一種酰胺類化合物的新用途的制作方法

專利名稱：一種酰胺類化合物的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及化合物的醫藥用途，更涉及如式I的化合物在預防和/或治療肝損傷和/或肝衰竭中的應用。
背景技術：
肝臟是人體內最大的器官，具有消化與代謝、解毒、對代謝產物再利用以及維持個 體內穩定的重要功能，其代謝活動十分復雜。它不但在物質代謝的生物合成與降解功能上 發揮著重要作用，還是營養物質的貯存庫。任何破壞肝臟內環境穩定的過程都可能造成 肝細胞損傷，從而影響肝臟正常的生理功能。各種致病因素包括物理的、化學的和生物性 的，作用于肝組織，都會引起損傷與抗損傷反應。肝損傷主要表現為肝細胞變性、壞死和凋 亡。肝損傷通常由感染、損傷、暴露在毒性化合物中、酒精、食物不潔，或血液正常物質的不 正常積累、或機體自身免疫、或遺傳缺陷(如血色病)所導致的，而有時引起肝損傷的具體 原因是不得而知的。目前，病毒所造成的肝損傷是傳播最為廣泛并最難控制的一種，已知 的有A型、B型、C型、D型、E型和G-型肝炎病毒，病毒性肝炎的種類還在不斷增加。有 時，正常情況下無毒性的物質被濫用時也會有肝毒性，如服用過量的乙酰胺基酚(APAP)和 酒精。由于長期酒精的攝入導致的酒精性肝損傷是另一主要的病因。免疫性肝損傷很少 發生但很難控制。膽汁淤積也會造成肝損傷，如原發性膽汁性肝硬化(PBC)是肝內膽管進 行性破壞并以慢性膽汁淤積為主要特征的肝損傷。近期還發現基因治療也可導致肝損傷。 如，以肝細胞小葉中心壞死為特征的肝細胞損傷是肝病毒策略的基因治療的主要副反應。 大量研究表明，肝細胞的過度凋亡是上述多種肝病的病因之一。此外，肝細胞的凋亡還會 導致肝纖維化和其它肝病。預防肝細胞的過度凋亡在預防和治療肝損傷時是十分重要的 (Guicciardi et al. Gut, 2005 :54，1024-1033 和 Ghavami et al.，Med. Sci. Monit.，2005 11(11) :RA337-345)。肝衰竭(Liver Failure,LF)是多種因素引起的嚴重肝損傷，導致其合成、解毒、排 泄和生物轉化等功能發生嚴重障礙或失代償，出現以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水 等為主要表現的一組臨床癥候群。肝衰竭的具體病因尚不完全清楚，在歐美國家藥物是誘導肝衰竭的重要因素，如 對乙酰氨基酚、甲基多巴、硫異煙胼、吡嗪酰胺，麻醉劑氟烷，非類固醇類抗炎藥等。在美國， 乙酰氨基酚中毒引發肝衰竭的比例在逐年上升。病毒性肝炎在亞洲，尤其在我國是引起肝 衰竭的主要原因。在發展中國家，戊型肝炎則是引起的肝衰竭的一個重要病因。另外，外科 疾病肝巨大或彌漫性惡性腫瘤，尤其合并肝硬變時，易并發肝衰竭。嚴重肝外傷，大范圍肝 被手術切除或者有肝血供的損害如血管損傷、肝血流阻斷時間過長等，治療門靜脈高壓癥 的門體靜脈分流，膽道長時間阻塞，肝膽管結石反復炎癥導致肝損害，Budd-Chiari綜合癥、 Wilson病、皰疹病毒感染、其他膿毒癥、肝豆狀核變性、妊娠期急性脂肪肝等也可引起肝衰 竭。自身免疫性肝炎常會在2-3周內病情迅速進展為肝衰竭，但臨床上往往無特殊表現。肝 毒性物質如四氯化碳、黃磷等，誤食毒菌也可造成肝衰竭。
肝衰竭是一組臨床綜合癥，其臨床特點是突然出現明顯的肝細胞損害，肝功能 迅速惡化，并導致精神異常，伴肝性腦病以及凝血功能障礙，預后極差，病死率可高達 50%-90%。我國每年因重癥肝功能衰竭導致死亡的人數為30萬-50萬。尤其是乙型肝炎 肝衰竭患者生存率僅有26%。在發展中國家，戊型肝炎則是引起的肝衰竭中妊娠婦女的病 死率極高。對于肝細胞無法大量再生的患者，肝移植是目前唯一的有效治療措施。但美國 最大樣本的調查研究表明，只有29%的急性肝衰竭患者進行了移植手術，約1/4的患者列 入了等待肝移植的名單，在列入肝移植名單的患者中，10%在等待肝源期間死亡。其它研究 報告也表明，等待肝源時死亡的患者高達40%。2006年，我國制定了第一部《肝衰竭診療指南》，將我國肝衰竭分為急性肝衰竭 (Acute Liver Failure, ALF)、亞急性肝衰竭(Subacute Liver Failure, SALF)、慢加急性 (亞急性)肝衰竭(Acuter-on-Chronic Liver Failure, ACLF)和慢性肝衰竭(Chronic Liver Failure,CLF)0而在此之前，有關肝衰竭(重型肝炎)的分型診斷一直無統一標準， 其原因有多種，如病因多樣、是否將肝性腦病列為肝衰竭必備條件、對過去肝病史的認識不 一、命名角度的不一等。從命名角度上，歐美國家較看重肝臟功能，故稱肝衰竭；而我國和日 本較看重炎癥本質，故稱重型(癥)肝炎(Sever Hepatitis) 0日本還根據有無肝性腦病分 別稱為劇癥肝炎(Fulminant Hepatitis)和重癥肝炎。我國重型肝炎中的急性重型肝炎、 亞急性重型肝炎及慢性重型肝炎分別與國外急性肝衰竭、亞急性肝衰竭及慢加急性肝衰竭 相似。急性肝衰竭的特征是起病急，發病2周內出現以II度以上肝性腦病為特征的肝衰竭 癥候群；慢加急性(亞急性)肝衰竭是在慢性肝病基礎上出現的急性肝功能失代償。我國 肝衰竭患者多發生于慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，在此基礎上由于勞累、飲酒、感染、病 毒復制等誘因，肝臟發生大塊或亞大塊壞死，此種肝衰竭類型稱為慢加急性肝衰竭；慢性肝 衰竭是在肝硬化基礎上，肝功能進行性減退導致的以腹水或門靜脈高壓、凝血功能障礙和 肝性腦病等為主要表現的慢性肝功能失代償。肝功能嚴重受損患者由于對內毒素滅活功能降低，幾乎都存在內毒素血癥，而內 毒素血癥又可加重肝損傷，促發多種并發癥的發生，此為肝功能衰竭的“二次打擊”學說。 內毒素或稱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是存在于所有革蘭氏陰性細菌外膜中的 糖脂。在高濃度時則能夠導致炎癥反應的發生，而成為肝臟的致病因素，稱為內毒素血癥。 在各種急慢性肝損傷患者中均存在不同程度的內毒素血癥，如急性肝炎為26% -50%，急 性重癥肝炎為59% -100%，慢性活動性肝炎為20-50%，肝硬化為15% -92%，肝性腦病為 93% -100%，肝衰竭則為100%。一般認為肝衰竭時內毒素主要來源于腸道菌群。當某些疾病導致腸道菌群失調或 移位時，產生的有毒物質也一起被腸道吸收，從門靜脈進入血液循環形成腸源性內毒素血 癥。其結果為加重肝損害和使部分患者促發肝功衰竭及肝外并發癥的發生。其發病機制主 要包括以下因素①LPS對肝細胞有直接毒性作用。肝細胞接觸LPS或類脂A后，類脂A被 轉運至線粒體內膜與特異性受體結合，抑制ATP合成酶及還原煙酰胺嘌呤二核苷酸(NADH) 脫氫酶，使能量生成受阻，并因呼吸鏈電子傳遞干擾，氧分子接受電子不足，產生氧自由基 損害生物膜，導致肝細胞壞死；②LPS可損傷肝竇血管內皮，促進肝內微血栓形成。LPS激活 中性粒細胞和巨噬細胞，后者 通過粘附蛋白破壞血管內皮細胞，許多細胞因子和炎性介質 作用于肝竇內皮細胞及微血管，激活凝血系統，引致微血栓形成。③LPS可致肝細胞損害，使肝細胞體積增大，縮小肝內血管間隙。LPS刺激血液成份或組織細胞釋放縮血管物質，導 致門脈壓增高。LPS所致肝竇內血栓形成及肝竇內皮細胞的去窗孔化均可直接升高肝內血 管阻力，導致門脈壓升高。④LPS激活單核巨噬細胞系統介導的細胞毒性作用。單核巨噬 細胞系統包括單核細胞和枯否細胞被LPS激活后，可表達、分泌各種細胞因子和炎性遞質， 并作用于肝臟和其它組織器官的生物膜，導致肝臟及其它器官損傷，乃至出現多器官衰竭。 在肝病方面尚可引起肝內膽汁瘀積、高黃疸，促進腹水及(或)肝性腦病的出現及加重。D-Gal為一種特異性損害肝臟的藥物，能耗竭肝細胞內三磷酸尿嘧啶核苷，抑制RNA合成；促使肥大細胞脫顆粒釋放組胺，造成結腸水腫，使腸源性內毒素吸收增加，增強 動物對LPS的敏感性及肝臟損傷特異性。D-Gal/LPS誘導的肝衰竭模型，被認為是肝衰竭的 良好模型。本發明采用此方法復制的肝衰竭模型，動物死亡率高，肝功能指標及病理表現均 符合肝衰竭中肝臟大塊壞死性病變特點。對于肝衰竭，至今尚無特效的治療方法，處理上大多是根據臨床表現的嚴重程度 和進展情況，選擇采用支持療法(每日靜脈補給一定量的葡萄糖、肌苷、維生素Ki和大劑量 維生素C并酌情使用降黃、降酶的藥物)、對癥治療(主要控制并發癥)、促進肝細胞再生和 保護肝細胞的藥物如促肝細胞生長素等。盡管采取多種措施，成年患者能存活者仍很少，兒 童患者預后略好一些。現已證實，大劑量使用糖皮質激素、換血、前列腺素治療都無效。目前 肝移植是治療肝衰竭最有效的方法。國內近年來也在積極開展肝移植，但肝移植在我國廣 泛用于肝衰竭患者治療的條件尚不成熟，除經濟基礎較差外，供肝嚴重不足也是瓶頸之一。過去認為其肝細胞大量死亡是壞死，主要與機體免疫功能紊亂介導損傷有關。現 認為除肝細胞壞死這一死亡形成外，肝細胞凋亡在肝衰竭(重型肝炎)過程中起著重要 作用。肝細胞死亡有兩種形式一凋亡和壞死，其中肝衰竭引起的細胞凋亡與線粒體損 傷程度密切相關。臨床研究也表明，肝衰竭(重型肝炎)患者中內毒素及腫瘤壞死因子 α (TNF-α)水平明顯升高。近年來的研究認為肝衰竭(重型肝炎)與肝細胞凋亡關系密 切，動物模型試驗數據顯示，在肝衰竭(重型肝炎)早期肝細胞以凋亡為主，之后則以壞死 為主，直至最終因肝功能衰竭死亡。肝細胞凋亡存在于整個病程中，而壞死則在病程后期出 現，凋亡的肝細胞也可能引起肝細胞壞死。因此，抑制肝細胞的凋亡，則可抑制由于肝細胞 凋亡導致的肝損傷和肝衰竭。Caspase即半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶，是經典的細胞凋亡分子，目前，人類 Caspase家族至少包括14個成員。根據Caspase家族成員之間大小亞單位的同源性，可分 為 3 組，包括炎癥組=Caspase-U _4、_5、-12、-13 和-14 ；凋亡起始組Caspase_2、_8、~9 和-10 ；凋亡效應組Caspase-3、_6和_7。Caspase能夠通過破壞或激活細胞內一些關鍵 性的酶，引起DNA斷裂，破壞細胞骨架而引起細胞凋亡，通過Caspase聯級信號途徑在細胞 凋亡的啟動、發展、終止等過程中起著決定性的作用。目前基于caspase的肽底物結構制備了許多強caspase抑制劑。然而，與其體外 的強效作用相反，目前尚未有對凋亡的完整細胞模型具有良好功效(IC5tl < ImM)的報道。 值得注意的是，之前有研究認為，某些帶有FMK^luoromethylketone)基團的caspase酶抑 制劑在動物體內產生較強的毒性，其FMK部分可能與化合物在動物體內產生的毒性反應有關。本領域迫切需要提供一種對于肝細胞凋亡有抑制作用而且具有低毒性的化合物。

發明內容
本發明提供了一種式I化合物的新用途。在本發明中，提供了一種如式I所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物前 體的用途， 所述的化合物用于制備肝細胞凋亡抑制劑。在另一優選例中，所述的抑制劑是肝細胞中Caspase的抑制劑。在另一優選例中，所述的抑制劑用于肝細胞凋亡引起的肝損傷。在另一優選例中，所述的肝損傷是肝衰竭。在另一優選例中，所述的抑制劑是肝損傷治療劑。在另一優選例中，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、亞急性肝衰竭治療劑、慢加 急性肝衰竭治療劑、和/或慢性肝衰竭治療劑。在另一優選例中，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、和/或慢加急性肝衰竭治 療劑。在另一優選例中，所述的抑制劑用于預防和/或治療肝損傷和/或肝衰竭。在另一優選例中，所述的肝細胞是人肝細胞。在另一優選例中，所述的抑制劑選自片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口 服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、或栓劑。據此，本發明提供了 一種對于肝細胞凋亡有抑制作用而且具有低毒性的化合物。


圖1顯示了式I化合物對TNF- α誘導的L02細胞凋亡的保護作用。圖2顯示了式I化合物對TNF-α誘導的L02細胞內源PARP蛋白切割的抑制作用。圖3顯示了式I化合物對TNF- α誘導的L02細胞內源caspase 3/7活性的抑制 作用。圖4顯示了式I化合物體外對caspase 3活性的抑制作用。圖5顯示了正常小鼠肝組織形態。圖6顯示了實施例7中模型組小鼠肝組織病理變化情況。圖7顯示了實施例7中藥物組小鼠肝組織病理變化情況。
具體實施例方式發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現如式I的化合物可以有效地保護肝細胞凋亡，特別對肝細胞中的Caspase活性具有良好的抑制作用。 如本文所用，“肝衰竭”和“重型肝炎”可以互換使用，都是指由多種因素引起的嚴 重肝損傷，導致其合成、解毒和生物轉化等功能發生嚴重障礙，出現以黃疸、凝血功能障礙、 肝性腦病和腹水等為主要表現的一種臨床癥候群。在本發明中，所述肝損傷，包括但不限于由炎癥、毒性損害、肝血流改變、肝臟感 染(如病毒、細菌、真菌、寄生蟲)、先天性代謝障礙引起物質在肝臟貯積、化學物質和藥物、 肝內循環紊亂(如慢性心衰、Budd-chiari綜合癥、靜脈閉塞疾病、門靜脈栓塞)或膽汁流 動阻塞等任何破壞肝臟內環境穩定的過程所引發的肝細胞損傷，其中包括肝衰竭。在本發明中，所述的重型肝炎，包括但不限于，急性、慢加急性(亞急性)、慢性重 型肝炎。在本發明中，所述的肝衰竭，包括但不限于，急性肝衰竭(ALF)、亞急性肝衰竭、慢 加急性肝衰竭/亞急性(ACLF)、慢性肝衰竭。爆發性肝衰竭(FHF)、急性黃疸型肝炎、肝炎 引起的腦損傷也屬于肝衰竭。以及藥物誘導的肝衰竭，如對乙酰氨基酚、利福平、乙醇、甲基 多巴、硫異煙胼、吡嗪酰胺，麻醉劑氟烷，非類固醇類抗炎藥、化療藥物、抗代謝藥等；病毒性 肝炎引起的肝衰竭，如甲型、乙型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎；其他病毒引起的肝衰竭，如 巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腸道病毒等；細菌及寄生蟲等病原體感染嚴重或持續感 染(如敗血癥、血吸蟲病等)；外科疾病肝巨大或彌漫性惡性腫瘤，尤其合并肝硬變時，并發 的肝衰竭；嚴重肝外傷，大范圍肝被手術切除或者有肝血供的損害如血管損傷、肝血流阻斷 時間過長等造成的肝衰竭；治療門靜脈高壓癥的門體靜脈分流，膽道長時間阻塞，肝膽管結 石反復炎癥導致的肝損害；Budd-Chiari綜合癥、Wilson病、皰疹病毒感染、其他膿毒癥、肝 豆狀核變性、妊娠期急性脂肪肝等導致的肝衰竭。缺血、缺氧性肝損傷，包括休克、充血性心 力衰竭等引起的肝衰竭，自身免疫性肝炎導致的肝衰竭。肝毒性物質如四氯化碳、黃磷、毒 菌等導致的肝衰竭等。本文中使用的“有效劑量”指達到希望療效的藥物的最小劑量。因此，本文中使用 的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物的有效劑量指能夠達到希望的式I化合 物血藥濃度的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物的量。式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物可以用于抑制肝細胞凋亡，尤其 適用于抑制人肝細胞凋亡。進一步地，發明人發現式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其 前體藥物對于肝細胞內源Caspase具有抑制作用；較佳地，可抑制Caspase 3/7。本發明的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物的治療有效劑量是能 有效地保護肝衰竭的劑量，一般的，治療以小劑量開始，以便不斷增加劑量直到此條件下的 最適。在給藥前，式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物可與磷酸鹽緩沖液或為本領域的熟練人員所熟知的任何其他適合的溶液混合。式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物可如需求的那樣以固體(冷凍干燥)或液體制劑形式給藥。施用本發明的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物的方法視具體情 況而定。通常，施用本發明的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物可通過以下 途徑完成口腔內、鼻腔內、腹膜內、腸胃外、靜脈內、淋巴管內、腫瘤內、肌肉內、間質內、動 脈內、皮下、眼內、滑膜腔內、經上皮、經皮施用。在本發明的另一方面，提供一種抑制劑(或稱藥物組合物)，它含有式I化合 物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物和藥學上可接受的載體；以抑制劑的總重量計， 其中的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物的含量為0.01-99. 9wt%，優選 50_99wt%。如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各 種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施 用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形 劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另 夕卜，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如崩解劑、潤濕劑、乳化劑、PH緩沖物質等。來自 于式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物之外的非必要成分，以及其他非必要成 分(例如其他輔助性藥物)，也包括在藥學上可接受的載體的定義中。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的抑制劑可以被制成針劑形式，例如用生 理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的 藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條 件下制造。式I化合物或其藥學上可接受的鹽或其前體藥物在治療疾病時常用的每日劑量 為約 0. OOOl-IOOOmg,優選 0. 01_500mg，更優選 0. l_200mg。使用藥物組合物時，是將安全有效量的式I化合物或其藥學上可接受的鹽或 其前體藥物施用于哺乳動物，其中該安全劑量通常每日劑量為約0. OOOl-lOOOmg，優選 0. 01-500mg,更優選0. l-200mg。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素， 這些都是熟練醫師技能范圍之內的。在預防和治療肝損傷和肝衰竭時，式I化合物可以與以下物質聯用抗炎藥物如 布洛芬(Ibuprofen)及其它非固醇類抗炎藥物，抗病毒藥物如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替 卡韋、干擾素，抗內毒素藥物或單抗、IL-I受體拮抗劑(IL-Ira)、TNF_a及其受體拮抗劑， 抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸，蛋白酶抑制劑如西維來司納(Slivelestat Sodium)，免疫調 節劑身上皮質激素、胸腺肽α 1，磷酸二酯酶抑制劑如己酮可可堿(Pentoxifylline)，護肝 藥腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽等。促肝細胞生長素或前列腺素El脂質體等促進肝細胞生長藥 物。腸道微生態調節劑、乳果糖或拉克替醇，改善微循環藥物等。式I化合物還可與治療肝 纖維化的藥物聯用，如水飛薊素、吡非尼酮、秋水仙堿。此外還可與含丹參、黃芪、鱉甲等單 味或復方中藥聯合使用。本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
本發明的主要優點在于1、首次發現式I化合物對于肝細胞凋亡的保護作用；2、首次發現式I化合物可以施用于肝衰竭(重型肝炎)病人；3、本發明提供的caspase抑制劑也含有FMK基團，發明人在動物體內進行了一系列毒性實驗，結果表明其具有低毒性。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按
重量計。本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶質的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。以下實施例中的式I化合物由下述方法制備得到1. 3-硝基丙酸叔丁酯(1)的制備向冷卻的450ml 二氯甲烷(DCM)中通入異丁烯681. 94g，得到溶液(I)；向3-硝 基丙酸300g中加入二氯甲烷1700ml和2-甲基-2-丙醇33. 76g，冷至-10°C，加入硫酸 109. 18g，得到溶液(II)。混合溶液(I)與溶液(II)，分離和萃取有機相和水相，合并有機 層，干燥，濃縮得化合物(1) 375g，油狀物，收率為85%。 2. 5-氟-4-羥基-3-硝基戊酸叔丁酯(2)的制備向1. 5L 二氯甲烷中加入乙二酰氯 254. 18g JnADMSO 344. 55g，2_ 氟乙醇 91. 84g 和三乙胺828. Sg。將化合物(1)200. Og的二氯甲烷溶液加入反應混合物中，干燥，濃縮， 得到深琥珀色油狀物。粗提油狀物用硅膠純化，得到白色結晶化合物(2)70.42g，收率為 26%。3. 3-氨基-5-氟-4-羥基戊酸叔丁酯(3)的制備在反應釜中投入化合物(2)80. Og,甲醇1. 6L，Raney Ni 32. 0g。反應混合物經硅 藻土(Celite plug)過濾，濃縮，得到化合物(3) 70. 0g，粗提物直接用于下步反應，收率為 100%。4. 3- (2-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酰胺基)_5_氟4_羥基戊酸叔丁酯(4)的制 備向無水四氫呋喃溶液中加入化合物(4) 70. 0g, cbz-L-纈氨酸85. 7g，1_羥基-苯 丙-三唑水合物(HOBT) 57. 16g，4- 二甲氨基吡啶(DMAP) 45. 40g和1_ (3- 二甲氨基甲 基)3_乙基碳二甲胺鹽酸鹽(EDCI) 71. 22g，反應10分鐘。過濾，真空濃縮，分離有機層，得 到化合物(4)的粗提物148. 8g，直接用于下步反應，淺棕色粘性液體，收率為100%。5. 3- (2-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酰胺基)_5_氟_4_氧代戊酸叔丁酯(5)的制 備將氯鉻酸吡啶鹽(PCC) 674. Ig加入化合物(5)450. Og的無水二氯甲烷溶液中，室 溫反應1小時。反應混合物經硅膠柱層析法純化，洗脫，真空干燥，得到白色結晶固體化合物(5)296g，收率為66%。6.式I化合物的制備 將三氟乙酸(TFA) 390. 85g加入化合物(5)295. Og的二氯甲烷溶液中，室溫反應18 小時。真空濃縮去除二氯甲烷，洗滌，真空下干燥兩次，得到結晶的式I化合物，合并產物為 192. 02g，收率為 76%。實施例1式I化合物對TNF- α誘導的L02細胞凋亡有保護作用L02細胞(人肝細胞)按4Ε3-5Ε3個/孔接種至96孔板，培養24小時。式I化合 物分別稀釋為0 μ Μ，0. 5 μ Μ，5 μ Μ，50 μ Μ。誘導凋亡前L02細胞與式I化合物預孵育2小 時，對照組為只含有DMS0(0. 2% )，不含有肝細胞和式I化合物。然后分別加入25ng/ml TNF- α和2 μ g/ml放線菌素，培養18-24小時，加入MTT 10 μ 1/孔，孵育4小時后，去除培養基，每孔加入DMSO 100 μ 1，在492nm處讀值。見圖1。結果表明，式I化合物可明顯抑制由TNF-α誘導的L02細胞凋亡，說明式I化合 物對細胞凋亡有保護作用。實施例2式I化合物對TNF- α誘導的L02細胞內源PARP蛋白切割有抑制作用聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)是一種依賴Zn2+的真核DNA結合蛋白， 可特異性地識別DNA斷裂末端并結合，是一種重要的DNA修復酶。在細胞凋亡發生的早期， PARP是caspase家族(如caspase 3和7)的作用底物，后者可使PARP的DNA修復功能喪 失。Caspase可將113kD的PARP水解為89kD和24kD的兩個片斷。本實施例主要是運用抗 PARP抗體，用蛋白印跡法(western blotting)檢測PARP 89kD的裂解片斷以及113kD完整 的PARP蛋白，以作為細胞凋亡早期的標志物。L02細胞按4E3-5E3個/孔接種至96孔板，培養24小時。式I化合物分別稀釋為 0 μ M，0. 5 μ M，5 μ M，50 μ M。誘導凋亡前L02細胞與式I化合物預孵育2小時，對照組為只 含有DMSO(0. 2% )，不含有肝細胞和式I化合物。然后分別加入25ng/ml TNF- α和2 μ g/ml放線菌素，培養18-24小時，收細胞制 備蛋白樣品，Westem-blot檢測凋亡蛋白PARP(購自BD Pharmingen#556494)表達情況。見 圖2。 結果表明，式I化合物可明顯抑制由TNF- α激活的內源PARP的蛋白剪切，說明式 I化合物能夠抑制caspase的活性。實施例3式I化合物對L02細胞中TNF- α激活的內源Caspase 3/7的活性有抑制作用L02細胞按4E3-5E3個/孔接種至96孔板，培養24小時。式I化合物從40 μ M開 始對半稀釋至0. 15 μ Μ。每孔加入等體積式I化合物預孵育2小時，終體積為100 μ 1。對 照組為只含有DMS0(0. 2% )，不含有肝細胞和式I化合物。然后分別加入25ng/ml TNF-alpha和2 μ g/ml放線菌素，培養6小時，每孔加入 100 μ 1 caspase Glo 3/7試劑盒(購自promega#G8091)室溫反應1小時后，熒光分光光度 計檢測Iuciferase讀值，并計算IC50。見圖3。結果表明，式I化合物可明顯抑制由TNF- α激活的內源Caspse 3/7的活性，細胞水平的上式I化合物的IC50為5. 7nM。實施例4式I化合物體外caspase 3活性檢測 在96孔板中每孔加入含有caspase 3蛋白5ng，Ac-DEVD-AMC 1 μ Μ，溶于100 μ 1 酶反應緩沖液(IOmM HEPES, IOOmM NaCl, 10% sucrose, ImM EDTA，0. 1% CHAPS, IOmM DTT)。 式I化合物用0. 5% DMSO溶液從1 X 10_5稀釋至5X IiT11M共12個點，加入到含上述物質的 96板中。孵育1小時，用熒光分光光度計在激發波長355nm，發射波長460nm讀值，并計算 IC50。見圖 4。結果表明，式I化合物可明顯抑制caspase 3的酶活，對caspase 3 IC50為 220nM。實施例5式I化合物對撲熱息痛引起小鼠肝損傷的保護作用撲熱息痛(Acetaminophen，APAP)可引起小鼠藥物性肝損傷，在這個模型中，小鼠 注射APAP可引起肝臟細胞的凋亡。式I化合物對APAP引起小鼠藥物性肝損傷具有保護作用。用雄性ICR小鼠，18-22克(由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，進行 實驗，APAP購自Sigma公司。式I化合物以pH8. 50. 05M Tris-HCl溶解后，再以0. IN HCl 調pH至7. 2，稀釋濃度為10mg/ml。將動物隨機分為5組，分別為正常對照組、APAP模型組、式I化合物三個給藥組。 式I化合物給藥組動物在給予APAP前1小時以及給毒后30分鐘口服式I化合物50mg/kg， 正常對照組和APAP模型組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，其余各組動物腹腔注射 APAP,劑量為400mg/kg，體積為20ml/kg，禁食過夜。給予APAP 16小時后將動物斷頭處死， 取血，測定血清中ALT、AST含量(紫外可見分光光度計，UV-754型)。結果表明，式I化合物在很低濃度時即能對APAP引起的肝損傷具有明顯的保護作 用。正常動物腹腔注射APAP后，血清ALT、AST明顯升高，與正常對照組比較有顯著性差異。 小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低APAP引起的小鼠血清ALT、AST水平，與模型組比 較有顯著性差異，結果見表1。表1式I化合物對APAP引起小鼠肝損傷的保護作用 與模型組比較:**P< 0. 01 :***P < 0. 001實施例6式I化合物對Con-A誘導的肝損傷的保護作用
已知Con-A可引起小鼠免疫性肝損傷，式I化合物對Con-A引起小鼠免疫性肝損傷具有保護作用。雄性ICR小鼠，體重18-22克(由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)， Con-A購自Sigma公司。式I化合物，白色粉狀，以0. 05M Tris-HCl (ρΗ8· 5)溶解后，以0. IN HCl調ρΗ至7. 2，藥物濃度為10mg/ml。將動物隨機分為5組，分別為正常對照組、Con-A模型組和式I化合物給藥組三個 組。式I化合物給藥組動物在給予Con-A前7、1小時以及給予Con-A后30分鐘口服式I 化合物50mg/kg，正常對照組和Con-A模型組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組靜 脈注射Con-A，劑量為27mg/kg，體積為20ml/kg，禁食過夜。給予Con-A 16小時后將動物斷 頭處死，取血，測定血清中ALT、AST水平(紫外可見分光光度計，UV-754型)。小鼠口服式I化合物50mg/kg對Con-A誘發小鼠免疫性肝損傷有明顯的保護作 用。正常動物靜脈注射Con-A后，血清ALT、AST明顯升高，與正常對照組比較有顯著性差異； 小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低Con-A引起的小鼠血清ALT、AST水平，與模型組 比較有顯著性差異。結果見表2。表2式I化合物對Con-A引起小鼠肝損傷的保護作用 與模型組比較廣P <0.001實施例7式I化合物對D-Galn/LPS誘導的肝衰竭的保護作用一次性大劑量注射D-Galn/LPS可引起小鼠肝衰竭，是本領域比較成熟的動物肝 衰竭模型，可模擬肝細胞凋亡的過程。實驗選用雄性ICR小鼠，體重22-28克(由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提 供)，D-Galn購自上海生工生物工程技術有限公司，LPS購自美國Sigma公司，式I化合物， 白色粉狀，溶于50mM Tris堿溶解后，藥物濃度為50mg/ml。AST, ALT試劑盒購自南京建成 試劑公司。將動物隨機分為3組，分別為正常對照組、D-Galn/LPS模型組和式I化合物給藥 組。式I化合物給藥組動物在給毒后5分鐘給予一次性灌胃式I化合物50mg/kg，正常對照 組和LPS模型組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組腹腔注射D-Galn (800mg/kg)和 LPS(15ug/kg)，末次給藥6小時后將動物眼眶取血，取肝臟。在肝臟同一葉的固定位置切取 肝組織，石蠟包埋，切片并進行HE染色，光學顯微鏡200倍下觀察各組織病理變化情況。離 心分離血清，測定血清中ALT、AST水平(紫外可見分光光度計，UV-754型)。數據均采用SPSS 12. O軟件包進行統計分析。組間比較方差分析LSD檢驗。等級資料組間比較采用ridit分析。結果見表3。表3式I化合物對D-Galn/LPS引起小鼠肝衰竭的保護作用 與對照組比較，Δ Δ :P < 0. 01 ；與模型組比較，“=P < 0. 01小鼠口服式I化合物(50mg/kg)對D-Galn/LPS誘發小鼠免疫性肝損傷有明顯的 保護作用。正常動物靜脈注射D-Galn/LPS后，血清ALT、AST明顯升高，與正常對照組比較 有顯著性差異；小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低D-Galn/LPS引起的小鼠血清ALT、 AST水平，與模型組比較有顯著性差異。病理學檢查可見，正常小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞形態完整(見圖5)。模型組小 鼠肝組織出現彌漫性的大片壞死，細胞核溶解，肝索解離，肝竇網狀支架非完全塌陷。小葉 結構模糊不清，小葉內及匯管區可見大量散在的或灶性炎細胞浸潤(見圖6)。藥物組(式 I化合物組)小鼠壞死灶較模型組明顯減少，炎細胞浸潤的范圍及數量也明顯減輕(見圖 7)。該模型病理表現均符合肝衰竭診療指南中關于肝衰竭的特征。實施例8式I化合物能提高D-Galn/LPS致肝衰竭小鼠的存活率一次性大劑量注射D-Galn/LPS可引起小鼠肝衰竭，是本領域比較成熟的動物肝 衰竭模型，可模擬肝細胞凋亡的過程。實驗選用25只雄性ICR小鼠，體重20_25克(由上海斯萊克實驗動物有限責任公 司提供)，D-Galn購自上海生工生物工程技術有限公司，LPS購自美國Sigma公司，式I化 合物，白色粉狀，溶于50mM Tris堿溶解后，藥物濃度為50mg/ml。AST，ALT試劑盒購自南京 建成試劑公司。將動物隨機分為3組，分別為正常對照組(5只)、D-Galn/LPS模型組(10只)和 式I化合物給藥組(10只)。式I化合物給藥組動物在給毒后5分鐘給予一次性灌胃式I 化合物50mg/kg，正常對照組和LPS模型組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組腹腔 注射D-Galn (800mg/kg)和LPS (15ug/kg)，分別于末次給藥6小時、12小時、24小時、48小 時觀察各組小鼠死亡情況。結果表明，小鼠口服式I化合物對D-Galn/LPS誘導的小鼠肝衰竭有保護作用，并 大大提高了動物的存活率。模型組在觀察時間點的死亡率分別為10%、40%、60%、80%。 而給藥組僅在12小時觀察到死亡2只，死亡率僅為20%。與模型組比較具有明顯差異。實施例9式I化合物對D-Galn/LPS誘導的肝衰竭的預防作用實驗選用雄性ICR小鼠，體重20-25克(由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供)，D-Galn購自上海生工生物工程技術有限公司，LPS購自美國Sigma公司，式I化合物， 白色粉狀，溶于50mM Tris堿溶解后，藥物濃度為50mg/ml。AST, ALT試劑盒購自南京建成 試劑公司。將動物隨機分為3組，分別為正常對照組、D-Galn/LPS模型組和式I化合物預防給藥組。式I化合物給藥組動物在造模前1小時給予一次性灌胃式I化合物50mg/kg，正常對 照組和LPS模型組給予同體積賦形劑。除正常對照組外，各組腹腔注射D-Galn (800mg/kg) 和LPS(15ug/kg)，造模6小時后動物眼眶取血，測定血清中ALT、AST水平(紫外可見分光 光度計，UV-754型)。小鼠口服式I化合物(50mg/kg)對D-Galn/LPS誘發小鼠肝衰竭有明顯的預防作 用。模型組靜脈注射D-Galn/LPS后，與正常組血清ALT (22. 99 士9. 39)、AST (44. 46 士4. 29) 相比顯著升高(P < 0. 01)，分別為207. 27士25. 12，115. 88士24. 37。給藥組ALT，AST分別 為150. 56士24. 14，80.43士 11. 13，與模型組比較有顯著性差異(P < 0.01)。結果表明，提 前給予小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低D-Galn/LPS引起的小鼠血清ALT、AST水 平，與模型組比較有顯著性差異。實施例10式I化合物對慢加急性大鼠肝衰竭模型的保護作用本發明建立了免疫誘導型肝硬化大鼠與D-氨基半乳糖/內毒素聯合急性攻擊，該 模型與人慢加急性肝衰竭(ACLF)形態學表現非常相似。此模型形成穩定，容易復制，再現 了臨床上ACLF患者的全身系統性炎癥反應，病理生理環節與人ACLF有共同之處，可用于臨 床藥物研究。實驗選用雌性Wistar清潔級大鼠30只，體重120-150克(由上海斯萊克實驗動 物有限責任公司提供)，20%人血清白蛋白(HSA) ,D-Galn均購自上海生工生物工程技術有 限公司，LPS購自美國Sigma公司。參照王寶恩(中華醫學雜志，1989,9 :503_505)等的方法復制大鼠肝硬化模型。除 留取5只大鼠為正常對照組外，其余大鼠HSA致敏后，予以尾靜脈注射HSA 2. 5_4mg，每周2 次。6周后挑取成模大鼠20只，隨機分為模型組10只和模型給藥組10只。給藥組動物在 給予D-Galn/LPS后5分鐘給予一次性灌胃式I化合物50mg/kg。除正常對照組外，各組腹 腔注射D-Galn (400mg/kg)和LPS (100ug/kg)，于給藥后8小時將動物眼眶取血，測定血清中 ALT、AST水平(紫外可見分光光度計，UV-754型)。大鼠口服式I化合物(50mg/kg)對大鼠慢加急性肝衰竭有明顯保護作用。模型 組靜脈注射D-Galn/LPS后，與正常組血清ALT (65. 3士24. 89)、AST (87. 8士 18. 22)相比較 有顯著升高(P <0.01)，分別為484. 9士61. 05，883. 6士221. 57。給藥組ALT，AST分別為 233. 8士43. 46，392. 8士41. 66，與模型組比較有統計學差異(P < 0.01)。結果表明，小鼠口 服式I化合物50mg/kg可明顯降低慢加急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST水平，與模型組比較 有顯著性差異。實施例11灌胃給予式I化合物對小鼠的急性毒性試驗根據化學藥物急性毒性試驗技術指導原則(HGPT1_1 2005，3)，進行小鼠的急性 毒性試驗，觀察灌胃給予式I化合物對小鼠的急性毒性。實驗選用KM小鼠(由復旦大學實驗動物中心提供)，實驗前在恒溫室(20士3°C)飼養適應，選出生長正常的健康動物，雌雄 各10只，6-8周齡，體重18-22g。式I化合物用Tris-HCL緩沖液配成濃度60mg/ml溶液， 健康小鼠20只，雌雄各10只，按最大可注射容量50ml/kg(體重)灌胃給藥。觀察動物給 藥后的毒性反應及死亡情況。毒性反應重點觀察癥狀、程度，毒性反應起始時間、持續時間 及恢復時間等，觀察期14天。急性毒性試驗結果表明式I化合物具有低毒性，死亡動物經尸檢肉眼未見明顯病 理改變。結果表明灌胃給予式I化合物對小鼠的LD50 > 3000mg/kg。實施例12靜脈注射式I化合物對小鼠的急性毒性試驗根據化學藥物急性毒性試驗技術指導原則(HGPT1_1 2005，3)，進行小鼠的急 性毒性試驗，觀察式I化合物靜脈注射對小鼠的急性毒性。實驗選擇KM小鼠，由復旦大學實驗動物中心提供提供，實驗前在恒溫室 (20士3°C)飼養適應，選出生長正常的健康動物，雌雄各25只，6-8周齡，體重18-22g。健 康小鼠50只，雌雄分別按體重隨機分成5組，每組10只，雌雄各半，按20ml/kg (體重)的 容量iv給藥，各組小鼠的給藥劑量分別為1020、714、500、350、245mg/kg。(相應給藥濃度 分別為 51. 0,35. 7,25. 0,17. 5 和 12. 3mg/ml)。用 Bliss 法計算 LD50 及其 95%可信限。觀 察動物給藥后的毒性反應及死亡情況。毒性反應重點觀察癥狀、程度，毒性反應起始時間、 持續時間及恢復時間等。觀察期14天。急性毒性試驗結果表明式I化合物具有低毒性，死亡動物經尸檢肉眼未見明顯病 理改變。結果表明靜脈注射式I化合物對小鼠的LD50為> 600mg/kg。以上所述僅為本發 明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術內容范 圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術 實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將 被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
權利要求
一種如式I所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物前體的用途，其特征在于，所述的化合物用于制備肝細胞凋亡抑制劑。F2009100479636C0000011.tif
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是肝細胞中Caspase的抑制劑。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑用于肝細胞凋亡引起的肝損傷。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的肝損傷是肝衰竭。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是肝損傷治療劑。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、亞急性 肝衰竭治療劑、慢加急性肝衰竭治療劑、和/或慢性肝衰竭治療劑。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、和/或 慢加急性肝衰竭治療劑。
8.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑用于預防和/或治療肝損傷和 /或肝衰竭。
9.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝細胞是人肝細胞。
10.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑選自片劑、膠囊、散劑、顆粒 劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、或栓劑。
全文摘要
本發明公開了一種酰胺類化合物的新用途。所述的酰胺類化合物是如式I所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物前體，所述的化合物用于制備肝細胞凋亡抑制劑。
文檔編號A61P1/16GK101836973SQ20091004796
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月20日 優先權日2009年3月20日
發明者吳駿, 張慧, 束放, 羅楹, 顧翠萍 申請人:上海睿星基因技術有限公司