機分析獲得的結果可以用于例如本發明蛋白質或其片段的肽模擬物的制備。這種蛋白質天然氨基酸序列的假肽類似物可以非常有效地模擬親本蛋白質(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，在蛋白質或其片段中容易得到的非手性Ω-氨基酸殘基的摻入將引起脂肪族鏈聚亞甲基單元對氨基鍵的置換，因此提供了構建肽模擬物的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。在現有技術中還描述了其它系統中的小肽激素的超活性肽模擬類似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通過連續胺烷基化合成肽模擬物組合文庫，和檢測由此得到化合物，例如它們的結合，激酶抑制和/或免疫特性鑒定本發明蛋白質適合的肽模擬物。在現有技術，例如在Ostresh，Methods inEnzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述了肽模擬物組合文庫產生的方法和用途。而且，可以利用本發明蛋白質的三維和/或晶體結構設計生物活性肽模擬物抑制劑(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Ruterber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
本發明相應地也提供調節本發明耐藥性的藥劑、以及包含所述藥劑的藥物組合物和所述藥劑在制備調節本發明所述耐藥性中的用途。
耐藥性的檢測和診斷一般地，可以基于癌細胞株或從患者獲得的腫瘤活檢組織中annexin A3蛋白質的含量和/或編碼這些蛋白質的多核苷酸的含量，檢測所述癌細胞和患者是否具有鉑類化療藥物耐藥性。一般本文提供的結合劑可以檢測生物樣品中與該藥劑結合的抗原的水平。多核苷酸引物和探針可以用于檢測編碼腫瘤蛋白質的mRNA的水平，該水平也指示了耐藥性的存在與否。
對于采用結合劑檢測樣品中的多肽標志而言，有多種本領域普通技術人員已知的測定形式可以使用。見例如Harlow和Lane，抗體實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，癌細胞株和癌癥患者的鉑化療藥物耐藥性可以通過以下步驟確定(a)用結合劑接觸癌細胞株或從患者獲得的腫瘤樣品；(b)檢測樣品中與該結合劑結合的多肽的水平；和(c)將該多肽水平與預先確定的截斷值進行比較。
在一個優選的實施方案中，該測定涉及采用固定在固相支持物上的結合劑結合該多肽，并從樣品剩余物中分離該多肽。然后采用含有報道基團并特異與該結合劑/多肽復合物結合的檢測試劑檢測該結合的多肽。這些檢測試劑可以含有例如，與該多肽特異結合的結合劑、或與該結合劑特異結合的抗體或其它藥劑，例如抗免疫球蛋白、G蛋白、A蛋白或凝集素。或者，可以利用競爭測定法，在該方法中用報道基團標記多肽，并在固定化結合劑與樣品一起孵育后，允許該多肽和該結合劑結合。該樣品中的成分對該標記多肽與該結合劑結合的抑制程度指示了該樣品與該固定化結合劑的反應性。適合用于這些測定方法的多肽包括以上所述的全長annexin A3蛋白質和其與該結合劑結合的部分。
正如以上指出的，還可以，或者作為替代方案可以，基于癌細胞樣品中編碼annexin A3蛋白質的mRNA的水平檢測耐藥性。例如，可以在基于聚合酶鏈式反應的測定中采用至少兩個寡核苷酸引物擴增來源于樣品的腫瘤cDNA的部分，其中該寡核苷酸引物中的至少一個對編碼該annexin A3蛋白質的多核苷酸是特異的(即可以與之雜交)。然后采用本領域熟知的技術，例如凝膠電泳，分離并檢測該擴增的cDNA。相似地，可以在雜交測定(hybridization assay)中采用特異與編碼annexin A3蛋白質的多核苷酸雜交的寡核苷酸探針，檢測生物樣品中是否存在編碼該腫瘤蛋白質的多核苷酸。
本發明還提供用于任一種以上檢測和診斷方法的試劑盒。這些試劑盒典型地含有進行診斷測定所必需的兩種或多種成分。這些成分可以是化合物、試劑、容器和/或設備。例如，試劑盒中的一個容器可含有特異與annexin A3蛋白質結合的單克隆抗體或其片段，或者該試劑盒中的一個容器可含有特異于annexin A3編碼序列的核酸探針或引物。
癌癥治療在本發明的其它方面，涉及基于本發明人首次發現的annexin A3與癌癥的鉑化療藥物耐藥性的相關性，治療癌癥。在這些方法中，典型地通過本發明的診斷方法鑒定患者的耐藥性，然后根據耐藥性結果確定患者的鉑類化療藥物施用方案。在一個實施方案中，本發明的治療方法包括對確定為具備耐藥性的患者通過本發明的調節耐藥性的方法降低其耐藥性后，再施用鉑類化療藥物。另一實施方案中，本發明的治療方法包括根據確定的耐藥性結果，調整鉑類化療藥物的給藥量、給藥頻率等。再一實施方案中，本發明治療方法包括根據確定的耐藥性結果，替代鉑類化療藥物用于該患者的治療中。本文所用“患者”是指任何恒溫動物，如哺乳動物，優選人類。
藥物組合物在其它實施方案中，本發明涉及本文所公開的一或多種多核苷酸、多肽、反義寡核苷酸、核酶、寡核苷酸適配體和/或抗體在可藥用載體或者賦形劑中的制劑，用于單獨或聯合一或多種其它形式的診斷/治療方法施用給細胞或動物。一個實施方案中，本發明藥物組合物可以用于診斷本發明患者的鉑化療藥物耐藥性并預測/預后所述化療藥物的治療效果。另一實施方案中，本發明藥物組合物可以用于調整本發明患者的鉑化療藥物耐藥性，在此情況下，優選地，本發明藥物組合物以靶向患者腫瘤細胞并導致腫瘤細胞中annexin A3表達改變(優選下調)的方式實現對患者耐藥性的調整。
可藥用賦形劑和載體溶液的配制是本領域技術人員熟知的。同樣，對于在各種治療方案中使用本文所述具體組合物的適合給藥和治療方案(包括例如口服、非腸道途徑、靜脈內、鼻內、和肌內給藥和藥物配制)的研制也是本領域技術人員熟知的。
本文所述治療組合物的施用途徑和頻率及劑量將因人而異，而且可以由臨床醫師確定。一般地，可以通過注射(例如皮內、肌內、靜脈內或皮下)、鼻腔途徑(例如通過吸入)或口服，施用這些藥物組合物。一般地，適當的劑量和治療方案提供足以獲得治療益處的活性成分量，其可以通過確定與未治療患者相比經治療的患者出現改善的臨床效果來監測或確定。
以下通過實施例進一步對本發明進行舉例說明。但是應當理解，這些實施例不以任何方式對本發明的范圍構成限制。
實施例在本申請的研究中，本申請發明人首次利用蛋白質組學技術研究耐藥與敏感細胞之間蛋白質表達譜的差異，進而尋找可能的耐藥標志物。
首先建立了大劑量沖擊法和小劑量間歇法誘導的卵巢癌細胞系SKOV3耐受順鉑的細胞系，通過對兩種細胞系的生物學特性的檢測，發現相同的藥物不同的誘導方式對于耐藥基因的表達具有不同的影響，小劑量間歇法更易產生耐藥。并且為研究鉑類耐藥機制建立了良好的細胞模型。
其次，以兩種卵巢癌敏感細胞系SKOV3和A2780，四種耐藥細胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP、A2780/CBP為研究對象，通過雙向凝膠電泳建立了各自的蛋白質表達譜，統計分析差異表達的蛋白質，進行質譜鑒定。蛋白質annexin A3、destrin、IDHc、GSTO1-1和cofilin 1在三種以上耐藥細胞中差異表達。其中，首次發現annexin A3在耐藥細胞中表達均顯著上調，同時已經通過RT-PCR和western blot兩種方法同時驗證了此結果。
為了解annexin A3與耐藥性的關系，利用基因工程技術，以pcDNA3.1/myc-His(-)B為載體，構建表達反義annexin A3的真核表達質粒，以pcDNA3.1(+)為載體，構建表達正義annexin A3的真核表達質粒，并以pEGFP-N1為載體，構建表達annexin A3融合蛋白的真核表達質粒，通過脂質體介導質粒DNA轉染各細胞系。通過pEGFP-N1-annexin A3分別轉染SKOV3和A2780細胞系，檢測SKOV3和A2780的轉染效率分別為20-25％和45-55％。穩定轉染后敏感細胞系在轉染正義annexin A3質粒后耐藥指數上升2～4倍，耐藥細胞系在轉染反義annexin A3質粒后耐藥指數下降2倍左右，證明了annexinA3的上調或下調與耐藥性有關。
為了在臨床驗證annexin A3與鉑類耐藥的相關性，分別收集臨床卵巢癌治療中采用鉑類為主化療敏感及耐藥病人的手術病例，對石蠟切片進行annexin A3的免疫組化試驗。雙盲法顯微鏡下閱片和評價，采用等級資料的秩和檢驗統計化療敏感及耐藥患者的annexin A3表達量，U值＝139，P值＝0.035＜0.05，說明化療敏感者與耐藥者的annexinA3表達量之間存在顯著性差異，化療耐藥者的annexin A3表達量高于敏感者，驗證了annexin A3是一種卵巢癌鉑類耐藥相關蛋白。
實施例一上皮性卵巢癌耐藥細胞系的建立和鑒定(一)實驗方法一)細胞系與細胞培養人漿液性卵巢癌SKOV3細胞系購于中國醫學科學院基礎醫學細胞中心。細胞在含10％胎牛血清的DMEM(HG)(美國Gibco公司)培養液中貼壁生長，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱中培養，0.25％胰蛋白酶消化傳代。
二)耐藥細胞系的建立1.大劑量沖擊誘導法命名為SKOV3/CDDP-P細胞。在培養基中加入100μmol/L CDDP(順鉑，FH科鼎有限公司)2h后，棄含藥培養基，加不含藥物培養基，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱中繼續培養，待細胞生長至對數生長期(密度至70％-80％)，重復劑量沖擊。100μmol/L沖擊20次，200μmol/L沖擊10次。給藥間隔時間由最初的4周逐漸變為4～5d。具體給藥時間和間隔見圖1。
2.小劑量間歇誘導法命名為SKOV3/CDDP-80。在培養基中加入10μmol/L的CDDP，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱中培養48h，棄含藥培養基，加不含藥物培養基，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱中繼續培養，待細胞生長至對數生長期，重復劑量誘導。劑量為10、20、40和80μmol/L各10次遞增。給藥間隔時間由最初的6周逐漸變為1～2周。具體給藥時間和間隔見圖2。
細胞誘導成功后，將細胞在無藥物的培養基中培養2個月，再進行各項實驗。
三)藥物敏感試驗取指數生長期細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，按2000個細胞/孔/100μl，每種細胞按每個濃度設6個平行孔，對照孔12個，不加藥物，其中6個孔為陰性對照(加入細胞、不加藥物)，6個孔為空白對照(只加培養基)。37℃、5％CO2培養24小時后加入CDPP，以3-5倍稀釋成7個梯度，CDDP最高濃度200μg/ml，繼續培養72小時，加入5mg/ml MTT(四甲基偶氮唑鹽，美國Sigma公司)20μl，37℃、5％CO2繼續培養4小時，控凈培養基，加100μl裂解液(含20％SDS，50％N-N二甲基甲酰胺，pH 4.7)，過夜，全自動酶標儀以540nm測定吸光值(OD值)，可求算每種藥物濃度吸光值的平均值，計算細胞存活率及抑制率，根據藥物濃度和抑制率，使用SPSS11.5軟件計算IC50(抑制50％細胞生長的藥物濃度)及耐藥指數(RI)。
抑制率(inhibition rate)＝[(OD對照-OD實驗)/OD對照]×100％
RI＝耐藥細胞系的IC50/敏感細胞系的IC50四)形態學觀察1.倒置顯微鏡將5×104/ml單細胞懸液接種至內鋪小玻片的24孔培養板內，置于37℃、5％CO2孵箱內培養72小時后用PBS洗2遍，甲醛固定10分鐘，瑞式-姬姆薩染色2小時，再用PBS洗2遍，室溫晾干，中性樹膠封片，光鏡下觀察、拍照。瑞式-姬姆薩染色液配方磷酸氫二鈉(1/15M) 6ml磷酸二氫鉀(1/15M) 4ml瑞氏染色液(Sigma) 120μlMAY染色液(Sigma)120μl姬姆薩染色液(Sigma) 500μl2.細胞內超微結構觀察(1)對數期生長的細胞(細胞總數≥1×106)，棄培養基，PBS洗滌2次；(2)加入PBS10ml，送至軍事醫學科學院(北京海淀區太平路27號)儀器檢測中心電鏡室進行細胞切片；(3)細胞長至對數生長期，PBS洗兩遍，用細胞刷將細胞刮下，1000g離心10分鐘，3％戊二醛(1/15M PBS pH7.4)，4℃下固定2小時，4℃下1/15M PBS+0.19M蔗糖緩沖液漂洗15分鐘。乙醇4℃下梯度脫水(50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、90％乙醇+90％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各10分鐘)，100％丙酮在室溫下脫水10分鐘。100％丙酮∶包埋劑(1∶1)室溫浸透30分鐘，純包埋劑浸透過夜。進行包埋聚合時間為35℃，12小時45℃，12小時；60℃，24小時。ULTRACUTE/S型切片機(美國RMC公司)進行超薄切片，醋酸鈾染液避光染色10分鐘，檸檬酸鉛染色10分鐘。
(4)電壓75kV，EM400T電鏡(荷蘭Philips公司)觀察，選擇×8000、×22000電鏡照相。
五)細胞群體倍增時間測定取對數生長期的非耐藥和耐藥細胞，24孔培養板中每孔接種5000個細胞，37℃，5％CO2培養。每天取3孔細胞進行計數，連續觀察7d。繪制生長曲線，計算群體倍增時間。
六)細胞周期分析取對數生長期的非耐藥和耐藥細胞各1×106，制成單細胞懸液，離心收取細胞，冷PBS(PH7.4)洗滌兩次，去上清，加入含70％冷乙醇、3％血清的PBS固定(-20℃)過夜，2000g離心去上清，冷PBS洗滌兩次并以0.5～1ml PBS重懸(內含200μg/ml RNA酶A)，混勻后，37℃水浴30分鐘，加入400μl碘化丙啶(濃度50μg/ml，Sigma)，4℃避光染色30分鐘，以FACSCalibur(美國BD公司)流式細胞儀測定10000個細胞的DNA含量。
七)RT-PCR1.細胞RNA的提取取對數生長期的細胞約5×106，以0.25％胰酶消化，PBS吹打，洗脫至10ml離心管中，800rpm離心10分鐘，PBS洗兩遍，轉移細胞至新的Eppendorf管中，離心，棄上清。加500μlTRIzol(Sigma)混合后，吹打混勻，再加500μl TRIzol，震搖30秒，室溫下放置5分鐘，加200μl氯仿，顛倒混勻15秒，并在室溫下放置2分鐘，4℃12000g離心15分，離心后取上層水相，轉移至新的Eppendorf管中，以500μl異丙醇沉淀RNA，混勻，4℃12000g離心10分，倒掉上清，沉淀用70％乙醇洗滌，4℃8000g離心10分鐘，吸去上清，短暫干燥15分，加入20μl無RNA酶的水。
2.逆轉錄(日本TaKaRa公司逆轉錄試劑盒)在50μl反應體積中，加入7μl RNA，10mM dNTP 5μl，25mM氯化鎂10μl，2.5pmol/μl的oligo dT 1μl，10×RT Buffer 5μl，40U/ml的RNasin 0.5μl，5U/ml的AMV 1μl，RNase Free dH2O 20.5μl，混勻后離心數秒，42℃水浴60分，98℃5分鐘滅活AMV。
3.PCR反應，反應體系(總體積20ul)Taq MasterMix buffer(美國10ulInvitrogen公司)
上游引物 0.5ul下游引物 0.5ul逆轉錄產物1ulH2O 8ul各引物(表1)反應條件為95℃預變性2min進入循環，95℃變性20s，58℃退火1min，72℃延伸50s，35個循環后72℃延伸10min。1.5％瓊脂糖分離PCR產物。電泳結束后、把瓊脂糖凝膠置入JS-380自動凝膠圖像分析儀(上海培清科技有限公司)的暗箱中，用gelscan系統掃描。使用QCapturePro軟件分析掃描結果。以β-actin為內參，進行半定量比較。
八)Western blot1.細胞的裂解取對數生長期的非耐藥和耐藥細胞，胰酶消化，1500rpm離心5分鐘，棄去上清，加入無菌PBS(pH7.4)重懸，進行細胞計數，1500rpm離心5分鐘，棄上清，用冷PBS洗細胞兩次，吸凈上清。約106個細胞加laemmli裂解液(美國Bio-Rad公司)，在裂解細胞時，其它細胞處于冰水浴。加入裂解液后，99℃煮沸10分，10000g、4℃離心10分鐘，取出后冰水浴。取出測定蛋白濃度的樣品后，將剩余的樣品每100μl加入2-ME(2-巰基乙醇)5μl，10000g、4℃離心10分鐘，-20℃保存。
2.BCA法測定蛋白濃度取BCA蛋白質定量試劑盒(Pierce)A液、B液以50∶1(v∶v)混合，取上述樣品加入500μl AB混合液中，混勻，空白對照為2μl裂解液加入到500μl AB混合液，37℃水浴30分鐘，以空白對照調零，在SmartspecTMplus spectrophotometer(Bio-Rad)測562nm波長的OD值。使用Excel繪制標準曲線，求算樣品濃度。
3.SDS-PAGE電泳配制Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS。制備10％分離膠5ml∶去離子水1.9ml，30％丙烯酰胺溶液1.7ml，1.5％Tris 1.3ml(pH8.8)，10％SDS 0.05ml，10％過硫酸胺0.05ml，TEMED 0.002ml。上述膠于30分鐘后凝固。配5％積層膠2ml∶去離子水1.4ml，30％丙烯酰胺溶液0.33ml，1.0％Tris 0.25ml(pH 6.8)，10％SDS 0.02ml，10％過硫酸胺0.02ml，TEMED 0.002ml。上述膠于30分鐘后凝固。取30μg各細胞蛋白上樣，80-100v，電泳2小時。
4.電轉移配制轉移緩沖液48mM Tris HCl，39mM甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇。戴手套剪兩張與凝膠大小一致的濾紙和一張PVDF膜(Pierce)。將上述濾紙和濾膜用轉移緩沖液浸泡10分鐘，按濾紙、濾膜、凝膠、濾紙疊放，注意不能有氣泡。右下角標記。80v、冰水浴電轉移2小時。
5.免疫印跡配制10×TBST200mMTris HCl，1.5mM NaCl，使用前加0.05％Tween-20。將PVDF膜取下，TBST搖洗5分鐘后，在含5％脫脂奶粉的TBST中封閉1小時。TBST搖洗三次(15分鐘)，加入封閉液配制的一抗，4℃輕搖過夜。以TBST搖洗三次(15分鐘)，加入封閉液配制的二抗(HRP標記)，輕搖1小時。TBST搖洗三次。將化學發光底物液ECL(Pierce)A、B液按體積1∶1混合，將PVDF膜作用5分鐘，于暗室曝光顯色。
九)統計學分析實驗數據使用SPSS11.5統計軟件處理，經t檢驗進行統計分析。
(二)實驗結果一)耐藥指數SKOV3對CDDP的IC50為(6.67±2.58)μmol/L，RI為1。
采用大劑量沖擊誘導法和小劑量間歇誘導法對SKOV3細胞進行體外誘導，歷時16個月獲得兩種耐藥細胞系，在無藥物培養基中培養4個月耐藥性穩定。SKOV3/CDDP-P對CDDP的IC50為(27.24±18.60)μmol/L，RI為4.12±2.01；SKOV3/CDDP-80對CDDP的IC50為(76.07±3.85)μmol/L，RI為11.50±3.15。小劑量間歇誘導法的耐藥指數高于大劑量沖擊誘導法(P＜0.05)(圖3)，小劑量間歇誘導比大劑量沖擊誘導更易產生耐藥。
二)細胞形態觀察1.光鏡下SKOV3細胞及其它誘導的耐藥細胞系成貼壁生長，光鏡下SKOV3細胞成梭形，上皮樣生長，邊界清楚，折光性好(圖4a)。藥物誘導后大部分細胞死亡，細胞形態變長，邊界模糊，大小不一。其中，SKOV3/CDDP-80細胞變化更明顯，很大一部分細胞成神經元細胞樣生長，伸出偽足，核畸形多見，細胞質顆粒增多(圖4b，c)。待至對數生長期，細胞形態逐漸恢復，SKOV3/CDDP-P細胞形態與SKOV3細胞差別不明顯，而SKOV3/CDDP-80細胞仍呈多形性，邊界不清(圖4d，e，f)。
2.掃描電鏡下，正常SKOV3細胞成梭形，細胞表面微絨毛豐富，長而纖細，分布均勻，細胞核大而圓，向細胞表面隆起。CDDP-P和CDDP-80均可見細胞表面微絨毛較稀疏，分布欠均勻。CDDP-P形態變化不大，而CDDP-80形態變化顯著，細胞自胞核向兩側延伸，面積較大(圖5a)。透射電鏡下，可見SKOV3細胞核漿比例倒置，胞核較大，含1～2個核仁，核膜完整光滑，核內染色質成團塊狀聚集，胞漿內含有大量線粒體。CDDP-P和CDDP-80細胞核大形態不規則，畸形核可見，核膜凹陷明顯，有核袋和核突。染色質分布不均，有的凝結成塊，胞漿內線粒體減少，具有大量囊泡樣結構。這些囊泡樣結構部分是空泡，部分可見顆粒樣物(圖5b，c)。
三)生長曲線和細胞群體倍增時間第2天，各細胞均處于滯留期，細胞數無明顯增加。自2～3d起，SKOV3細胞進入對數生長期，明顯高于SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80(圖6)。SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80群體倍增時間(GDT)分別為27.49±4.21h、47.26±4.64h和57.48±6.17h。SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80細胞的GDT明顯高于SKOV3細胞(P＜0.01，P＜0.001)。而SKOV3/CDDP-80細胞生長最緩慢，與SKOV3/CDDP-P細胞具有明顯差異(P＜0.01)。
四)細胞周期分布SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的G0/G1期均明顯延長(P＜0.01)，S期及G2/M期均縮短(P＜0.05，P＜0.01)。SKOV3/CDDP-80與SKOV3/CDDP-P相比，各期雖無明顯差異，但G0/G1期具有延長的趨勢(表2)。
五)耐藥相關基因的表達RT-PCR方法測定多藥耐藥蛋白(multiple drug resistanceprotein，MDR1)、多藥耐藥相關蛋白1(multi-drug resistanceassociated protein 1，MRP1)、肺耐藥蛋白(lung resistanceprotein 1，LRP1)和谷胱甘肽S轉移酶pi(glutathioneS-transferase pi，GST-pi)mRNA的表達。SKOV3不表達MDR1，表達MRP1、LRP1、GST-pi。SKOV3/CDDP-P之MDR1上調(P＜0.01)，MRP1和LRP1均下調(P＜0.01)，GST-pi無明顯改變。SKOV3/CDDP-80之MDR1上調(P＜0.01)，MRP1、LRP1、GST-pi無明顯改變(圖7、8、9)。相同的藥物不同的誘導方式對于耐藥基因的表達具有不同的影響，提示藥物劑量對于耐藥過程的產生具有不同的機制，同時說明藥物的劑量對于耐藥病例的產生具有一定的影響。
(三)結論本研究為了闡明不同誘導方式建立的耐藥細胞系之間存在的差異，為臨床研究提供更理想的耐藥模型，選用人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌SKOV3細胞系為實驗對象，CDDP為誘導藥物，使用大劑量沖擊法和小劑量間歇誘導法歷時16個月建立了兩種耐藥細胞系-SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80，可見SKOV3對于CDDP產生耐藥性是一個緩慢的過程。同時，小劑量間歇誘導比大劑量沖擊誘導更易產生耐藥的結果提示，臨床化療藥物的劑量對于耐藥病例的產生具有一定的影響。本實驗建立的耐藥細胞系，在4個月的常規培養過程中，耐藥指標未發生改變，耐藥性非常穩定。相同的藥物不同的誘導方式對于耐藥基因的表達具有不同的影響，提示藥物劑量對于耐藥過程的產生具有不同的機制。
實施例二上皮性卵巢癌鉑類耐藥相關蛋白質的篩選和驗證(一)實驗方法一)細胞和細胞培養人漿液性卵巢癌細胞系SKOV3購于中國醫學科學院基礎醫學細胞中心。SKOV3/CDDP系本室采用大劑量順鉑沖擊法誘導成耐藥細胞系(具體誘導方法見第一部分。由于大劑量沖擊誘導法與臨床化療方法較類似，在后面的研究中均以SKOV3/CDDP-P為研究對象，并命名為SKOV3/CDDP)。人上皮性卵巢癌細胞系A2780，A2780/CDDP，A2780/CBP和SKOV3/CBP由李力教授(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科)提供。所有細胞在含10％胎牛血清的DMEM(HG)培養液中貼壁生長，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱中培養。
二)藥物敏感試驗具體實驗步驟見第一部分。
三)雙向凝膠電泳1.細胞總蛋白質的制備待細胞培養至對數生長期，胰酶消化，置離心管中離心，冷PBS洗兩次，離心去上清，收集細胞1×106懸于50ul裂解液中(2M硫脲，EDTA 1mM，7mol/L urea，4％CHAPS，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT)，吹打混勻，震搖15秒，快速凍融3個循環，超聲至透明，加入適量cocktail蛋白酶抑制劑(德國Roche公司)，20ug/ml DNase I，5ug/ml RNaseA(Sigma)，冰浴30分鐘，13000g、4℃離心30分鐘，取上清至另一Ep管中，用Bradford法(Bio-Rad)測定蛋白質的濃度，樣品分裝儲存于-70℃備用。
2.第一相固相pH梯度等電聚焦電泳細胞總蛋白質提取物(1mg)與水化液(8mol/L urea+4％CHAPS+20mmol/L DTT+0.5％IPG bufferpH3-10NL+痕量溴酚藍)充分混合，總體積350ul，加入IPGstrip持膠槽，將IPG干膠條pH3-10(180mm×3mm×0.5mm)(英國AmershamBiosciences公司)去保護摸膠面朝下，輕輕置入持膠槽中，驅除氣泡，覆蓋一層DryStrip Cover Fluid(Amersham Pharmacia，#17-1335-01)，蓋好持膠槽蓋子，置于IPGphor等電聚焦儀(AmershamBiosciences)的電極板上，水化和聚焦在20℃自動進行，總電壓時間積為6-8萬Vh，其中水化重泡脹4h，在30V低電壓進行6h，然后經過500V1h、1000V1.5h、5000V1h、最后穩定在8000V下進行。
3.平衡等電聚焦結束后，迅速取出帶樣品的IPG膠條分別于20ml平衡液A(50mmol/L Tris-HCl pH＝8.8+6mol/L urea+30％甘油+2％SDS+0.3％DTT)和20ml平衡液B(50mmol/L Tris-HClpH＝8.8+6mol/L urea+30％甘油+2％SDS+1.85％碘乙酰胺+痕量溴酚藍)中各平衡15分鐘。
4.第二相垂直板SDS-PAGE電泳將平衡后IPG的膠條移至1.5mm厚的連續膠(13％均勻分離膠)的濃縮膠上端，并在其一端的外側加上SDS標準蛋白質，排凈氣泡后用0.5％瓊脂糖封固，15C循環水冷卻，先用40mA/2塊膠恒流電泳40分鐘，再用60mA/2塊膠恒流電泳直至溴酚藍到達玻璃板下緣停止電泳。
四)考馬斯亮蘭染色1.取出凝膠板，置于固定液(40％乙醇，10％冰醋酸，50％雙蒸水)中，震搖30分鐘。
2.棄固定液，置于染色液(一片R-350(Amersham Pharmacia)溶于10％醋酸1600mL中)中熱染10分鐘。
3.置于脫色液(10％冰醋酸)中震搖過夜。
五)凝膠圖像分析顯色的凝膠通過Imagescanner掃描儀(Amersham Biosciences)以及Labscan5掃描軟(AmershamBiosciences)件獲取圖像。蛋白質的量被定義為構成這個斑點的所有像素值的總和。為了較準確反映蛋白質斑點量的變化，將每個點的含量表示為相對百分含量(％Vol)，也就是一個蛋白質斑點的像素值占整個凝膠內所有蛋白質斑點像素值的百分數。用ImageMaster2D Platinum分析軟件(Amersham Biosciences)對圖像進行背景削減、斑點檢測、匹配、量化獲取斑點位置坐標等分析。所有數據分析在SPSS 11.5軟件上進行。
六)質譜樣品的制備1.脫色將電泳及染色后凝膠中的蛋白帶用干凈的解剖刀切下，并將膠帶切成1-2mm3大小的膠粒置于Eppendorf管中。在Eppendorf管中加入超純水清洗幾次后，用含50％乙腈(ACN)的50mM的碳酸氫銨(NH4HCO3)脫色液30μl浸泡膠粒。振蕩20分鐘，棄去溶液，重復2-3次至膠中的藍色褪盡。
2.酶解將脫色后的膠粒真空離心干燥30分鐘使其完全脫水，體積縮小，加入3-10μL胰酶液(0.01μg/μl)，置于4℃冰箱中20-30分鐘。從冰箱取出樣品，仔細觀察樣品中的酶量，若膠粒完全泡漲后酶液仍有剩余，需將多余的酶液吸出，補充5-10μl 25mM NH4HCO3溶液作為保溫反應的緩沖液。用Parafilm封口膜將樣品管封閉后超聲1-2分鐘，置于37℃水浴保溫過夜。
3.肽提取取出步驟2的樣品，離心吸出上清液置于新的Eppendorf管中(可將此上清液取出2μl直接做質輔助激光解吸離子飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS))。
在膠中加5％TFA約5-100μl，剛好蓋住膠粒。用封口膜將管口密封后超聲1-2分鐘，于37℃水浴中保溫1小時，離心后吸出上清夜。注意不要將膠粒吸到槍頭中或帶出來造成樣品損失。
在膠中加5％三氟乙酸(TFA)∶乙腈1∶1混合液5-100μl，用封口膜將管口密封后超聲1-2分鐘，于37℃水浴中保溫1小時，離心后吸出上清液。
加入適量ACN于室溫放置一會，待膠粒脫水變白，吸取，合并上清液。
4.干燥將上述4步提取的上清液冰凍干燥。
七)肽質量指紋譜鑒定蛋白質在干燥后的肽混合物內加入2μl-7μl 0.5％TFA，混勻后，取0.5μl-1μl溶液和等體積飽和基質溶液(將α-氰基-4-羥基肉桂酸(德國Bruker公司)溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中)混合，然后加至不銹鋼靶上，室溫干燥后裝靶測定。20kV、陽離子模式下在Bruker reflex III型MALDI-TOF-MS質譜儀(Bruker)上獲取數據。質譜峰的質量準確度以胰酶的自切峰為內標進行校正。
八)數據庫查詢通過Mascot軟件在SwissProt和NCBInr數據庫中進行查尋。查詢條件肽質量指紋圖中的肽片段質量不限，酶選擇胰酶，可變修飾選擇脲甲基化和氧化作用，肽片段分子量最大容許誤差控制在±100ppm，每個肽允許有1個不完全裂解位點，物種來源選擇人類，離子選擇陽離子和單一同位素的，被選擇的片段信號均應較強，為基線寬度的1倍以上。
九)定量PCR取對數生長期的細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行定量PCR反應。引物由Invitrogen公司合成(見表3)。優化的熒光實時定量PCR體系為10μl，包括1μl引物，1μl模板cDNA、5μl DyNAmo PCR Master Mix(芬蘭Finnzymes公司)，3μl無RNA酶水。PCR條件設置如下95℃滅活2分鐘，95℃變性30s、52℃退火50s、72℃延伸40s，共35個循環，循環結束后72℃最后延伸7分鐘。使用Opticon Monitor 3 software軟件(Bio-Rad)分析PCR過程各檢測樣本的CT(Threshold cycle)值，本實驗使用相對定量的方法，使用ΔΔCT法進行計算比較。每次實驗均重復3次，取其均值。
十)Western blot具體實驗步驟見第一部分。
十一)統計學方法利用單因素方差分析和t檢驗檢測樣本中差異表達的蛋白質點，統計學分析在SPSS 11.5中進行。
(二)實驗結果一)耐藥細胞系六種細胞對順鉑或卡鉑的IC50和RI見表4，四種耐藥細胞的耐藥性質比較穩定，在常規培養基中培養過程中，檢測RI無明顯改變。因此我們的實驗對象是穩定的，增加實驗結果的可信度和可重復性。
二)人卵巢癌細胞系及其耐藥細胞系的雙向凝膠電泳圖譜對每種細胞的蛋白質樣品分別進行二維凝膠電泳分離，每個細胞樣品至少重復3塊凝膠，考染后每塊凝膠能檢測到約1800個蛋白質斑點。一種細胞樣本凝膠的匹配率可達到95％以上，一種細胞系及其亞系之間凝膠匹配率為90％，不同的細胞系之間凝膠匹配率可達80％～85％。將每一種耐藥細胞樣品的所有重復凝膠相互對應蛋白質斑點的相對體積求平均值，表達量相差2倍以上即被視為差異點。耐藥與其對應敏感細胞樣品進行比較，確定了在不同細胞系中與鉑類耐藥相關的差異蛋白質斑點。這些點主要分布在等電點5～9、分子量14.0kDa～70.0kDa的范圍內。
三)肽質量指紋譜鑒定蛋白質通過軟件分析分別獲得了人卵巢癌耐藥細胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP與其親本細胞的差異表達的62個蛋白質點(P＜0.05)(圖10)，利用MALDI-TOF-MS成功的鑒定了57個蛋白質點。為了保證匹配結果的準確性，將不同凝膠上的匹配的蛋白質點同時進行質譜鑒定，結果顯示它們是相同的蛋白質。在四種耐藥細胞的蛋白質表達譜中，我們發現每種耐藥細胞均有12～16種差異表達蛋白質，共計36種蛋白質，其中超過1/3的差異蛋白質屬于酶類。究其功能囊括了多個方面的代謝，如能量代謝、核苷酸代謝、氧化還原作用、細胞骨架相關蛋白、蛋白質脂肪代謝、信號轉導等等。
四)SKOV3/CDDP與SKOV3細胞的差異表達蛋白質在SKOV3的耐藥亞系SKOV3/CDDP中，發現有14個蛋白質點差異表達(P＜0.05)。其中，9個蛋白質點表達上調，5個蛋白質點表達下調(表5)。在這些差異表達蛋白質點中，有些蛋白質如熱休克蛋白家族(點21和28)已經被證實與耐藥有關，在耐藥標本中表達上調了7倍。Annexin A3(點25)表達量升高4倍，而villin 2(點1)和IDHc(點7)的表達較親本細胞分別降低了7倍和9倍。
五)SKOV3/CBP與SKOV3細胞的差異表達蛋白質SKOV3/CBP與SKOV3相比較，共有16個蛋白質點差異表達(P＜0.05)(表6)。在SKOV3/CBP中，一些蛋白質顯示出與SKOV3/CDDP的不同表達差異。Stomatin(EPB72)-like 2(點4)在SKOV3/CDDP中下調，而在SKOV3/CBP中卻高表達.熱休克70kDa蛋白1A和熱休克蛋白27也表現出與SKOV3/CDDP相反的表達趨勢。stathmin 1(點18)和phosphoglycerate mutase 1(點14)的表達上調了四倍，IDHc(spot 7)下調了3倍。與SKOV3/CDDP相比，annexin A3(點25)僅上調了3倍。在過去的研究中，annexin A1(點9)的上調與耐藥相關，而在SKOV3/CBP中annexin A1呈下調。在這16個差異表達蛋白質中，蛋白點的強度改變均在2～4倍之間。
六)A2780/CDDP與A2780細胞的差異表達蛋白質由于A2780和SKOV3均屬上皮性卵巢癌，A2780細胞的蛋白質表達圖譜與SKOV3相似。在A2780的耐受順鉑細胞A2780/CDDP中，有15個差異表達蛋白質點(P＜0.05)(表7)。其中，僅有4個蛋白質點低表達，在A2780中，annexin A3(點25)低表達，而在A2780/CDDP中annexin A3的表達升高了20倍.。GSTO1-1(點54)和splicing factor，arginine/serine-rich 3(點33)分別上調了5倍和6倍。
七)A2780/CBP與A2780細胞的差異表達蛋白質雖然A2780/CBP和SKOV3/CBP均是在卡鉑的誘導下建立起來的，但它們在差異蛋白質的表達上不甚相同。在A2780/CBP中，發現12個蛋白質點差異表達(P＜0.05)(表8)，其中共有5個蛋白質點下調，而且均下調2～3倍。Phosphoribosyltransferase(點32)和UMP-CMPK(點31)分別上調了3倍和4倍，在SKOV3/CBP中，ECH1 protein(點47)and stathmin 1(spot 18)輕微上調，而在A2780/CBP中下調。Cofilin 1(點34)的表達亦呈相反的趨勢，在A2780/CBP中顯著上調(10倍)，而在SKOV3/CBP中卻下調。然而，dUTP pyrophosphatase(點56)表達卻均下降。
在四種耐藥細胞各自的差異表達蛋白中，我們發現5種蛋白質在三種以上耐藥細胞中均差異表達(表9)。其中，annexin A3(圖11、12)和destrin在耐藥標本中表達均上調，其中以annexin A3上調最顯著(3～20倍)(圖13)，NADP-dependent isocitratedehydrogenase 1(IDHc)在四種耐藥細胞中均下調(圖14)。Glutathione transferase omega 1(GSTO1-1)除了在SKOV3/CBP中表達無改變外，在SKOV3/CDDP、A2780/CDDP和A2780/CBP中表達均上調(圖15)。而cofilin 1卻表現出截然相反的性質，在SKOV3的兩種耐藥細胞中表達下調，在A2780的耐藥細胞中卻皆上調(圖16)。
八)定量PCR法檢測mRNA的表達為了驗證五種蛋白質在SKOV3和A2780細胞以及它們各自的耐藥亞系中的表達情況，在RNA水平進行檢測。結果(圖17)顯示，SKOV3和A2780細胞均低表達annexin A3，而它們的順鉑和卡鉑耐藥細胞的annexin A3水平均明顯上調(P＜0.01)。Destrin在SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP和A2780/CDDP細胞中上調(P＜0.01，P＜0.05)。Cofilin1僅僅在SKOV3/CBP中上調(P＜0.05)，A2780/CDDP中下調(P＜0.01)。而GSTO1-1僅在順鉑誘導的耐藥細胞中表達上調(P＜0.01)。除了A2780/CDDP外，IDHc在其它三種耐藥細胞中均下調(P＜0.01，P＜0.05)。
九)Western blot檢測annexin A3的表達進一步對四種差異表達蛋白annexin A3、destrin、cofilin 1和GSTO1-1進行western blot驗證(未購到IDHc抗體)。結果可以看出，western blot結果(圖18)與雙向凝膠電泳(2-DE)結果完全一致。提示此五種蛋白質在耐藥性質的形成中起到一定的作用，并且在耐藥細胞中這些蛋白質的上調或下調可能發生在不同的水平(RNA水平或蛋白質水平或兼而有之)。
(三)結論在我們的研究中，四種耐藥細胞在培養過程中檢測耐藥指數均無明顯改變。因此我們的實驗對象是穩定的，增加實驗結果的可信度和可重復性，為研究鉑類耐藥機制建立了良好的細胞模型。在四種耐藥細胞的蛋白質表達譜中，每種耐藥細胞均有12～16種差異表達蛋白質，共計36種蛋白質，其中超過1/3的差異蛋白質屬于酶類。究其功能囊括了多個方面的代謝，如能量代謝、核苷酸代謝、氧化還原作用、細胞骨架相關蛋白、蛋白質脂肪代謝、信號轉導等等。在這些差異表達蛋白質中，我們發現了5種蛋白質在三個以上樣本中均有顯著變化，分別為annexin A3、destrin、IDHc、GSTO1-1和cofilin 1，其中以annexin A3變化最顯著(3～20倍)，提示此五種蛋白質在耐藥性質的形成中起到一定的作用，并且在耐藥細胞中這些蛋白質的上調或下調可能發生在不同的水平(RNA水平或蛋白質水平或兼而有之)。
實施例三候選耐藥相關蛋白annexin A3的功能鑒定Annexin A3進行了鉑類耐藥相關研究，由于annexin A3的定量PCR、westen blot結果均與2-DE結果一致，并且最具明顯的上調趨勢(3～20倍)，因此選擇annexin A3作為進行功能研究的耐藥相關候選蛋白。
(一)實驗方法一)質粒的構建1.構建含有annexin A3(anx 3)目的基因正反義序列的質粒(pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3)(1)引物設計根據Genbank中已知的人anx 3序列(gi4826642)設計mRNA翻譯區全長引物。Sense 5′-gaattcCATCATGGCATCTATCTGGGTT-3′，Antisense 5′-gaattcGTCATCTCCACCACAGA-3′，PCR擴增產物長度為984bp，斜體為酶切位點，在兩側均加入酶切位點EcoR I，合成T7引物TAATACGACTCACTATAGGG，引物由Invitrogen公司合成。
(2)提取總RNA和逆轉錄具體步驟見第一部分(3)PCR擴增以cDNA為模板，反應體積25μl，成分如下Pfu 10×Rxn buffer(美國Promega公司)2.5μl，10mM dNTP 2μl，去離子水19μl，anx3上下游引物(見引物設計部分)各0.5μl，pUC-anx3質粒0.3μl，Pfu DNA polymerase(Promega)0.2μl，放置入PCR儀，95℃變性1.5min后進入循環，95℃變性1min，50℃退火1分鐘，72℃延伸1.5min，35個循環后72℃延伸10min。
配制電泳液0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mo l/L EDTA；制備1.0％的含0.5ug/ml EB的瓊脂糖電泳膠，取25μl反應產物加入梳子孔，在120V電壓條件下電泳20分鐘，電泳后將凝膠放入JS-380自動凝膠圖像分析儀，照相。
(4)DNA凝膠回收按照天為時代科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行。
1)用一干凈刀片將單一的DNA條帶從瓊脂糖凝膠上切下，盡量切除多余凝膠，稱取其重量。
2)加3倍體積溶液PN。
3)50℃水浴10min，期間不斷翻轉離心管，至完全膠溶。
4)將上步所得溶液加入一個吸附柱中，13000轉離心60s，倒掉收集管中的廢液。
5)加入漂洗液800μl PW，13000轉，60s，棄掉廢液。
6)加入漂洗液500μl PW，13000轉，60s，棄掉廢液。
7)將離心吸附柱放回收集管，13000轉離心2min，盡量除去漂洗液。
8)取出吸附柱放入一個干凈的離心管中，在吸附膜中間位置加入20μl洗膜緩沖液EB，室溫放置2min，13000轉離心60s，將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，13000轉離心60s。
測量濃度取出1μl上述溶液至99μl的去離子水中，以100μl去離子水調零，使用紫外分光光度計測量260nm的OD值，按10D＝50μg/ml DNA計算。OD260/OD280的比值應在1.7-1.9之間。
(5)加尾反應按照Promega公司的pGEM-T載體所附方法說明書進行。反應體系25μlTaq 10×buffer 2.5μl，10mM dNTP 5μl，25mM Mgcl25μl，Taq DNA polymerase(TaKaRa)0.5μl，PCR產物12μl，放置入PCR儀，72℃反應30分鐘。
(6)溶液回收將反應溶液用DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa)回收。
1)向上述反應液中加入100μl DB Buffer，然后均勻混合。
2)將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
3)將上述操作1的溶液轉移至Spin Column中，12000轉離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
4)將500μl的Rinse A加入Spin Column中，12000轉離心30s，棄掉廢液。
5)將700μl的Rinse B加入Spin Column中，12000轉離心30s，棄掉廢液。
6)重復操作步驟5。
7)將Spin Column放入一個干凈1.5ml的離心管中，在SpinColumn膜中間位置加入20μl Elution Buffer，室溫放置1min，12000轉離心1分鐘洗脫DNA。
(7)與T載體連接反應反應體系10μl10×T4DNA Ligasebuffer 1μl，T4DNA Ligase(TaKaRa)1μl，去離子水2μl，已加A尾的PCR產物5μl，pGEM-T載體(Promega)1μl，混勻后置4℃過夜。
(8)大腸桿菌感受態細胞的制備1)將原菌液(-80℃儲存)取出100μl加至5ml LB細菌培養基中，37℃，200rpm/min振蕩培養過夜。
2)取50μl上步菌液轉接到一個含有5ml LB培養液離心管中，37℃，220rpm/min振蕩培養3小時。每隔20-30分鐘測量OD600值來監測培養物的生長情況，使活細胞數不應超過108/ml。
3)將培養物轉移至一個無菌的、用冰預冷的離心管中，冰上放置10分鐘。
4)4℃，4000rpm，離心10分鐘，棄凈上清。
5)用600μl預冷的0.1M的氯化鈣重懸細菌，置于冰浴30分。
6)4℃，4000rpm，離心10分鐘，棄凈上清。
7)每50ml初始培養物用2ml預冷的0.1M的氯化鈣重懸細菌，然后分裝成50μl一份，置4℃儲存12-24小時使用。也可置-80℃長期保存。
(9)轉化感受態細胞1)新鮮制備的200μl感受態細胞，置于冰上，完全解冰后輕輕地將細胞均勻懸浮。
2)加入10μl質粒DNA，輕輕混勻。
3)冰上放置30分鐘。
4)42℃水浴熱激90秒。
5)冰上放置2分鐘。
6)加150μl LB培養液，37℃100rpm/min振蕩培養45分鐘復蘇。
7)將150μl已轉化的感受態細胞轉移到含抗生素(Amp+)的瓊脂糖培養基上，在涂之前加上20μl x-gal(20mg/ml)和4μl異丙基-β-D半乳糖溶液(200mg/ml)。均勻涂布，將平板置于室溫直至液體被吸收。
8)將平皿倒置，37℃培養12-16小時。
平板37℃培養過夜后，可見數個藍白斑，挑取白斑加入到含有90μg/ml Amp的5ml LB中，200rpm/min，37℃過夜。
(10)質粒DNA的提取(具體步驟參見天為科技有限公司質粒DNA的提取試劑盒說明書)1)將過夜培養的3ml細菌，高速離心1分鐘(4℃，4000rpm，離心10min)，徹底去除上清。
2)加入200μl溶液P1，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。
3)加入200μl溶液P2，溫和上下顛倒6-8次使細菌裂解，室溫放置小于5分鐘至溶液變成澄清。
4)加入200μl溶液PIII，溫和上下顛倒6-8次，充分混勻，此時會出現白色沉淀，12000rpm，10分鐘，離心。
5)將上清轉入一個新的離心管中，加入200μl去內毒素樹脂液SW(用前需充分混勻，使樹脂懸浮)，室溫放置10min，期間混合上下翻轉離心管樹次。
6)將所得溶液與樹脂轉入過濾柱CS中，12000rpm離心2min，棄去過濾柱CS，收集離心后得到的溶液。
7)在上述溶液中加入700μl結合液PB，充分混勻后，分兩次加入吸附柱CB中，12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。8.加入300μl結合液PB，12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。
8)加入700μl漂洗液PW，(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。
9)重復上步操作2次，倒掉廢液。
10)12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。
11)取出吸附柱CB，放入一個干凈的離心管中，加100μl洗脫緩沖液EB，室溫放置1min，12000rpm離心1min，將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，12000rpm離心1min。
(12)Anx3重組T載體的酶切及PCR鑒定取菌液為模板行PCR，反應體系20μl2×Hot-start TaqMasterMix(天為時代科技有限公司)10μl，前述anx3上下游引物各0.5μl，去離子水8.5μl，菌液0.5μl，放置入PCR儀，95℃變性5min后進入循環，95℃變性1min，50℃退火1分鐘，72℃延伸1.5min，30個循環后72℃延伸10min。
挑選出來的陽性克隆經抽提質粒后，利用限制性內切酶EcoR I(TaKaRa)進行酶切鑒定，反應體系20μlEcoR I 1μl，10×H Buffer2μl，DNA10μl，滅菌水7μl。37℃水浴1.5h。
將酶切及PCR鑒定均陽性的克隆，進一步進行DNA測序(北京奧科生物科技有限公司)。
(13)真核表達載體的構建采用EcoR I酶切pcDNA3.1/myc-His(-)B質粒(Invitrogen)(圖19)，酶切體系30μlEcoR I 2μl，10×H Buffer 3μl，DNA24μl，滅菌水1μl，37℃水浴3.5h，以瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天為時代科技有限公司)回收產物。為防止自連，線性化載體進行去磷酸化反應，反應體系如下線形化載體15μl，10×小牛腸堿性磷酸酶buffer 2μl，小牛腸堿性磷酸酶(Promega)3μl，37℃作用30min。之后按DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa)回收純化去磷酸化的線性化載體。
采用EcoR I酶切Anx3重組T載體，酶切體系30μlEcoR I 2μl，10×H Buffer 3μl，DNA18μl，滅菌水7μl，37℃水浴1.5h，以瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天為時代科技有限公司)回收目的片段。
(14)連接反應反應體系10μl10×T4DNA Ligase buffer1μl，T4 DNA Ligase(TaKaRa)1μl，酶切去磷酸化的pcDNA3.1/myc-His(-)B質粒4μl，目的片段4μl，混勻后置16℃過夜。
(15)轉化感受態細胞10μl連接反應產物加入200μl感受態細胞中，步驟同前，平板(Amp+)，挑取菌落加入到含有90μg/ml Amp的5ml LB中，200rpm/min，37℃過夜。和重組質粒的酶切及PCR鑒定實驗步驟。
(16)Anx3重組真核表達載體載體的酶切及PCR鑒定取菌液為模板行PCR，反應體系20μl，分別加入T7、anx3下游引物混合物和T7、anx3上游引物(見引物設計部分)混合物來鑒定正向和反向連接，具體步驟同上。
挑選出來的正反向克隆經抽提質粒(提取質粒見前)后，利用限制性內切酶EcoR I進行酶切鑒定。
將酶切及PCR鑒定均陽性的克隆，進一步進行DNA測序。
構建pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3的主要流程見圖20。
2.構建含有annexin A3(anx 3)目的基因正義序列的質粒(pcDNA3.1-anx3)將pUC19-anx3質粒(法國Céline Raguenes-Nicol教授饋贈，I.C.G.M.，U332 I.N.S.E.R.M.，Paris，France)和pcDNA3.1(+)質粒(Invitrogen)(圖21)采用EcoR I單酶切。
20μl體系 10×K Buffer 2μlEcoR I 1μlpUC19-anx3或pcDNA3.1(+)質粒10μl去離子水補足至7μl作用3h，添加2μl 10×Loading Buffer(TaKaRa)終止反應。DNA凝膠回收產物，線性pcDNA3.1(+)質粒進行去磷酸化處理，溶液產物回收用于連接。
10μl體系 10×T4DNA Ligase buffer 1μlT4DNA Ligase(TaKaRa)1μl線性pEGFP-N1質粒4μl目的片段4μl混勻后置16℃過夜。連接產物進行轉化，挑選菌落，擴增，鑒定，具體實驗步驟同前。
構建pcDNA3.1-anx3的主要流程見圖22。
3.構建表達annexin A3融合蛋白的質粒(pEGFP-N1-anx3)將上步pcDB-sense anx3和pEGFP-N1載體質粒(美國Clontech公司)(圖23)采用雙酶切，分別為Xho I和BamH I(TaKaRa)。
20μl體系 10×K Buffer 2μlBamH I 1μlXho I 1μlpcDB-sense anx3 16μl
20μl體系 10×K Buffer 2μlBamH I 1μlXho I 1μlpEGFP-N1 10μl去離子水補足20μl作用3h，添加2μl 10×Loading Buffer終止反應。DNA凝膠回收產物用于連接。
10μl體系 10×T4DNA Ligase buffer 1μlT4DNA Ligase(TaKaRa)1μl線性pEGFP-N1質粒4μl目的片段4μl混勻后置16℃過夜。連接產物進行轉化，挑選菌落，擴增，鑒定，具體實驗步驟同前。
構建pEGFP-N1-anx3的主要流程見圖24。
二)細胞轉染1.提取質粒(Qiagen質粒提取試劑盒)(1)將5mL含Apm的LB液體培養基加入到兩支試管中，分別接入含正義和反義基因的質粒的大腸桿菌，37℃，200rpm/min振蕩培養過夜。將過夜培養的3ml細菌，4℃，4000rpm，離心10min，徹底去除上清。
(2)加入300μl Buffer P1，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌。
(3)加入300μl Buffer P2，溫和上下顛倒4-6次使細菌裂解，室溫放置小于5分至溶液變成澄清。
(4)加入300μl已預冷的Buffer P3，立即溫和上下顛倒4-6次，冰浴5min。
(5)再次混勻，4000rpm，離心10min。
(6)準備好QIAGEN-tip20，將1ml Buffer QBT加入柱子中，讓其因重力自然流過。
(7)將第五步的上清夜加入QIAGEN-tip20，自然流過。
(8)將1ml Buffer QC加入QIAGEN-tip20，共4次。
(9)用0.8ml的Buffer QF稀釋DNA，加入QF時，用一干凈的離心管接住QIAGEN-tip20的下口，收集流出液。
(10)將0.56ml異丙醇加入到上步離心管中，立即12000rpm，離心30分鐘。
(11)小心棄凈上清，加入1ml 70％乙醇，12000rpm，離心10分鐘，小心倒掉乙醇，室溫涼干5min。用20μl TE(pH 8.0)溶解沉淀。
2.轉染敏感和耐藥細胞(1)將對數生長期的細胞消化傳代后，以0.5×106/ml的密度接種于24孔板(500μL)，置于37℃、5％CO2孵箱內培養24小時后取出，確定細胞密度為90％～95％匯合。
(2)將0.8μg質粒加入到50μL Opti-MEMI Reduced Serum((Invitrogen))中，溫和混勻。
(3)在使用前輕輕混勻LipofactamineTM2000((Invitrogen))，然后在50μL Opti-MEMI Reduced Serum中加入LipofactamineTM20002.0μL，混勻后室溫孵育5min。
(4)上步液體孵育5min后，將其與已經稀釋的質粒混合，混勻后室溫孵育20min。
(5)細胞在轉染前換成無抗生素的培養基，然后加入上步100μL混合物，輕輕混勻。4-6h后換成常規培養基。
(6)分別在轉染后12、16、24、48、72h觀察熒光強度及細胞轉染情況，攝像，計算轉染效率。
3.篩選穩定表達目的基因的單細胞克隆細胞轉染步驟同前1-5步，轉染24～48h以1∶10的比例傳代至六孔板，24h后加入G418，終濃度為800μg/ml，混勻。含G418培養基篩選3周。
顯微鏡下利用紙片法挑取克隆(單個，孤立，約500-1000個細胞構成，細胞形態均一)，接種到24孔板內，培養基內一直采用G418維持濃度200μg/ml。
待細胞在24孔板內生長至對數生長期，0.25％胰酶消化細胞，接種至6孔板繼續以G418維持濃度200μg/ml培養。
待細胞在6孔板內生長至對數生長期，收集細胞，western blot進行鑒定(具體步驟見實驗第一部分)，挑取陽性克隆，凍存細胞。并留取適量細胞繼續培養，進行后續實驗。
4.穩定轉染后細胞的耐藥性的測定經western blot鑒定后，分別挑選annexin A3蛋白表達量最高和無annexin A3蛋白表達的細胞克隆各2～3個，常規細胞培養。收集對數生長期的細胞，進行IC50和RI的測定(具體步驟見實驗第一部分)。
(二)結果一)正反義質粒pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3的構建、篩選和鑒定1.總RNA完整性與純度鑒定RNA的提取產物在1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下28s、18s、5s三條RNA帶清晰可見(圖25)，由強變弱，表明RNA沒有降解。紫外分光光度儀測定OD值及最高吸收峰，OD260nm值為0.626，OD280nm為0.337，OD260nm/OD280nm值為1.8562，表明RNA純度較高。
2.RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果圖26所示，在DNA marker1000bp附近有一明亮條帶，與預期目的片段大小一致，為984bp目的片段。
3.T載體克隆(pGEM-T-anx3)鑒定取菌液為模板行PCR，可見在DNA marker 1000bp附近有一明亮條帶圖27，與預期目的片段大小一致。T載體克隆后挑選陽性菌落，利用限制性內切酶EcoR I進行酶切。重組T載體長約3kb，酶切后產生984bp目的片段及3kb載體片段。酶切鑒定電泳結果如圖27。進行測序后，序列與Genbank中已知的人anx 3序列完全相符，證實為anx3基因cDNA片段。
4.正反義anx3真核表達載體鑒定
pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3重組質粒轉化大腸桿菌后，篩選陽性菌，取菌液為模板行PCR，可見在DNA marker 1000bp處有一條清晰的擴增條帶圖29，與預期目的片段大小一致。菌落提取質粒DNA，EcoR I進行酶切鑒定，含插入片段的重組質粒長約6.5kb，酶切產生984bp目的片段及5.5kb載體片段，酶切結果見圖29，與理論計算完全一致。用通用引物雙向測序進一步驗證，序列拼接后與GenBank內anx 3基因cDNA比較，序列100％相符(圖30)。結果表明，anx 3基因cDNA片段分別以正向和反向插入pcDNA3.1/myc-His(-)B載體，成功構建正、反義真核表達載體pcDB-sense anx3和pcDB-antisenseanx3。下面是Annexin A3的核苷酸序列ATGGCATCTATCTGGGTTGGACACCGAGGAACAGTAAGAGATTATCCAGACTTTAGCCCATCAGTGGATGCTGAAGCTATTCAGAAAGCAATCAGAGGAATTGGAACTGATGAGAAAATGCTCATCAGCATTCTGACTGAGAGGTCAAATGCACAGCGGCAGCTGATTGTTAAGGAATATCAAGCAGCATATGGAAAGGAGCTGAAAGATGACTTGAAGGGTGATCTCTCTGGCCACTTTGAGCATCTCATGGTGGCCCTAGTGACTCCACCAGCAGTCTTTGATGCAAAGCAGCTAAAGAAATCCATGAAGGGCGCGGGAACAAACGAAGATGCCTTGATTGAAATCTTAACTACCAGGACAAGCAGGCAAATGAAGGATATCTCTCAAGCCTATTATACAGTATACAAGAAGAGTCTTGGAGATGACATTAGTTCCGAAACATCTGGTGACTTCCGGAAAGCTCTGTTGACTTTGGCAGATGGCAGAAGAGATGAAAGTCTGAAAGTGGATGAGCATCTGGCCAAACAAGATGCCCAGATTCTCTATAAAGCTGGTGAGAACAGATGGGGCACGGATGAAGACAAATTCACTGAGATCCTGTGTTTAAGGAGCTTTCCTCAATTAAAACTAACATTTGATGAATACAGAAATATCAGCCAAAAGGACATTGTGGACAGCATAAAAGGAGAATTATCTGGGCATTTTGAAGACTTACTGTTGGCCATAGTTAATTGTGTGAGGAACACGCCGGCCTTTTTAGCCGAAAGACTGCATCGAGCCTTGAAGGGTATTGGAACTGATGAGTTTACTCTGAACCGAATAATGGTGTCCAGATCAGAAATTGACCTTTTGGACATTCGAACAGAGTTCAAGAAGCATTATGGCTATTCCCTATATTCAGCAATTAAATCGGATACTTCTGGAGACTATGAAATCACACTCTTAAAAATCTGTGGTGGAGATGACTGA(SEQ ID NO1)其氨基酸序列見SEQ ID NO2
二)正義質粒pcDNA3.1-anx3的構建、篩選和鑒定將pUC19-anx3質粒和pcDNA3.1(+)質粒分別采用EcoR I單酶切。酶切后在1.3kb處出現條帶，與預期的1339bp長度相符。將此片段回收后與線性pcDNA3.1(+)質粒相連接，經PCR鑒定，條帶符合目的cDNA長度(圖31a)。酶切鑒定可見含插入片段的重組質粒長約6.7kb，EcoR I單酶切產生1339bp目的片段及5.4kb載體片段(圖31b)。用通用引物雙向測序進一步驗證，序列拼接后與GenBank內anx 3基因cDNA比較，序列100％相符(圖32)。結果表明，anx 3基因cDNA片段以正向插入pcDNA3.1(+)載體，成功構建正義真核表達載體pcDNA3.1-anx3。
三)pEGFP-N1-anx3的構建、篩選和鑒定將pcDB-sense anx3采用Xho I和BamH I雙酶切，在1kb處出現明亮條帶，為984bp的目的片段。與線性pEGFP-N1質粒連接后，約為5.7kb。PCR鑒定，可擴增出984bp的特異片段(圖33)。Xho I和BamH I雙酶切鑒定可見產生984bp目的片段及4.7kb載體片段(圖34)。用通用引物雙向測序進一步驗證，序列拼接后與GenBank內anx 3基因cDNA比較，序列100％正向相符(圖35)。結果表明成功構建正義真核表達質粒pEGFP-N1-anx3。
四)轉染效率本實驗通過脂質體介導質粒DNA的方法轉染各細胞系，分別在瞬時轉染后12、16、24、48、72h觀察熒光強度，發現在24h的時間點，熒光強度最強。在顯微鏡下計算轉染效率，SKOV3細胞系及其耐藥細胞亞系的轉染效率為20％-25％，而A2780細胞系及其耐藥細胞亞系的轉染效率為45％-55％，明顯高于SKOV3組(圖36)。
五)陽性克隆的篩選將正義annexin A3質粒轉染敏感細胞系SKOV3、A2780，反義annexin A3質粒轉染耐藥細胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP。同時均以相應的空質粒作為對照。G418篩選穩定克隆，以未經處理的正常細胞作為對照，在含800μg/ml G418培養基中培養約8-9天，正常細胞對照已全部死亡，繼續加壓至3w，單個細胞已增殖成為500-1000個細胞的克隆(圖37)，使用紙片法將陽性克隆依次挑至24、6孔板擴增，利用western blot鑒定目的克隆。如圖38所示，與未經任何轉染的正常細胞相比，轉染空質粒的細胞中annexin A3的表達未見差異。在轉染正義質粒的細胞中，annexinA3表達明顯上調，轉染反義質粒的細胞中已檢測不到annexin A3的表達。其中，挑選表達量最高和最低的細胞克隆作為后續實驗的對象。表10列出對所挑選陽性細胞克隆的命名。
六)穩定轉染后細胞的耐藥性的測定篩選鑒定陽性克隆后進行耐藥性的檢測。結果(表11)顯示，與轉染空質粒相比，敏感細胞系在轉染正義annexin A3質粒后耐藥指數上升約2.0～3.7倍，以SA4細胞為著，耐藥細胞系在轉染反義annexinA3質粒后耐藥指數下降約1.2～2.2倍。其中，大部分細胞在轉染后，無論是對順鉑還是卡鉑的耐藥性都發生了顯著變化。雖然SBm對CDDP和ADC6對CBP的耐藥指數僅僅下降了1.2～1.4倍，但經t檢驗分析存在統計學差異。提示annexin A3的表達與耐藥性成正相關，annexinA3高表達時，細胞耐藥性增加；annexin A3表達受到抑制時，細胞耐藥性減弱，說明annexin A3與上皮性卵巢癌對鉑類耐藥的形成密切相關。
(三)結論利用基因工程技術將正義annexin A3質粒轉染敏感細胞系SKOV3、A2780，反義annexin A3質粒轉染耐藥細胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP。G418篩選穩定克隆，利用western blot鑒定目的克隆，擴增后進行耐藥指數的檢測。結果顯示，與轉染空質粒相比，敏感細胞系在轉染正義annexin A3質粒后耐藥指數上升2～4倍，耐藥細胞系在轉染反義annexin A3質粒后耐藥指數下降2倍左右。結果說明annexin A3與上皮性卵巢癌對鉑類耐藥密切相關，可能涉及鉑類耐藥機制的形成。
實施例四耐藥相關蛋白annexin A3在上皮性卵巢癌組織中表達的研究(一)實驗方法一)卵巢癌標本收集分別收集卵巢癌鉑類為主化療敏感組和卵巢癌化療耐藥組病人的腫瘤組織標本。嚴格規范入選標準，匹配研究樣本。2002年11月至2005年1月期間，收集在中國醫學科學院中國協和醫科大學北京協和醫院婦產科行卵巢癌腫瘤細胞減滅術，術后病理證實為上皮性卵巢癌的患者標本42例。入組標準1.病理診斷的原發性卵巢上皮癌。
2.卵巢癌化療敏感組經過滿意的腫瘤細胞減滅術和規范化療后達到臨床完全緩解(CR)，持續時間＞6個月。
3.卵巢癌化療耐藥組經過滿意的腫瘤細胞減滅術和規范化療后達到完全緩解(CR)，持續時間＜6個月；化療期間腫瘤的最好療效為PR、SD或PD者。
共收集卵巢癌化療敏感組織標本21例和耐藥組織標本21例，石蠟包埋形式保存，由北京協和醫院病理科協助提供。相應患者的臨床資料見表12，13。
協和醫院病案室查閱化療敏感和耐藥共42例患者的病歷，按病理號找出全部的術中標本切片，經病理科大夫閱片后，挑選卵巢癌組織較大，無壞死及出血，以腫瘤實質為主的切片，并尋找相應的癌組織蠟塊用于免疫組化。
二)免疫組織化學染色1.將石蠟包埋腫瘤組織進行連續切片，厚度約4um。切下石蠟薄片后，順次經30％酒精，50℃水浸泡片刻，使其充分展開。轉移至載玻片上，75℃烤片45min。
2.順次二甲苯脫石蠟(15min×3)。系列濃度乙醇(100％，95％，80％)順次浸泡片刻，蒸餾水沖洗2遍，PBS浸泡15-30min。
3.事先對組織抗原進行各種方法的修復，選擇效果最好的抗原修復方法。經試驗后AnnexinA3采用微波修復。
4.3％過氧化氫封閉10min。
5.加入一抗，將切片放入濕盒中，室溫下孵育75min，PBS沖洗5min×3次。
6.全自動免疫組化染色儀加入二抗，將切片放入濕盒中，室溫下孵育45min，PBS洗5min×3次。
7.DAB顯色1-5min，光鏡控制。PBS，蒸餾水沖洗。
8.蘇木素復染蘇木蘇中浸泡1min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精消化片刻，淡氨水中浸泡1min，蒸餾水沖洗。
9.系列濃度乙醇(80％，95％，100％)順次浸泡片刻，二甲苯順次浸泡片刻(×2)。
10.中性樹脂膠封片。
三)閱片，判定標準及陰陽性對照所有切片均由病理科專科醫生在不知道任何臨床資料的情況下進行閱片。
判定標準以細胞漿棕色為染色陽性。根據著色腫瘤細胞占全部腫瘤細胞的百分比，＜5％為(-)，5～25％為(+)，25～50％為(++)，50％～75％為(+++)，＞75％為(++++)，隨機選取10個視野，平均值作為最終結果。
陽性對照annexinA3以肝細胞作為陽性對照，陽性部位為細胞漿。
陰性對照用免疫前的兔血清取代一抗。
四)統計學分析使用SPSS11.5軟件進行如下統計分析采用等級資料的秩和檢驗評價化療敏感及耐藥患者的annexin A3表達量是否存在顯著性差異。
(二)結果卵巢癌化療敏感組平均年齡50.29歲，化療耐藥組平均年齡55.29歲，兩組間年齡無統計學差異(P＝0.265)。兩組間卵巢癌期別無統計學差異(P＝0.141)。
Annexin A3主要在細胞漿表達，部分表達在細胞核，見圖39。采用等級資料的秩和檢驗比較化療敏感組和耐藥組患者的統計結果表明，U值＝139，P值＝0.035＜0.05，說明化療敏感者與耐藥者的annexinA3表達量之間存在顯著性差異，化療耐藥者的annexin A3表達量高于敏感者，見表14，15。臨床結果說明annexin A3與上皮性卵巢癌對鉑類耐藥的形成密切相關。
(三)結論通過對21例化療敏感患者與21例耐藥患者的卵巢癌組織免疫組化染色研究，結果顯示，兩組的annexin A3表達存在顯著性差異(P＝0.035)，提示annexin A3是一種鉑類耐藥相關蛋白，有望成為預測鉑類耐藥和卵巢癌預后的標記物，并且可能成為逆轉臨床耐藥的新靶標。
表1.RT-PCR引物、產物長度、退火溫度

表2.SKOV3及耐藥細胞的細胞周期分布*P＜0.05，**P＜0.01，與SKOV3相比較

表3.實時定量PCR的引物序列、片段長度和退火溫度

表4.六種細胞系的IC50和RI值，“-”IC50值未測

表5.SKOV3/CDDP與SKOV3細胞的差異表達蛋白質

表6.SKOV3/CBP與SKOV3細胞的差異表達蛋白質

表7.A2780/CDDP與A2780細胞的差異表達蛋白質

表8.A2780/CBP與A2780細胞的差異表達蛋白質

表9.MALDI-TOF-MS鑒定的三種以上耐藥細胞共有的差異表達蛋白質

表10.對western blot鑒定后挑選的目的克隆的命名

表11.穩定轉染后目的克隆耐藥性的檢測

表12.21例卵巢癌化療敏感患者臨床資料

表13.21例卵巢癌化療耐藥患者臨床資料

表14.42例卵巢癌化療敏感及耐藥組織標本的染色結果

表15.Annexin A3在卵巢癌化療敏感及耐藥組織中的表達結果比較

序列表<110>中國醫學科學院北京協和醫院<120>Annexin A3與癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的相關性<130>IDC060070<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>972<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(972)<400>1atg gca tct atc tgg gtt gga cac cga gga aca gta aga gat tat cca 48Met Ala Ser Ile Trp Val Gly His Arg Gly Thr Val Arg Asp Tyr Pro1510 15gac ttt agc cca tca gtg gat gct gaa gct att cag aaa gca atc aga 96Asp Phe Ser Pro Ser Val Asp Ala Glu Ala Ile Gln Lys Ala Ile Arg20 25 30gga att gga act gat gag aaa atg ctc atc agc att ctg act gag agg144Gly Ile Gly Thr Asp Glu Lys Met Leu Ile Ser Ile Leu Thr Glu Arg35 40 45tca aat gca cag cgg cag ctg att gtt aag gaa tat caa gca gca tat192Ser Asn Ala Gln Arg Gln Leu Ile Val Lys Glu Tyr Gln Ala Ala Tyr50 55 60gga aag gag ctg aaa gat gac ttg aag ggt gat ctc tct ggc cac ttt240Gly Lys Glu Leu Lys Asp Asp Leu Lys Gly Asp Leu Ser Gly His Phe65 70 75 80gag cat ctc atg gtg gcc cta gtg act cca cca gca gtc ttt gat gca288Glu His Leu Met Val Ala Leu Val Thr Pro Pro Ala Val Phe Asp Ala85 90 95aag cag cta aag aaa tcc atg aag ggc gcg gga aca aac gaa gat gcc336Lys Gln Leu Lys Lys Ser Met Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Asp Ala100 105 110ttg att gaa atc tta act acc agg aca agc agg caa atg aag gat atc384
Leu Ile Glu Ile Leu Thr Thr Arg Thr Ser Arg Gln Met Lys Asp Ile115 120 125tct caa gcc tat tat aca gta tac aag aag agt ctt gga gat gac att432Ser Gln Ala Tyr Tyr Thr Val Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asp Asp Ile130 135 140agt tcc gaa aca tct ggt gac ttc cgg aaa gct ctg ttg act ttg gca480Ser Ser Glu Thr Ser Gly Asp Phe Arg Lys Ala Leu Leu Thr Leu Ala145 150 155 160gat ggc aga aga gat gaa agt ctg aaa gtg gat gag cat ctg gcc aaa528Asp Gly Arg Arg Asp Glu Ser Leu Lys Val Asp Glu His Leu Ala Lys165 170 175caa gat gcc cag att ctc tat aaa gct ggt gag aac aga tgg ggc acg576Gln Asp Ala Gln Ile Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Asn Arg Trp Gly Thr180 185 190gat gaa gac aaa ttc act gag atc ctg tgt tta agg agc ttt cct caa624Asp Glu Asp Lys Phe Thr Glu Ile Leu Cys Leu Arg Ser Phe Pro Gln195 200 205tta aaa cta aca ttt gat gaa tac aga aat atc agc caa aag gac att672Leu Lys Leu Thr Phe Asp Glu Tyr Arg Asn Ile Ser Gln Lys Asp Ile210 215 220gtg gac agc ata aaa gga gaa tta tct ggg cat ttt gaa gac tta ctg720Val Asp Ser Ile Lys Gly Glu Leu Ser Gly His Phe Glu Asp Leu Leu225 230 235 240ttg gcc ata gtt aat tgt gtg agg aac acg ccg gcc ttt tta gcc gaa768Leu Ala Ile Val Asn Cys Val Arg Asn Thr Pro Ala Phe Leu Ala Glu245 250 255aga ctg cat cga gcc ttg aag ggt att gga act gat gag ttt act ctg816Arg Leu His Arg Ala Leu Lys Gly Ile Gly Thr Asp Glu Phe Thr Leu260 265 270aac cga ata atg gtg tcc aga tca gaa att gac ctt ttg gac att cga864Asn Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Leu Asp Ile Arg275 280 285aca gag ttc aag aag cat tat ggc tat tcc cta tat tca gca att aaa912Thr Glu Phe Lys Lys His Tyr Gly Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ile Lys290 295 300tcg gat act tct gga gac tat gaa atc aca ctc tta aaa atc tgt ggt960Ser Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Lys Ile Cys Gly305 310 315 320gga gat gac tga972
Gly Asp Asp<210>2<211>323<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Ser Ile Trp Val Gly His Arg Gly Thr Val Arg Asp Tyr Pro1510 15Asp Phe Ser Pro Ser Val Asp Ala Glu Ala Ile Gln Lys Ala Ile Arg20 25 30Gly Ile Gly Thr Asp Glu Lys Met Leu Ile Ser Ile Leu Thr Glu Arg35 40 45Ser Asn Ala Gln Arg Gln Leu Ile Val Lys Glu Tyr Gln Ala Ala Tyr50 55 60Gly Lys Glu Leu Lys Asp Asp Leu Lys Gly Asp Leu Ser Gly His Phe65 70 75 80Glu His Leu Met Val Ala Leu Val Thr Pro Pro Ala Val Phe Asp Ala85 90 95Lys Gln Leu Lys Lys Ser Met Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Asp Ala100 105 110Leu Ile Glu Ile Leu Thr Thr Arg Thr Ser Arg Gln Met Lys Asp Ile115 120 125Ser Gln Ala Tyr Tyr Thr Val Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asp Asp Ile130 135 140Ser Ser Glu Thr Ser Gly Asp Phe Arg Lys Ala Leu Leu Thr Leu Ala145 150 155 160Asp Gly Arg Arg Asp Glu Ser Leu Lys Val Asp Glu His Leu Ala Lys
165 170 175Gln Asp Ala Gln Ile Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Asn Arg Trp Gly Thr180 185 190Asp Glu Asp Lys Phe Thr Glu Ile Leu Cys Leu Arg Ser Phe Pro Gln195 200 205Leu Lys Leu Thr Phe Asp Glu Tyr Arg Asn Ile Ser Gln Lys Asp Ile210 215 220Val Asp Ser Ile Lys Gly Glu Leu Ser Gly His Phe Glu Asp Leu Leu225 230 235 240Leu Ala Ile Val Asn Cys Val Arg Asn Thr Pro Ala Phe Leu Ala Glu245 250 255Arg Leu His Arg Ala Leu Lys Gly Ile Gly Thr Asp Glu Phe Thr Leu260 265 270Asn Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Leu Asp Ile Arg275 280 285Thr Glu Phe Lys Lys His Tyr Gly Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ile Lys290 295 300Ser Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Lys Ile Cys Gly305 310 315 320Gly Asp Asp<210>3<211>21<212>DNA<213>引物<400>3tgaagggtat tggaactgat g21
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<210>10<211>21<212>DNA<213>引物<400>10tgccatccac agtttcagtt t21<210>11<211>21<212>DNA<213>引物<400>11agagcaaagc ttgataacaa t21<210>12<211>21<212>DNA<213>引物<400>12gaaaaatgta aacctgtaga c21<210>13<211>21<212>DNA<213>引物<400>13aaactacctt caactccatc a21<210>14<211>21<212>DNA<213>引物<400>14aactaagtca tagtccgcct a2權利要求
1.調節癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的方法，包括改變癌癥細胞中annexin A3的表達，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑。
2.權利要求1的方法，其用于體外調節癌細胞的耐藥性或者用于體內調節癌癥患者的耐藥性。
3.權利要求1的方法，通過提高癌細胞中的annexin A3表達而提高癌細胞對鉑類化療藥物的耐受性，優選地，通過在癌細胞中表達annexin A3基因而提高細胞中的annexin A3表達，再優選地其中通過使用表達正義annexin A3基因的質粒來提高所述細胞中的annexinA3的含量。
4.能夠提高癌細胞中的annexin A3表達的藥劑在制備提高癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的藥物中的用途，其中優選地所述藥劑選自編碼annexin A3蛋白的多核苷酸、包含編碼annexin A3蛋白的多核苷酸的DNA構建體或表達載體，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑。。
5.權利要求1的方法，通過減少和/或抑制癌細胞中的annexin A3表達而降低癌癥對鉑類化療藥物的耐受性，優選地，通過在癌細胞中表達annexin A3的反義核酸和/或特異于annexin A3的核酶而減少和/或抑制細胞中的annexin A3表達，再優選地其中通過使用表達反義annexin A3的DNA構建體或表達載體來降低細胞中的annexin A3的含量。
6.抑制annexin A3表達的反義核苷酸。
7.權利要求6的反義核苷酸，其包含能夠特異結合annexin A3多核苷酸序列或其互補序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，優選地所述反義核苷酸含有與annexin A3多核苷酸的一或多個部分互補、更優選地基本上互補、甚至更優選地完全互補的序列區域，更優選地，所述反義核苷酸包含與全長annexin A3多核苷酸完全互補的DNA序列，優選地，所述反義核苷酸是DNA或者RNA或者其衍生物，最優選地，所述反義核苷酸包含在能夠表達其的表達質粒，優選真核表達質粒中.
8.特異切割annexin A3mRNA的核酶。
9.權利要求8的核酶，其具有與一或多個annexin A3 RNA區域互補的特異底物結合位點，并且它在該底物結合位點中或周圍具有賦予該分子RNA切割活性的核苷酸序列，優選地所述核酶選自錘頭型核酶、發夾型核酶、丁型肝炎病毒型核酶、I型內含子型核酶或RNasePRNA型核酶或鏈孢霉屬VS RNA型核酶。
10.能夠減少和/或抑制癌細胞中的annexin A3表達的藥劑在制備降低癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的藥物中的用途，其中所述藥劑優選選自權利要求6或7的反義核苷酸和權利要求8或9的核酶，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑。
11.通過權利要求1的方法改變了對鉑類化療藥物的耐受性的癌癥細胞，優選地，所述細胞包含表達正義annexin A3或反義annexinA3的表達載體，優選地，所述載體是質粒，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑。
12.一種篩選能夠改變癌癥對鉑類化療藥物的耐藥性的藥劑的方法，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑，所述方法包括步驟提供候選藥劑；使所述候選藥劑與癌細胞接觸；檢測所述癌細胞中的annexin A3的表達；將所檢測到的表達量與預定閾值比較。
13.通過權利要求12的篩選方法獲得的藥劑。
14.一種檢測癌細胞對鉑類化療藥物的耐藥性的方法，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑，所述方法包括檢測癌細胞中的annexin A3的表達量，和將所得表達量與預定閾值進行比較，由此指示卵巢癌細胞對鉑類化療藥物的耐藥性。
15.一種預測或預后鉑類化療藥物在癌癥患者中的治療效果的方法，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑，所述方法包括檢測癌癥患者的腫瘤組織中的annexin A3的表達量，和將所得的量與預定閾值進行比較，由此預測或預后向所述患者施用鉑類化療藥物的治療效果，即，預測患者的鉑類化療藥物耐藥性。
16.權利要求12、14或15的方法，其中用于檢測annexin A3表達量的步驟通過檢測annexin A3的mRNA水平或蛋白質水平來實施；其中，優選地，在蛋白質水平上的檢測，通過抗體或寡核苷酸適配體來實現，優選利用抗體；而在mRNA水平上的檢測，優選通過Northern印跡或PCR方法來實現。
17.特異結合annexin A3的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體，優選其是中和抗體。
18.特異結合annexin A3蛋白質的寡核苷酸適配體，優選地所述寡核苷酸適配體是DNA，優選地，所述寡核苷酸適配體連接或標記了其它功能基團或分子，例如巰基、氨基、放射性同位素、熒光素、生物素、或酶等。
19.能夠檢測annexin A3表達的藥劑在制備用于檢測癌細胞的鉑類化療藥物耐藥性或診斷癌癥患者的鉑類化療藥物耐藥性的檢測或診斷試劑盒中的用途，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑，其中優選地，所述藥劑選自權利要求17的抗體或其片段、權利要求18的寡核苷酸適配體、特異于annexin A3基因的核酸探針和引物，或其組合，更優選地，所述藥劑為annexin A3蛋白質的抗體，優選單克隆抗體。
20.治療癌癥患者的方法，包括步驟a)通過本發明改變癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的方法，降低患者對鉑類化療藥物的耐受性；和b)向所述患者施用鉑類化療藥物，任選地，在步驟(a)之前檢測癌癥患者的鉑類化療藥物耐受性以確定耐藥性患者，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑。
21.治療癌癥患者的方法，所述方法包括根據本發明確定患者的鉑類化療藥物耐藥性，和調整患者的鉑類化療藥物給藥方案，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑。
22.組合物，其包含權利要求4、10、13或19所述的藥劑，優選地，所述組合物用于診斷和/或改變癌癥的鉑類化療藥物耐藥性，其中所述癌癥優選是卵巢癌，更優選上皮樣卵巢癌，所述鉑類化療藥物優選是順鉑或卡鉑。
23.權利要求22的組合物，其中所述藥劑優選選自權利要求6或7的反義核苷酸、權利要求8或9的核酶、權利要求17的抗體、權利要求18的寡核苷酸適配體中的一個或任何組合。
24.一種建立鉑類化療藥物耐藥性癌癥細胞株的方法，包括以大劑量鉑類化療藥物沖擊來誘導癌癥細胞。
25.前述的發明，其中所述癌癥是能夠用鉑類化療藥物治療的癌癥，例如，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睪丸腫瘤、頭頸癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等，優選卵巢癌，更優選人漿液性卵巢癌和上皮樣卵巢癌，包括內膜樣癌、漿乳癌、腺癌、移行細胞癌、子宮內膜癌、透明細胞癌。
26.前述的發明，其中所述鉑類化療藥物是順鉑、卡鉑、草酸鉑、奈達鉑、樂鉑等，優選是順鉑和卡鉑。
全文摘要
本發明涉及annexin A3與癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的相關性，涉及通過改變細胞中的annexin A3表達而提高/降低癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的方法、還涉及用于檢測和/或預后癌癥對鉑類化療藥物的耐藥性的檢測或診斷方法，以及可以用于這些方法中的藥劑、包含該藥劑的藥物組合物和所述藥劑用于制備藥物的用途及所述藥劑的篩選方法。此外，本發明還涉及用于治療癌癥患者的方法。在本發明中，所述癌癥是能夠用鉑類化療藥物治療的癌癥，更優選所述癌癥是卵巢癌。
文檔編號A61P35/00GK1915433SQ20061012683
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月6日 優先權日2006年9月6日
發明者潘凌亞, 閆雪冬 申請人:中國醫學科學院北京協和醫院