專利名稱：破傷風外毒素c片段的b細胞表位肽的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥生物技術領域，尤其涉及破傷風外毒素C片段的B表位肽的應用。
技術背景 破傷風外毒素(tetanus toxin,TT)是破傷風梭菌感染傷口后，在缺氧的條件下分 泌產生的一種神經毒素，可導致患者因喉痙攣或繼發嚴重的肺部感染而死亡，死亡率可高 達20 % 50 %。全世界每年約有5萬人死于破傷風，我國的破傷風死亡率高于世界平均水 平。抗生素不能清除破傷風外毒素的毒性作用，具有中和毒素作用的抗破傷風毒素的抗體 和疫苗是首選治療藥物。破傷風外毒素蛋白分子量為150kDa。毒素經菌體釋放后，在蛋白水解酶的作用下， 被“裂解”成一條輕鏈(50kDa)和一條重鏈(IOOkDa)，但輕鏈和重鏈之間仍有二硫鍵相連。 輕鏈是鋅依賴蛋白酶，通過水解突觸囊泡蛋白_2來阻斷神經抑制性介質的釋放。C蛋白是 重鏈的一部分，分子質量為50kDa，不具備神經毒素的活性，卻保留了完整毒素與神經節苷 脂結合等許多性質，是毒素的保護性抗原。C蛋白還能將小分子蛋白靶向傳遞到運動神經 元，所以也可作為蛋白載體促進低免疫原性抗原的免疫反應。由于C蛋白是破傷風毒素的 非毒性片段，且有較高的免疫原性，因此是制備破傷風疫苗和篩選抗破傷風中和性單克隆 抗體的一個理想靶標。鑒于以上研究背景本發明預測并合成了破傷風外毒素C片段的B細胞表位，并對 預測的B細胞表位的免疫原性和免疫保護性進行了鑒定，本發明的B細胞表位肽可用于破 傷風梭菌感染的肽疫苗研究和利用B細胞表位肽制備特異的單克隆抗體診斷、預防和治療 破傷風梭菌的感染。
發明內容
本發明的目的在于提供一種來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的應用，其 中之一為來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽在制備預防、診斷或治療破傷風梭菌感 染的藥物中的應用，其中所述破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1-4所示(其核苷酸序列分別如SEQ IDNO :5_8所示)。上述的來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽還可以用于制備抗破傷風毒素單 克隆抗體。本發明的另一目的是提供用于制備預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的藥物，其 包含至少一個來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽，和藥學上可接受的載體，其中所述 破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQID NO :1_4所示。所述藥學上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、 吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體中的至少一種。本發明還提供一種預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的疫苗，其包含至少一個來 自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽，其中所述破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:l-4所示。本發明的思路如下首先基于破傷風外毒素與配體相互作用的晶體結構，按B細 胞表位的預測原則，對破傷風外毒素C片段的氨基酸序列進行分析，預測毒素片段的B細胞 表位，并采用DNAStar軟件分析評價，人工合成B表位肽，用合成的B細胞表位肽偶聯載體 蛋白鑰孔戚血藍素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)后免疫Balb/c小鼠，檢測抗體效價 鑒定其免疫原性；Western blot鑒定鼠抗血清的特異性，并以天然破傷風外毒素攻毒，鑒定 B細胞表位肽的免疫保護性，結果顯示P4B細胞表位肽能刺激機體產生較強的抗破傷風外 毒素的中和抗體，該肽段位于破傷風外毒素C片段N端第312 326位氨基酸。本發明的B 表位肽可以用來研制人或小鼠用的破傷風肽疫苗，可以用來開發預防或治療破傷風梭菌感 染的多肽藥物。 本發明經過深入而廣泛的研究，基于破傷風外毒素蛋白的晶體結構，輔以DNAStar 軟件分析，選擇性的合成了 4條可能誘導機體產生體液免疫應答的B細胞表位肽，并對其免 疫特性進行評價，發現此4條表位肽能夠在Balb/c小鼠體內誘導特異性的體液免疫應答， 產生的抗血清均能與破傷風外毒素蛋白發生特異性結合。因此，此四條多肽可以用于破傷 風梭菌的多表位肽疫苗的設計；本發明的4條多肽可以用于人及動物用的疫苗及抗體藥物 的開發。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。
圖1表示免疫印跡鑒定鼠抗血清的特異性，其中1表示PlB表位肽鼠抗血清的免疫印跡2表示P2B表位肽鼠抗血清的免疫印跡3表示P3B表位肽鼠抗血清的免疫印跡4表示P4B表位肽鼠抗血清的免疫印跡。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解的是，這些實施例僅用于說明本 發明而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明制備方法的簡單改進，及對 本發明表位肽及其核苷酸序列的利用都屬于本發明要求保護的范圍。實施例IB表位的篩選鑒定1.表位肽的預測及合成在NCBI的結構數據庫檢索破傷風外毒素與配體神經節苷脂晶體結構解析圖 (MMDB ID 75338)，網址:http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/mmdb/mmdbsrv. cgi ？ Uid = 75338)。基于Stx2與配體神經節苷脂相互作用的立體結構，依據暴露在蛋白質表面、 含伸展區和無規則卷曲或β轉角、以及肽段長度約10 20個氨基酸等B表位肽的預測原 貝1J，選取破傷風外毒素毒性片段上的氨基酸肽段，采用DNAStar軟件對預測的氨基酸肽段 進行親水(Kyte-Doolittle方案)、表面可及性(Emini方案)、可塑性(Karplus-Schulz方 案)、二級結構(Garnier和Chou-Fasman方案)及抗原性(Jameson-Wolf方案)等參數進行評價，如果某肽段中，抗原指數> 1、親水性指數> O、氨基酸的表面可能性指數> 1，同時 其內部或附近又具有柔性結構，則這一區段為抗原表位的可能性較大。通過BLAST檢索比 較預測的B細胞表位肽與人、兔、鼠的同源性后，最終確定本研究所用的4條可能的B細胞 表位肽序列，人工合成4條可能的B表位多肽(由北京中科亞光公司協助合成，4條B細胞 表位肽的基本信息見表1)，并分別偶聯載體蛋白KLH。表1預測合成后的破傷風外毒素C片段的B表位的基本信息 (其核苷酸序列分別如SEQID NO :5_8所示)2.破傷風外毒素B細胞表位肽的鑒定2. 1 免疫 Balb/c 小鼠8周齡Balb/c小鼠，，隨機分成5組，每組10只，雌雄各半，分別用偶聯KLH的4條 B細胞表位肽(Pl-KLH、P2-KLH、P3-KLH、P4-KLH)加完全福氏佐劑皮下多點注射免疫，每只 注射0. 5ml，含抗原肽100 μ g，免疫時間為0、2、4、6、8周，共5次，第1次加入福氏完全佐劑 第2 4次加福氏不完全佐劑，最后一次不加佐劑同樣劑量腹腔注射免疫一次，第2、3、4、5 次免疫后7d取尾血，采用間接ELISA法檢測免疫Balb/c小鼠血清效價，對照組PBS替代多 肽進行免疫，免疫方法及程序相同。2. 2ELISA檢測血清效價間接ELISA的包被抗原分別為未偶聯KLH的4條多肽和破傷風外毒素C片段。具 體方法如下包被用包被液將抗原稀釋為2 μ g/ml，加入酶標板，100 μ 1/孔，4°C過夜，PBS洗 滌5遍，空干；封閉加BSA封閉液300 μ 1/孔，4°C過夜，洗滌5遍，空干，密封4°C保存
備用；鼠血清稀釋按1 100，1 200,1 400......進行系列倍比稀釋至第10管；取
包被好的酶標板，加入依次稀釋血清100 μ 1/孔，37°C水浴30分鐘，洗滌5遍，空干；加辣根 過氧化物酶標記的羊抗鼠gG抗體工作液(1 20000稀釋)100 μ 1/孔，37°C水浴30分鐘， 洗滌4遍，空干；加底物顯色液100 μ 1/孔，室溫避光反應5 10分鐘；加終止液100 μ 1/ 孔，立即在酶標儀上以492nm波長測定OD值；結果判斷0D值大于或等于陰性對照(小鼠 免疫前血清1 100倍稀釋)的2.1倍為抗體陽性。呈抗體陽性的最大稀釋倍數即為抗體 效價。表2B細胞表位肽免疫鼠血清效價 抗破傷風外毒素C片段B表位肽血清的特異性取已處理的破傷風外毒素C片段，并設定蛋白質分子量標準，在5%濃縮膠，12% 分離膠上進行垂直SDS-PAGE，80V，30分鐘，調整電壓為150V，約1. 5小時。電泳結束后，取 下凝膠，一塊用考馬斯亮藍R-250染液快速染色，另一塊置于硝酸纖維素膜上，15V恒壓電 轉移過夜。轉移后的硝酸纖維素膜在麗春紅S中染色1分鐘，標記蛋白質分子標準，再用蒸 餾水脫去紅色。將轉移膜置于封閉液(TTBS)中，37°C，150rpm，輕輕振搖封閉60分鐘棄去 封閉液，用洗滌液(TTBS)漂洗膜4次，每次10 15分鐘。加入以洗滌液1 1000稀釋 的鼠抗破傷風外毒素C片段B表位肽抗血清，370C，150rpm,輕輕振搖反應60分鐘。TBS漂 洗膜4次，每次10 15分鐘。加入以TBS稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG(l 10000), 150rpm,輕輕振搖反應60分鐘。TBS漂洗4次，每次10 15分鐘。加入DAB顯色液，輕搖 至顯色，蒸餾水漂洗終止反應。結果間接ELISA結果顯示4條合成多肽均能分別刺激Balb/c小鼠產生抗特異多 肽和破傷風外毒素C片段的抗體，鼠血清抗體與多肽和破傷風外毒素C片段反應的效價如 表2所示，而免疫前的鼠血清與PBS免疫對照組血清檢測為陰性，此結果表明本發明的4條 多肽具有較好的免疫原性和反應原性，為B細胞表位肽。免疫印跡結果如圖1所示4條B 細胞表位肽刺激Balb/c小鼠產生的抗體均有很好的特異性，均能與破傷風外毒素C片段特 異反應。實施例2免疫小鼠攻毒試驗初步篩選保護性B細胞表位肽上述免疫小鼠末次免疫10天后每只小鼠腹腔注射致死劑量(LDltltl, 1 μ g/kg)的天 然破傷風外毒素，觀察5天內各組小鼠的存活率。對照組PBS替代多肽進行免疫和攻毒，方 法及程序相同。天然破傷風外毒素攻毒保護試驗結果顯示小鼠腹腔注入1 μ g/kg(LD100)劑量天 然破傷風外毒素后，各組小鼠均先后出現了較重的中毒癥狀，表現為皮毛蓬松皺摺、攝食減 少、全身痙攣。尤其以對照組、P1、P2、P3的小鼠中毒癥狀出現快(24h 72h)，且呈進行性 加重直至死亡，而P4組的小鼠中毒癥狀出現相對較慢(96h)，癥狀出現后有部分小鼠能夠 逐漸恢復。各組小鼠具體的存活與死亡情況表3所示表3小鼠免疫后攻毒的保護效果觀察 P < 0. Olvs PBS ；P > 0. 05vs PBS由表3可見，PBS對照組小鼠攻毒后48h內全部死亡，而P1、P2、P3、P4抗原免疫組 的小鼠能夠不同程度的耐受LDltltl的天然破傷風外毒素攻擊而得以存活，5天后的存活率分 別為、20%、10%、10%、70%，經χ 2檢驗分析P4組與PBS對照組有顯著性差異(P < 0. 01)， PU P2、P3免疫組和PBS對照組無顯著性差異(P > 0. 05)，說明單一的P4B細胞表位肽能 夠刺激機體產生中和破傷風毒素的抗體，具有較強的免疫保護作用，而單一的P2、P3、P4B 細胞表位肽保護效率差，但不能排除P2、P3、P4B細胞表位肽聯合應用時會產生免疫保護作 用。此結果為利用B細胞表位肽制備破傷風外毒素中和性單克隆抗體和破傷風外毒素肽疫 苗的候選組分提供了有力的實驗依據。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120>破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的應用<130>10P99065-CN<160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>16<212>PRT<213>破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>1lie Asn Asn Asp lie lie Ser Asp lie Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val151015<210>2<211>12<212>PRT<213>破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>2Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln lie Thr Phe Arg1510<210>3<211>10<212>PRT
<213>破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>3Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr1510<210>4<211>15<212>PRT<213>破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列<400>4lie lie Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu lie Asp Ser Phe Val151015<210>5<211>48<212>DNA<213>編碼破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>5attaataatg atattatatc agatatatct gggtttaatt catctgta48<210>6<211>36<212>DNA<213>編碼破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>6gattccgcgg gagaagttag acaaataact tttagg36<210>7<211>30<212>DNA<213>編碼破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>7ggaaaccctt tacgatatga tacagaatal30<210>8<211>45<212>DNA<213>編碼破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的核苷酸序列<400>8attataaaaa gatatacacc taataatgaa atagattctt ttgtt4權利要求
一種來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽在制備預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的制劑中的應用，其中所述破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1-4所示。
2.根據權利1所述的應用，其特征在于，所述制劑為抗破傷風毒素單克隆抗體。
3.一種預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的藥物，其特征在于包含至少一個來自破傷 風外毒素C片段的B細胞表位肽，和藥學上可接受的載體，其中所述破傷風外毒素C片段的 B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。
4.根據權利要求3所述的預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的藥物，其特征在于，所述 藥學上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表 面活性劑、吸附載體中的至少一種。
5.一種預防、診斷或治療破傷風梭菌感染的疫苗，其特征在于包含至少一個來自破傷 風外毒素C片段的B細胞表位肽，其中所述破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸 序列如SEQ ID NO 1-4所示。
全文摘要
本發明涉及來自破傷風外毒素(Tetanus toxion，TT)C片段的B細胞表位肽的應用，來自破傷風外毒素C片段的B細胞表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNO1-4所示，其可用于制備預防或治療破傷風梭菌感染的藥物，或制備抗破傷風毒素單克隆抗體。本發明還提供預防或治療破傷風梭菌感染的藥物和預防或治療破傷風梭菌感染的疫苗。
文檔編號A61K38/08GK101837117SQ201010197830
公開日2010年9月22日 申請日期2010年6月11日 優先權日2010年6月11日
發明者余抒, 劉唯, 張衛軍, 羅萍, 趙 卓, 鄒全明, 陳立, 顧江 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學