艱難梭菌外毒素a羧基端序列密碼子優化基因片段、表達載體構建方法及其表達蛋白的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及密碼子改造的艱難梭菌外毒素A羧基端基因片段、表達載體構建方法及其在大腸桿菌中的高效表達。該密碼子改造后的基因序列既兼顧大腸桿菌密碼子使用偏好，又降低了原始基因重復序列對于基因合成和表達的影響。本研究所涉及的高效表達載體由密碼子改造后的艱難梭菌外毒素A羧基端基因與原核表達載體pET32b(+)組成，經IPTG誘導后可以高表達出帶His標簽的融合蛋白。該融合蛋白經凝血酶酶切后可以釋放艱難梭菌外毒素A羧基端約872個氨基酸片段。本研究中經密碼子改造的艱難梭菌外毒素A羧基端基因片段可以大腸桿菌中高效融合表達，純化后的蛋白作為抗原可用于制備抗艱難梭菌外毒素A抗體和抗艱難梭菌感染疫苗的制備。
【專利說明】艱難梭菌外毒素A羧基端序列密碼子優化基因片段、表達載體構建方法及其表達蛋白的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，涉及密碼子改造的艱難梭菌外毒素A羧基端基因片段、表達載體構建方法及其在大腸桿菌中的高效表達方法。
【背景技術】
[0002]艱難梭菌是一種革蘭氏陽性、產芽孢、專性厭氧的梭狀桿菌，是目前醫院內感染的主要致病因素。艱難梭菌的感染是接觸性傳播，可通過口 -糞途徑定植在結腸，并可通過與患者、被污染設備或物品(例如便盆、澡盆和電子直腸溫度計)直接接觸，醫護人員間接接觸，經過幾天到8周的潛伏期，引起醫院內艱難梭菌感染暴發。艱難梭菌治療的難點在于作為休眠形式的芽孢可以耐受多種消毒劑，使其可以在醫院環境中長期存在，因而一旦醫院發生艱難梭菌感染暴發，難以在短時間內根除。
[0003]艱難梭菌毒性主要源于其表達的兩種外毒素，毒素A和毒素B。這兩種毒素都屬于糖基轉移酶類，可以使Rho蛋白家族的GTP酶失活。毒素A既是一種腸毒素又是一種細胞毒素，是艱難梭菌的主要毒力因子。研究表明，毒素A通過其羧基端與靶細胞表面受體結合來發揮毒性作用。已有研究證明抗艱難梭菌毒素A羧基端的抗體可以有效的中和其腸毒性和細胞毒性，從而對艱難梭菌的治療起到積極作用。所以，艱難梭菌外毒素A羧基端是抗體開發的理想靶標，而通過合適的方法獲得外毒素A羧基端片段是制備及檢測其抗體的基礎。
[0004]CN 101870978A中公開了一種即可在大腸桿菌中表達又可在哺乳動物中表達的密碼子優化后的艱難梭菌毒素A羧基端序列，由于其兼顧性，存在原核表達系統與真核表達系統在密碼自偏愛性方面的差異，其在大腸桿菌中的表達效率并不是很高。
【發明內容】
[0005]本發明提供一種可在大腸桿菌等原核系統中高效表達的艱難梭菌外毒素A羧基端基因片段，以及表達后的蛋白作為抗原在制備抗艱難梭菌外毒素A抗體和抗艱難梭菌感染疫苗中的應用。
[0006]本發明提供一種優化多重復區基因的方法，即以每個獨立重復區的保守序列為模塊進行多種密碼子優化，再將優化后的模塊進行組合得到多種重復性低且適于相應表達系統的新基因序列。
[0007]本發明還提供一種新的重組載體構建方法，運用多片段連接體系，即目的片段分兩段或多段合成，后與載體同時連接的策略構建重組載體。
[0008]為實現上述目的，本發明提供了一種密碼子優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列，其是將艱難梭菌外毒素A原始序列重復區中保守氨基酸序列(conservative aasequence, CAS)的密碼子優化為大腸桿菌中使用頻率高的兼并性密碼子，優化后的基因序列可在大腸桿菌中表達，而氨基酸序列不變。不同保守區的多種密碼子優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因重復序列的DNA序列(表2)，根據同源性分析選取的11個保守氨基酸序列命名為CAS1-11，其中，CASl密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.1_5中的任一種序列，CAS2密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7，CAS3密碼子優化后的核苷酸序列選自SE QID N0.8或SEQ ID N0.9，CAS4密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.10或SEQ ID N0.11，CAS5密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.12或SEQ ID N0.13，CAS6密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.15，CAS7密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.16或SEQ ID N0.17，CAS8密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQID N0.18或SEQ ID N0.19，CAS9密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ IDN0.20-24中的任一種序列，CASlO密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.25或SEQ IDN0.26，CASll密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.27或SEQ ID N0.28。由這些不同保守區的多種優化的重復序列可相互組合拼接成適合在大腸桿菌中表達的的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列。其中隨機選取其中的三種優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列分別為:第一種優化組合具有SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列、第二種優化組合具有SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列，第三種優化組合具有SEQ ID N0.31所示的核苷酸序列。本發明設計合成了既符合大腸桿菌密碼子偏愛性的毒素A羧基端核苷酸序列，同時通過同義密碼子替換改善了原始序列多重復區對化學基因合成的影響，降低了合成成本；并且優化是在保證艱難梭菌外毒素A羧基端氨基酸序列不變的情況下，通過密碼子改變對羧基端基因重復序列進行調整，充分考慮大腸桿菌密碼子利用偏好進行基因序列優化，所獲得的艱難梭菌外毒素A羧基端基因片段可在大腸桿菌原核系統中高效表達。
[0009]本發明還提供了上述經優化后的基因片段表達的蛋白及其在制備抗艱難梭菌外毒素A抗體和抗艱難梭菌感染疫苗中的應用。
[0010]本發明還提供了一種優化多重復區基因序列的方法，包括以每個獨立重復區的保守序列為模塊進行多種適應于表達系統的密碼子優化，優化后的氨基酸序列不變，再將優化后的模塊進行組合 得到多種重復性低且適于表達的新基因序列。其中重復區基因序列可為艱難梭菌外毒素A羧基端基因重復序列。所述表達系統為大腸桿菌表達系統。
[0011]本發明進一步提供了一種重組表達載體的構建方法，包括如下步驟:
[0012]A)將待表達的基因分成多段合成，一種優化的方案是分成兩段合成，每段基因兩端設計合適酶切位點；
[0013]B)通過PCR或限制性內切酶消化的方法獲得與待表達的基因連接有對應酶切位點的載體。
[0014]C)將步驟A中獲得的基因片段及步驟B獲得的載體分別酶切回收后，在DNA連接酶作用下進行連接，獲得含待表達基因的重組載體。
[0015]上述重組表達載體的構建方法中，基因片段可人工合成或用其他方法獲得。
[0016]其中待表達的基因可為艱難梭菌外毒素A竣基端基因序列或其優化后的基因序列。
[0017]本發明創新的運用了多片段同時連接的策略，優選兩片段連接，獲得了高表達毒素A羧基端融合蛋白的重組質粒及工程菌；其所表達的毒素A羧基端蛋白具有凝血作用及腸毒性，與毒素A蛋白的功能一致。【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1艱難梭菌毒素A羧基端重復區示意圖；
[0019]圖2艱難梭菌毒素A羧基端重復區氨基酸序列同源性分析；
[0020]圖3三片段連接過程及重組質粒圖譜；
[0021 ] 圖4表達載體轉化子質粒電泳結果；
[0022]圖5表達載體轉化子質粒XhoI單酶切電泳結果；
[0023]圖6表達載體轉化子質粒XhoI與EcoRV雙酶切電泳結果；
[0024]圖7表達載體轉化子質粒XhoI與XbaI雙酶切電泳結果；
[0025]圖8表達載體轉化子質粒EcoRI與XbaI雙酶切電泳結果；
[0026]圖9艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白誘導表達SDS-PAGE電泳結果圖，其中，M:TAKARA蛋白質分子標準(低)，1:誘導前菌體樣本，2:3h誘導菌體樣本，3:8h誘導菌體樣本；
[0027]圖10毒素A羧基端融合蛋白純化電泳結果圖，其中樣品采用NTA梯度洗脫；
[0028]圖11毒素A羧基端融合蛋白純化后超濾濃縮電泳結果圖，其中，M、Takara分子量標準(低)；A、純化后毒素A融合蛋白；
[0029]圖12(His)6標簽與毒素A羧基端融合蛋白經凝血酶酶切后電泳結果圖，其中，M、Takara分子量標準(低)；A、凝血酶 酶切后毒素A蛋白；
[0030]圖13艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白(毒素A-DE3-1)凝血活性測定結果圖；圖中數字分別表示:1、空白對照；2、0.05 μ g ;3、0.I μ g ;4、0.2 μ g ;5、0.3 μ g ;6、0.4 μ g ;7、0.5 μ g ;8、0.6 μ g ；
[0031]圖14艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2凝血活性測定結果圖；圖中數字分別表示:1、空白對照;2、0.05μ g ；3,0.lug ；4,0.15 μ g ;5、0.2 μ g ;6、0.25 μ g ；7,
0.3 μ g ;8、0.35 μ g ;9、0.4 μ g ;10、0.5 μ g ;
[0032]圖15艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3凝血活性測定結果圖，圖中數字分別表示:1、空白對照;2、0.05 μ g ;3、0.Iyg ;4、0.15 μ g ;5、0.2μ g ;6、0.25 μ g ;7、
0.3 μ g ;8、0.35 μ g ;9、0.4 μ g ;10、0.5 μ g ;
[0033]圖16艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-1注射給藥腸毒性實驗測定結果圖；
[0034]圖17艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2注射給藥腸毒性實驗測定結果圖；
[0035]圖18艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3注射給藥腸毒性實驗測定結果圖；
[0036]圖19免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-1后小鼠血清中抗體產生情況圖；
[0037]圖20免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2后小鼠血清中抗體產生情況圖；
[0038]圖21免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3后小鼠血清中抗體產生情況圖。
【具體實施方式】
[0039]本發明通過分段合成密碼子優化后的艱難梭菌外毒素A羧基端基因片段，經分子克隆技術構建重組表達質粒pET32b(+)-TcdA-C。重組質粒轉化表達宿主BL21(DE3)菌株后可被IPTG誘導表達，融合蛋白經相關鑒定為目的蛋白。另經凝血酶酶切后，可以釋放完整的艱難梭菌外毒素A羧基端蛋白，凝集試驗表明該方法表達的毒素A羧基端蛋白有凝集活性。
[0040]下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。
[0041]實施例1密碼子優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列設計
[0042]選取艱難梭菌外毒素A基因羧基端2616個堿基序列(共編碼872個氨基酸)，分析該編碼序列，找出影響基因合成的重復序列，重復區示意圖見圖1。同時分析該序列與大腸桿菌密碼子使用偏好不同的位點，用高頻密碼子替換低頻密碼子；另外，在兼顧大腸桿菌密碼子偏好的基礎上，用高頻或中頻密碼子對重復區內的序列進行同義密碼子替換，獲得新的優化后的密碼基因序列。
[0043]密碼子改造的方法包括以下方面，即根據對重復區氨基酸序列的同源性分析(見圖2),找出了同源性相近的保守氨基酸序列(conservative aa sequence, CAS),對這些保守氨基酸序列進行不同種類的同義密碼子替換從而形成多種新核酸模塊，這些核酸模塊在不改變氨基酸序列的前提下可以置于不同的相關重復區內，均不影響艱難梭菌毒素A羧基端基因的轉錄與翻譯。例如，重復區R4與R9的氨基酸序列完全相同，故優化后的R4與R9序列位置可以互換；重復區R5與R15僅有一個氨基酸的差異，兩個保守序列也可以有多種組合，并且保證氨基酸序列不發生改變。也就是說，針對保守區氨基酸序列優化得到的新核酸模塊的位置可以在含相關CAS的不同的重復區內進行互換，在保證氨基酸序列不發生改變的前提下可以形成多種新的基因序列，這些新序列均可用來在體外表達艱難梭菌毒素A羧基端蛋白。表1顯示同源性相近的重復區內的保守序列:
[0044]表1:艱難梭菌外毒素A羧基端重復區及相關保守序列
[0045]
【權利要求】
1.一種密碼子優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列，其是將艱難梭菌外毒素A原始序列重復區中保守氨基酸序列(conservative aa sequence, CAS)的密碼子優化為大腸桿菌中使用頻率高的兼并性密碼子，優化后的基因序列可在大腸桿菌中表達，而氨基酸序列不變。
2.根據權利要求1所述的密碼子優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列，根據同源性分析選取的11個保守氨基酸序列命名為CAS1-11，其中，CASl密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.1-5中的任一種序列，CAS2密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7，CAS3密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.8或SEQ ID N0.9，CAS4密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.10或SEQ ID N0.11，CAS5密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.12或SEQ ID N0.13，CAS6密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQID N0.14或SEQ ID N0.15，CAS7密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.16或SEQ IDN0.17，CAS8密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.18或SEQ ID N0.19，CAS9密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.20-24中的任一種序列，CASlO密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ ID N0.25或SEQID N0.26，CASll密碼子優化后的核苷酸序列選自SEQ IDN0.27 或 SEQ ID N0.28。
3.根據權利要求2所述的密碼子優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列，其具有SEQID N0.29、SEQ ID N0.30 或 SEQ ID N0.31 所示的核苷酸序列。
4.權利要求1-3任一項所述的艱難梭菌外毒素A羧基端基因編碼的蛋白在制備抗艱難梭菌外毒素A抗體中的應用。
5.權利要求1-3任一項所述的艱難梭菌外毒素A羧基端基因編碼的蛋白在制備抗艱難梭菌感染疫苗中的應用。
6.一種優化多重復區基因序列的方法，包括以每個獨立重復區的保守序列為模塊進行多種適應于表達系統的密碼子優化，優化后的氨基酸序列不變，再將優化后的模塊進行組合得到多種重復性低且適于表達的新基因序列。`
7.根據權利要求6所述的方法，所述多重復區基因序列為艱難梭菌外毒素A羧基端基因重復序列。
8.根據權利要求6所述的方法,所述表達系統為大腸桿菌表達系統。
9.一種重組表達載體的構建方法，包括如下步驟: A)將待表達的基因分成多段獲得，優選兩段，每段基因兩端設計合適酶切位點； B)通過PCR或限制性內切酶酶消化的方法獲得與待表達的基因有對應酶切位點的載體。 C)將步驟A中獲得的基因片段及步驟B獲得的載體分別酶切回收后，在DNA連接酶作用下進行連接，獲得含有待表達基因的重組載體。
10.根據權利要求9所述的方法，所述基因片段可人工合成或用其他方法獲得。
11.根據權利要求9所述的方法，其中待表達的基因為密碼子優化的艱難梭菌外毒素A竣基端基因序列。
12.根據權利要求11所述的方法，其中待表達的基因為選自權利要求1-3所述的密碼子優化的艱難梭菌外毒素A羧基端基因序列。
【文檔編號】C12N15/70GK103865938SQ201210568057
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月16日 優先權日:2012年12月16日
【發明者】劉紅, 馮東曉, 邢平平, 徐從倫, 李敏, 郭桂平, 于錦麗, 趙志偉 申請人:山東國際生物科技園發展有限公司