一種吳茱萸總生物堿新的醫藥用途的制作方法

專利名稱：一種吳茱萸總生物堿新的醫藥用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種提取的植物中草藥中活性成分的藥物用途，具體地說是一種吳茱萸總生物堿新的醫藥用途。
背景技術：
吳茱萸系蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、疏毛吳茱萸Evodiarutarecarpa(Juss.)Benth.vat.bodinieri(Dode)Huang、石虎Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalia(Dode)Huang的干燥近成熟果實。味辛、苦，性熱，有小毒。歸肝、脾、胃、腎經。具有溫肝暖胃、散寒止痛、降逆、燥濕等功效。分布于安徽、浙江、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、云南、貴州等省區。
目前，從吳茱萸果實中已經分離出100余種化合物，包括生物堿、苦味素、揮發油、氨基酸等。(1)生物堿為吳茱萸主要的活性成分，根據結構可分為吲哚喹啉類生物堿和喹諾酮類生物堿，前者主要有吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸因堿、羥基吳茱萸堿、二氫吳茱萸次堿、去甲吳茱萸酰胺、14-甲酰二氫吳茱萸次堿等；后者有吳茱萸卡品堿、二氫吳茱萸卡品堿、1-甲基-2-十五烷基-4-喹諾酮等，吳茱萸總生物堿具有重要的藥用價值，有些已在臨床得到廣泛的應用。(2)苦味素類主要包括吳茱萸苦素、吳茱萸內酯醇、黃柏酮、檸檬苦素、吳茱萸苦素乙酸酯、格羅苦素甲等，苦味素類化合物能減少胃酸分泌、改善局部血液循環等功能。(3)揮發油類通過氣相色譜從吳茱萸中分離出月桂烯、檸檬烯、石竹烯、別香橙烯等。(4)氨基酸天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等18種氨基酸。此外，吳茱萸中還含有少量的黃酮類化合物、甾體類、脂肪酸及微量元素。
吳茱萸具有多種藥理學活性，具有較高的藥用價值和應用前景。資料顯示吳茱萸生物堿能增強晶體停博液對離體豚鼠心臟的保護作用，并具有強效降壓和舒張血管效應；吳茱萸提取物、吳茱萸堿、吳茱萸內酯對家兔有很好的鎮痛作用；吳茱萸煎劑及水浸劑對霍亂弧菌、絮狀表皮癬菌及致病皮膚真菌等具有抑制作用；吳茱萸次堿有抗血小板活性、抑制血栓素的形成、抑制激動劑引起的血小板聚集時細胞內鈣的運動；吳茱萸水提物對大鼠離體子宮由5-羥色胺引起的收縮有拮抗作用，其興奮子宮成分為去氫吳茱萸堿、吳茱萸次堿及蕓香胺；吳茱萸堿還具有支氣管收縮作用；此外實驗還顯示吳茱萸生物堿對多種腫瘤細胞具有顯著的細胞毒活性。
肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理學基礎，表現為肝臟內纖維結締組織異常增生，同時也是肝硬化的早期及向肝硬化轉變的必經階段。病因學上認為肝纖維化的發生和發展是許多不同因素作用的結果，其中包括化學品和藥物(如乙醇、氨甲蝶呤、砷化物異煙肼、羥苯吲哚、甲基多巴、聚氯乙烯和二氧化釷等)，肝臟的各種感染(如病毒、細菌、螺旋體及寄生蟲感染)等均可誘導肝內外源性及內源性物質的非正常沉積。我國現有各類型肝病患者已達2億人之多，而肝炎、脂肪肝、酒精肝等在內的大部分肝病都可能導致肝纖維化的發生，不僅給無數患者和家庭帶來了巨大的痛苦，也對社會造成沉重的經濟負擔。
近年來，隨著對肝纖維化發生機制的認識不斷深入特別是對細胞外基質的合成與降解的調控有了更多的了解。人們逐漸認識到由于肝纖維化的發生機理非常復雜，很難用單一作用靶點的藥物來達到抑制肝纖維化的目的。目前，臨床上使用的抗肝纖維化化學藥物及生物制劑主要有以下幾類 1、抑制肝臟炎癥主要有秋水仙堿、干擾素、糖皮質激素、拉米夫定、馬洛替酯、PGE、IL-10、特異性受體拮抗藥(如IL-受體拮抗藥、可溶性TNF-α受體)等。
2、抑制肝星狀細胞活化與增殖肝星狀細胞活化是肝纖維化發生的重要因素，激活的肝星狀細胞具有增殖、纖維生成、致炎和收縮等功能，因此，抑制該種細胞的活化與增殖就成為抑制肝纖維化的重要策略。目前，水飛薊賓、磷脂酰膽堿、維生素E和S-腺苷蛋氨酸等，在動物實驗中均顯示出對肝星狀細胞的活化及膠原合成有抑制作用。
3、抗纖維化細胞因子白細胞介素10能促進胸腺細胞和B細胞增殖，在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化實驗中，白細胞介素10能阻斷炎癥反應，促進膠原的溶解，使得肝纖維化發生逆轉。肝細胞生長因子能刺激肝細胞DNA合成，促進肝細胞增殖，減少肝細胞的壞死與損傷，減輕炎癥刺激，抑制甚至逆轉肝纖維化的發展。
4、誘導肝星狀細胞凋亡資料顯示曲霉菌素和膠毒霉素能不同程度的誘導肝星狀細胞凋亡，減少膠原的合成，從而起到阻斷或延緩肝纖維化的作用。
5、促進細胞外基質降解研究較為成熟的有不飽和卵磷脂和松弛素，體外實驗證實其不飽和卵磷脂能抑制肝星形細胞轉變為纖維母細胞，從而抑制細胞外基質分泌，促使已經形成的膠原分解。松弛素在體內外實驗中均可促使膠原合成減少，細胞外基質降解增加。
盡管研究人員對肝纖維化的形成機制進行了深入的研究，但到目前為止，臨床上還缺乏療效確切、副反應小、毒性低的抗肝纖維化西藥。由于化學藥物及生物制劑在抗肝纖維化治療中的種種不足，近幾十年來國內外研究人員也致力于抗肝纖維化的中醫藥研究。傳統中藥的有效部位、單味制劑及復方成分復雜，對肝纖維化能進行多方位、多靶點治療，較其他藥物顯示出明顯的優勢。

發明內容
本發明旨在提供一種抗肝纖維化的藥物，所要解決的技術問題是自植物中草藥中遴選療效確切、毒性低、副反應小的活性成分。
齊賀彬等基于傳統中醫理論，認為肝纖維化的主要病因是濕熱疫毒入侵和正氣不足；肝血瘀阻是其病理基礎，該病屬本虛標實之證，病位在肝，表現為濕、熱、毒、瘀、虛。申請人結合長期的中草藥基礎研究，利用吳茱萸所具有的溫肝、散寒、止痛、降逆、燥濕等屬性，對防治肝纖維化進行了深入的研究，結果發現吳茱萸有很好的預防和治療作用，具有良好的臨床應用前景。
本發明所稱的吳茱萸總生物堿新的醫藥用途就是吳茱萸總生物堿在制備抗肝纖維化藥物中的應用。
所述的吳茱萸總生物堿是自吳茱萸中提取、分離得到的吲哚喹啉類和喹諾酮類等生物堿的總稱，以生物堿計，總生物堿含量20～60％。
所述的吳茱萸總生物堿的提取、分離如下 取吳茱萸生藥，酸性乙醇回流提取，提取液合并，回收部分乙醇后調整pH值上樹脂柱，水洗后收集40-95％乙醇洗脫部分，回收乙醇，減壓濃縮，干燥后得到的提取物即是吳茱萸總生物堿。其主要成分總生物堿含量以生物堿計20～60％。
總生物堿可加入藥學上允許的相應輔料，制成片劑、膠囊、緩釋片、滴丸、沖劑、微粒劑，并進一步純化制成針劑。
根據動物實驗的結果，吳茱萸總生物堿臨床推薦劑量300～1200mg/天，口服，一日三次。
本發明有以下的優點和效果 1、本發明發掘了吳茱萸總生物堿新的藥用前景，開拓了一個新的藥用領域； 2、本發明的吳茱萸總生物堿采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長期服藥無危害； 3、本發明吳茱萸總生物堿的原藥資源非常豐富，具有良好的社會和經濟效益； 4、本發明的吳茱萸總生物堿對肝纖維化的療效確切； 5、本發明為將吳茱萸總生物堿進一步開發成新藥提供了強有力的基礎。
四

附圖所示是受試大鼠肝組織切片光鏡圖，其中 圖1是對照組(正常組)HE染色10×10倍。
圖2是模型組HE染色10×10倍。
圖3是吳茱萸總生物堿100mg·kg-1HE染色10×10倍。
圖4是吳茱萸總生物堿50mg·kg-1HE染色10×10倍。
圖5是陽性藥組HE染色10×10倍。
五具體實施例方式 以下結合實施例對本發明作進一步地描述。
(一)吳茱萸總生物堿的制備 取吳茱萸生藥6kg，用酸性乙醇回流提取4次，每次1.5h，提取液合并，回收部分乙醇后調整pH至2上陽離子樹脂柱，水洗后收集80％乙醇洗脫部分，回收乙醇，減壓濃縮，干燥即得吳茱萸總生物堿。以總生物堿計，生物堿含量為20～60％。
(二)動物實驗 實驗結果如下 1、實驗目的 采用體積分數比為40％CCl4色拉油溶液給予大鼠背部或四肢下注射制備肝纖維化模型，測試吳茱萸總堿對肝纖維化的治療作用。
2、受試藥物 名稱吳茱萸總堿 來源安徽省藥物研究所 純度總生物堿含量＞50％ 批號20090121 溶液用5‰CMC-Na溶液混懸溶解。
3、陽性對照藥 名稱復方鱉甲軟肝片 來源內蒙古福瑞蒙藥科技股份有限公司 批號20080604 規格0.5g/粒 4、實驗動物 品系SD大鼠 體重180±20g 性別雌性 來源安徽醫科大學實驗動物中心 動物合格證號皖醫實動準第01號 每組動物數12只 5、實驗試劑 CCl4溶液分析純，純度≥99.5％，廣東汕頭西隴化工廠有限公司 AST、ALT試劑盒長春匯力生物技術有限公司 LN、HA和、PCIII放免試劑盒北京華英生物技術研究所 6、實驗方法 實驗設吳茱萸總生物堿大、小劑量組(100、50mg·kg-1)，模型組，復方鱉甲軟肝片組(600mg顆粒·kg-1)和對照組。
采用體積分數比為40％CCl4色拉油溶液給予大鼠背部或四肢下注射制備肝纖維化模型，3ml·kg-1(首次劑量加倍)，一周2次，連續12周；正常組，皮下注射等量色拉油；陽性藥和受試藥均用5‰CMC-Na溶液混懸溶解，每天灌胃給藥1次，連續10周。正常組和模型組給予等量5‰CMC-Na溶液。
實驗12周末(給藥10周)，3.2％水合氯醛(1ml·100g-1)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，以3500r·min-1離心10min，取上清液按試劑盒說明測定血清肝功能生化指標AST和ALT活性(賴氏法)；肝纖維化指標HA、LN、PC-III放免法測定。處死大鼠，稱肝、脾濕重，計算肝、脾重指數。肉眼觀察大鼠肝臟情況并評分，取部分右葉肝臟以福爾馬林浸泡，常規脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。
7、實驗結果 (1)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠肝重、脾重指數的影 給藥12周模型組大鼠體重明顯低于正常組，肝重指數顯著高于正常組，脾重指數與正常組無統計學差異；吳茱萸總生物堿100mg·kg-1組大鼠體重增長略快于模型組，肝重指數明顯低于模型組(見表1)。
表1吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠肝重、脾重指數的影響
(2)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠肝功能的影響 CCl4造模期間，模型組大鼠血清ALT和AST顯著高于正常組(P＜0.01)，提示造模成功；給藥2～10周期間，吳茱萸總生物堿高劑量組ALT呈進行性下降(P＜0.05～0.01)，吳茱萸低劑量組和陽性藥組于給藥10周后ALT和AST均明顯下降(見表2、3)。
表2吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清ALT的影響
表3吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清AST的影響
(3)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清中LN、HA和PCIII的影響 采用CCl4造模12周后，模型組大鼠血清PCIII、HA和LN均顯著高于正常組(p＜0.01)，提示肝組織中ECM大量沉積，TAE 50、100mg·kg-1組和陽性藥組上述三指標均明顯下降(見表4)。
表4吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清中LN、HA和PCIII的影響

(4)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠病理組織學的影響 肉眼觀察到正常組大鼠肝臟表面光滑，色澤鮮紅；模型組大鼠肝臟顏色暗淡、偏黃，甚至肝臟表面呈顆粒狀或細小結節狀，肉眼觀察平均分為2.8分，吳茱萸總生物堿高劑量組大鼠肝臟肉眼觀察病變情況輕于模型組，平均分為1.8分，各組大鼠肝臟肉眼觀察評分見表5。
表5吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠病理組織學的影響
評分標準0分表面光滑，色澤鮮紅；1分肝臟表面光滑，色澤淡紅； 2分肝臟表面光滑，黃色； 3分肝臟表面尚光滑，觀之呈顆粒狀，色澤黃； 4分肝臟表面不光滑，有細小結節，色澤黃。
光鏡觀察顯示正常組大鼠肝小葉結構完整，匯管區結構正常，肝竇明顯，肝細胞呈索狀分布，排列整齊，體積正常，無脂肪變性壞死，無炎癥細胞浸潤。如圖1所示。模型組肝小葉結構紊亂，肝細胞呈腫脹空泡樣脂肪變性，匯管區有炎癥細胞浸潤，膠原纖維沿匯管區及中央靜脈周圍向肝小葉內延伸，交聯呈網狀結構，部分大鼠形成完整的假小葉。如圖2所示。吳茱萸高劑量組大鼠肝小葉結構明顯改善，膠原纖維間隔減少，肝細胞壞死、炎性細胞浸潤少見，匯管區結締組織增生減輕。如圖3所示。吳茱萸低劑量組和陽性藥組肝組織灶性破壞，肝細胞變性、肝纖維化較模型組也減輕。如圖4所示。說明吳茱萸總生物堿能有效的緩解CCl4誘導的大鼠肝纖維化。總體效果優于陽性藥組。
(三)吳茱萸總生物堿制劑加工 吳茱萸總堿片劑的制備 實施例一 吳茱萸總堿100mg 淀粉100mg 淀粉漿(10％)適量 硬脂酸鎂1％ 工藝 將主藥和輔料混勻，以10％淀粉漿制粒、干燥、整粒，加入硬脂酸鎂混勻，壓片即得。
實施例二1000片 吳茱萸總堿100g 淀粉100g 淀粉漿(10％)適量 硬脂酸鎂1％ 工藝同上。
權利要求
1.一種吳茱萸總生物堿新的醫藥用途，其特征在于吳茱萸總生物堿在制備抗肝纖維化藥物中的應用。
全文摘要
一種吳茱萸總生物堿新的醫藥用途，即吳茱萸總生物堿在制備預防和治療肝纖維化藥物中的應用。吳茱萸總生物堿是自吳茱萸中提取、分離得到的吲哚喹啉類和喹諾酮類生物堿的總稱，總生物堿含量20～60％。本發明在大鼠四氯化碳誘導肝纖維化的治療作用實驗中顯示出一定的治療作用，有較好的臨床應用前景。說明吳茱萸總生物堿具有確切的抗肝纖維化作用，可與輔料結合制備抗肝纖維化藥物。
文檔編號A61K36/754GK101829218SQ201010171738
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月6日 優先權日2010年5月6日
發明者張毅, 楊冬梅, 李莉, 陳師農, 馬玲, 錢利武 申請人:安徽省藥物研究所